Name: measurement of 3-dimensional camp distributions in living cells using 4-dimensional (x, y, z, and &lambda;) hyperspectral fret imaging and analysis
Uploaded: 2020-10-27T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional x, y, z, and Î» Hyperspectral FRET Imaging and Analysis at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить доктора Кейса Джалинка (Нидерландский институт рака и Центр передовой микроскопии ван Левенгука, Амстердам, Нидерланды) за предоставление нам биосенсора H188 cAMP FRET и Кенни Тринха (Инженерный колледж Университета Южной Алабамы) за техническую помощь в сокращении времени, занимаемого для запуска наших специально разработанных программных сценариев.
Авторы хотели бы отметить источники финансирования: Американская кардиологическая ассоциация (16PRE27130004), Национальный научный фонд; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

Этот протокол следует процедурам, утвержденным Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Университетом Южной Алабамы.
1. Подготовка клеток, образцов и реагентов к визуализации
<ol><li>Выделяют легочные микрососудистые эндотелиальные клетки к?...

<ol>
	<li>Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+of+adenosine+3':5'-monophosphate+and+adenosine+3':5'-monophosphate-dependent+protein+kinase+in+heart+tissue.">Compartmentalization of adenosine 3':5'-monophosphate and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue.</a> The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).</li><li>Terrin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGE1+stimulation+of+HEK293+cells+generates+multiple+contiguous+domains+with+different+[cAMP]:+role+of+compartmentalized+phosphodiesterases.">PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases.</a> The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).</li><li>Bacskai, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+resolved+dynamics+of+cAMP+and+protein+kinase+A+subunits+in+Aplysia+sensory+neurons.">Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons.</a> Science. 260, 222-226 (1993).</li><li>Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+aspects+of+cAMP+signalling+in+cardiac+myocytes.">Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes.</a> Clinical and Experimental Pharmacology &amp; Physiology. 35, 1343-1348 (2008).</li><li>Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+compartmentation+of+cyclic+AMP+and+protein+kinase+in+heart.">Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart.</a> Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).</li><li>Hohl, C. M., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentation+of+cAMP+in+adult+canine+ventricular+myocytes.+Relation+to+single-cell+free+Ca2++transients.">Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients.</a> Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).</li><li>Rich, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+uniform+extracellular+stimulus+triggers+distinct+cAMP+signals+in+different+compartments+of+a+simple+cell.">A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).</li><li>Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+adenylyl+cyclase+reveals+the+significance+of+cAMP+compartmentation+on+pulmonary+microvascular+endothelial+cell+barrier.">Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier.</a> Circulation Research. 98, 675-681 (2006).</li><li>Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+assessment+of+local+phosphodiesterase+activity+using+tailored+cyclic+nucleotide-gated+channels+as+cAMP+sensors.">In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors.</a> The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).</li><li>Blackman, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDE4D+and+PDE4B+function+in+distinct+subcellular+compartments+in+mouse+embryonic+fibroblasts.">PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).</li><li>Sayner, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paradoxical+cAMP-induced+lung+endothelial+hyperpermeability+revealed+by+Pseudomonas+aeruginosa+ExoY.">Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY.</a> Circulation Research. 95, 196-203 (2004).</li><li>Klarenbeek, J., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+cAMP+with+an+EPAC-based+FRET+sensor+in+single+living+cells.">Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).</li><li>Surdo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+biosensor+uncovers+cAMP+nano-domains+at+&#946;-adrenergic+targets+that+dictate+precise+tuning+of+cardiac+contractility.">FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at &#946;-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility.</a> Nature Communications. 8, 15031 (2017).</li><li>Ponsioen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+cAMP-induced+Epac+activation+by+fluorescence+resonance+energy+transfer:+Epac+as+a+novel+cAMP+indicator.">Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator.</a> EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).</li><li>Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fanciful+FRET.">Fanciful FRET.</a> Science's STKE. 2006, (2006).</li><li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+History+of+FRET:+From+conception+through+the+labors+of+birth.">The History of FRET: From conception through the labors of birth.</a> Reviews in Fluorescence. 3, (2006).</li><li>Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function.">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312, 217-224 (2006).</li><li>Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein-protein+interactions+by+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+(FRET)+microscopy+in+live+cells.">Imaging protein-protein interactions by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells.</a> Current Protocols in Protein Science. 93, 58 (2018).</li><li>Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenylyl+cyclases+and+the+interaction+between+calcium+and+cAMP+signalling.">Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling.</a> Nature. 374, 421-424 (1995).</li><li>Sassone-Corsi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+gene+expression+to+cAMP+signalling:+role+of+CREB+and+CREM.">Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 30, 27-38 (1998).</li><li>Rebhun, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+nucleotides,+calcium,+and+cell+division.">Cyclic nucleotides, calcium, and cell division.</a> International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).</li><li>Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fourth-generation+Epac-based+FRET+sensors+for+cAMP+feature+exceptional+brightness,+photostability+and+dynamic+range:+characterization+of+dedicated+sensors+for+FLIM,+for+ratiometry+and+with+high+affinity.">Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity.</a> PLOS ONE. 10, 0122513 (2015).</li><li>Leavesley, S. J., Rich, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET:+signals+hidden+within+the+noise.">FRET: signals hidden within the noise.</a> Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).</li><li>Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+we+decipher+the+information+content+contained+within+cyclic+nucleotide+signals.">Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals.</a> The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).</li><li>Annamdevula, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+imaging+of+FRET-based+sensors+reveals+sustained+cAMP+gradients+in+three+spatial+dimensions.">Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions.</a> Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).</li><li>Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+FRET+using+spectral+techniques.">Assessing FRET using spectral techniques.</a> Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).</li><li>Leavesley, S. J., Rich, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+limitations+of+FRET+measurements.">Overcoming limitations of FRET measurements.</a> Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).</li><li>Fink, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Earcths+Resources+from+Space.">Monitoring Earcths Resources from Space.</a> Technology Review. 75, 32-41 (1973).</li><li>Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Spectrometry+for+Earth+Remote+Sensing.">Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing.</a> Science. 228, 1147-1153 (1985).</li><li>B&#252;cherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET-FLIM+applications+in+plant+systems.">FRET-FLIM applications in plant systems.</a> Protoplasma. 251, 383-394 (2014).</li><li>Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+spectral+FRET+imaging+microscopy+for+monitoring+nuclear+protein+interactions.">Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions.</a> Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).</li><li>Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+imaging+and+linear+un-mixing+enables+improved+FRET+efficiency+with+a+novel+GFP2-YFP+FRET+pair.">Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair.</a> FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).</li><li>Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+FRET+Efficiency+using+Excitation-Scanning+Hyperspectral+Imaging.">Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging.</a> Biophysical Journal. 112, 586 (2017).</li><li>Favreau, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitation-scanning+hyperspectral+imaging+microscope.">Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope.</a> Journal of Biomedical Optics. 19, 046010 (2014).</li><li>King, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characteristics+of+lung+macro-+and+microvascular+endothelial+cell+phenotypes.">Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes.</a> Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).</li><li>Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+multiphoton+spectral+imaging+and+its+use+for+measuring+resonance+energy+transfer.">Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer.</a> Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).</li><li>Agarwal, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+cAMP+signaling+associated+with+lipid+raft+and+non-raft+membrane+domains+in+adult+ventricular+myocytes.">Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 332 (2018).</li><li>Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+signaling+compartmentation:+Adenylyl+cyclases+as+anchors+of+dynamic+signaling+complexes.">cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes.</a> Mol Pharmacol. , (2017).</li><li>Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+FRET+measurement+using+emission-spectral+unmixing+with+independent+excitation+crosstalk+correction.">Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction.</a> Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).</li><li>Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IIem-spFRET:+improved+Iem-spFRET+method+for+robust+FRET+measurement.">IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement.</a> Journal of Biomedical Optics. 21, 105003 (2016).</li><li>Levy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SpRET:+highly+sensitive+and+reliable+spectral+measurement+of+absolute+FRET+efficiency.">SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency.</a> Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).</li><li>West, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperspectral+Measurements+Allow+Separation+of+FRET+Signals+from+Non-Uniform+Background+Fluorescence.">Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence.</a> Biophysical Journal. 112, 453 (2017).</li><li>Annamdevula, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+approach+for+characterizing+and+comparing+hyperspectral+microscopy+systems.">An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems.</a> Sensors. 13, 9267-9293 (2013).</li></ol>

Разработка биосенсоров FRET позволила измерять и визуализировать циклические нуклеотидные сигналы в отдельных клетках, и существует большая перспектива для визуализации субклеточных сигнальных событий13,22,37,38. Однак...

Циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) является вторым мессенджером, участвующим в ключевых клеточных и физиологических процессах, включая деление клеток, приток кальция, транскрипцию генов и трансдукцию сигналов. Растущее количество доказательств свидетельствует о существовании цАМФ-компартментов в клетке, благодаря которым достигается сигнальнаяспецифичность 1,2,3,4,5,6,7. До недавнего времени компартментализация цАМФ выводилась на основе различных физиологических или клеточных эффектов, индуцированных различными агонистами G-связанных рецепторов8,9,10,11. Совсем недавно флуоресцентные зонды на основе FRET предоставили новые подходы для прямого измерения и наблюдения сигналов цАМФ в ячейке12,13,14.
Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) — это физическое явление, при котором передача энергии происходит между донорскими и акцепторными молекулами нерадиационным образом, когда молекулы находятся в непосредственнойблизости 15,16. С развитием флуоресцентных индикаторов на основе FRET это физическое явление было использовано в биологических приложениях для изучения белково-белковых взаимодействий17,колокализации белка18,передачи сигналов Ca+2 19,экспрессии генов20,деления клеток21 и циклической нуклеотидной сигнализации. Индикаторы цАМФ на основе FRET обычно состоят из цАМФ-связывающего домена, донорского флуорофора и акцепторного флуорофора22. Например, датчик цАМФ H18812,22, используемый в данной методологии, состоит из цАМФ-связующего домена, полученного из Epac, зажатого между бирюзовыми (донорскими) и венериными (акцепторными) флуорофорами. В базальных условиях (несвязанные) бирюза и Венера находятся в такой ориентации, что между флуорофорами возникает FRET. При связывании цАМФ с связующим доменом происходит конформационное изменение, в результате чего Бирюза и Венера раздвигаются, что приводит к снижению FRET.
Подходы к визуализации на основе FRET предлагают многообещающий инструмент для исследования и визуализации сигналов цАМФ в клетке. Однако современные методы микроскопической визуализации на основе FRET часто лишь частично успешны в достижении достаточной силы сигнала для измерения FRET с субклеточной пространственной четкостью. Это связано с несколькими факторами, включая ограниченную силу сигнала многих репортеров FRET, высокий уровень точности, необходимый для точной количественной оценки изменений эффективности FRET, и наличие смешанных факторов, таких как клеточная автофлуоресценция23,24. Результатом часто является изображение FRET, которое страдает от слабого SNR, что делает визуализацию субклеточных изменений в FRET очень сложной. Кроме того, исследование пространственно локализованных сигналов цАМФ почти исключительно проводилось только в двух пространственных измерениях, а осевое распределение цАМФ редко считалось25. Вероятно, это связано с тем, что низкий SNR препятствует возможности измерения и визуализации градиентов цАМФ в трех пространственных измерениях. Чтобы преодолеть ограничения использования датчиков FRET с низким SNR, мы внедрили гиперспектральные подходы к визуализации и анализу для измерения FRET в отдельных клетках25,26,27.
Подходы к гиперспектральной визуализации были разработаны НАСА для дифференциации наземных объектов, присутствующих на спутниковых снимках28,29. С тех пор эти методы были переведены в поле флуоресцентной микроскопии30,с несколькими коммерческими системами конфокальных микроскопов, предлагающими спектральные детекторы. В традиционной (неспектральной) флуоресцентной визуализации образец возбуждается с помощью полосового фильтра или лазерной линии, а излучение собирается с помощью второго полосового фильтра, часто выбираемого в соответствии с пиковой длиной волны излучения флуорофора (флуорофоров). Напротив, подходы к гиперспектральной визуализации направлены на выборку полного спектрального профиля либо флуоресцентного излучения26,31,32, либо возбуждения33,34 на определенных интервалах длин волн. В наших предыдущих исследованиях мы показали, что гиперспектральные подходы к визуализации и анализу могут предложить улучшенную количественную оценку сигналов FRET в клетках по сравнению с традиционными методами визуализации FRET на основе фильтров26. Здесь мы представляем методологию выполнения 4-мерной (x, y, z и λ) гиперспектральной визуализации и анализа FRET для измерения и визуализации распределений цАМФ в трех пространственных измерениях. Эти подходы позволили визуализировать агонист-индуцированные цАМФ пространственные градиенты в одиночных ячейках25. Интересно, что в зависимости от агониста градиенты цАМФ могут быть очевидны в клетках. Представленная здесь методология использует спектральное размешивание неоднородного фона и клеточной автофлуоресценции для повышения точности измерений FRET. Хотя эта методология демонстрируется в легочных микрососудистых эндотелиальных клетках (PMVEC) с использованием биосенсора цАМФ FRET, методология может быть легко модифицирована для использования с альтернативными репортерами FRET или альтернативными клеточными линиями.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Attofluor Cell Chamber</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A7816</td>
			<td>Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>Solvent used to prepare stock solution forskolin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>62252</td>
			<td>Nuclear label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6178</td>
			<td>Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3917</td>
			<td>Adenyly cyclase activator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H188 Cyclic AMP FRET biosensor</td>
			<td>Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink</td>
			<td>Gift</td>
			<td>Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>image.net</td>
			<td>Free download</td>
			<td>Another image processing platform used to extact spectral information and image processing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Integrating Sphere</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>FOIS-1</td>
			<td>Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin Mouse Protein, Natural</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>23017-015</td>
			<td>Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 Transfection Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3000-015</td>
			<td>Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2019a</td>
			<td>Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Nikon A1R</td>
			<td>Spectral image acquisition is performed using confocal microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Elements Software</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Software dongle</td>
			<td>used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIST-Traceable Calibration Lamp</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>LS-1-CAL-INT</td>
			<td>A lamp with a known spectrum for use as a standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>coomonly used buffer suring cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs)</td>
			<td>In house - Cell culture core, Univeristy of South Alabama</td>
			<td>Isolated from Rat pulmonary microvasculature</td>
			<td>PMVECs form inner lining of a blood vessel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides</td>
			<td>Clay Adams</td>
			<td>3010</td>
			<td>Microscope slides used for cell fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mounting Media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36961</td>
			<td>If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>QE65000</td>
			<td>Used to measure spectral response of the light source (?)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrodes Buffer</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>Made in-house</td>
			<td>Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3506</td>
			<td>Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Round Microscope Cover Slips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12545102</td>
			<td>Cells were grown on round glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X Ojective</td>
			<td>Nikon Instruments</td>
			<td>Plan Apo VC 60X/1.2 WI &#8734;/0.15-0.18 WD 0.27</td>
			<td>water immersion and commonly used objective for cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of 3-dimensional camp distributions in living cells using 4-dimensional (x, y, z, and &lambda;) hyperspectral fret imaging and analysis

Циклический АМП является вторым мессенджером, который участвует в широком спектре клеточной и физиологической деятельности. Несколько исследований показывают, что сигналы цАМФ разделены и что компартментализация способствует специфичности сигналов в рамках сигнального пути цАМФ. Разработка биосенсоров на основе резонансного переноса энергии (FRET) на основе Fӧrster способствовала способности измерять и визуализировать сигналы цАМФ в клетках. Однако эти измерения часто ограничиваются двумя пространственными измерениями, что может привести к неправильному толкованию данных. На сегодняшний день были проведены лишь очень ограниченные измерения сигналов цАМФ в трех пространственных измерениях (x, y и z) из-за технических ограничений в использовании датчиков FRET, которые по своей природе демонстрируют низкое отношение сигнал/шум (SNR). Кроме того, традиционные подходы к визуализации на основе фильтров часто неэффективны для точного измерения сигналов цАМФ в локализованных субклеточных областях из-за ряда факторов, включая спектральные перекрестные помехи, ограниченную силу сигнала и автофлуоресценцию. Чтобы преодолеть эти ограничения и позволить использовать биосенсоры на основе FRET с несколькими флуорофорами, мы разработали гиперспектральные подходы к визуализации и анализу FRET, которые обеспечивают спектральную специфичность для расчета эффективности FRET и возможность спектрально отделять сигналы FRET от смешивающей автофлуоресценции и / или сигналов от дополнительных флуоресцентных меток. Здесь мы представляем методологию реализации гиперспектральной визуализации FRET, а также необходимость построения соответствующей спектральной библиотеки, которая не является ни недовыборочной, ни передискретированной для выполнения спектрального размешивания. Хотя мы представляем эту методологию для измерения трехмерных распределений цАМФ в легочных микрососудистых эндотелиальных клетках (PMVECs), эта методология может быть использована для изучения пространственных распределений цАМФ в ряде типов клеток.

Этот протокол описывает использование гиперспектральных подходов к визуализации и анализу FRET для измерения градиентов цАМФ в трех пространственных измерениях в живых клетках. Существует несколько ключевых шагов, связанных с получением этих результатов, для которых требуется тщател?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional x, y, z, and Î» Hyperspectral FRET Imaging and Analysis at JoVE.com

Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional x, y, z, and &lambda; Hyperspectral FRET Imaging and Analysis

Из-за низкого отношения сигнал/шум (SNR) датчиков на основе резонансной передачи энергии (FRET) измерения сигналов цАМФ были сложными, особенно в трех пространственных измерениях. Здесь мы описываем гиперспектральную методологию визуализации и анализа FRET, которая позволяет измерять распределение цАМФ в трех пространственных измерениях.

Измерение 3-мерных распределений цАМФ в живых клетках с использованием 4-мерной (x, y, z и λ) гиперспектральной визуализации и анализа FRET

Cyclic AMP is a second messenger that is involved in a wide range of cellular and physiological activities. Several studies suggest that cAMP signals are ...

This protocol is significant as it provides a method for measuring and visualizing FRET or cyclic AMP signals in three spatial dimensions in individual cells. Cyclic AMP distributions may occur axially in addition to laterally and it is important to acquire FRET cyclic AMP image data in three dimensions to sample these distributions. On the day of imaging, warm Tyrodes buffer to 37 degrees Celsius in a water bath and mount a cover slip seated with the transfected cells of interest into a cell chamber.Secure the top of the chamber with a mounting gasket to prevent leaking and use a delicate task wiper to remove any excess medium or adherent cells from the bottom of the cover slip. Add 800 microliters of working buffer and four microliters of five millimolar nuclear label to the cell chamber and gently rock the chamber for five to 10 seconds. Then cover the cell chamber with aluminum foil for a 10 minute incubation at room temperature.To image the cells, select the 60X water immersion objective on a confocal microscope equipped with a spectral detector and add a drop of water to the objective. Place the loaded cell chamber onto the microscope stage and tune the filter knob to select the appropriate filter set. Select the fluorescence widefield mode and use the eyepieces to select a field of view containing cells expressing the FRET cyclic AMP sensor.Open the imaging software, select the confocal mode, and unlock the laser interlock button. Open the A1 settings menu. Check the boxes corresponding to the 405 and 561 nanometer laser lines and set these spectral detections to SD, the resolution to 10, and the channels to 32.Select the start and end wavelength values to set the wavelength range. Open the A1 Settings menu to select the binning skip icon. Select the number 15 box and click OK.Set the laser intensities to eight percent for the 405 nanometer laser and to two percent for the 561 nanometer laser.Set the detector gain to 149 and the pinhole radius to 2.4 Airy disk units. Set the scan speed to 25 spectral frames per second, and select the unidirectional scan direction. Set the count to four and the scan size to 1024 by 1024.To define the z-stack acquisition parameters, click View, Acquisition Control, and ND Acquisition, and enter the file destination and name in the pop window to save the ND file. Click the z-series box and click Live in the A1 Plus Settings window to open a live viewing window. Adjust the focus knob to focus on the cells while looking in the preview window.Adjust the focus knob on the microscope to select the top of the cell and click Top in the ND Acquisition window to set the current position as the top. Adjust the focus knob on the microscope to select the bottom of the cell and click Bottom to set the current position as the bottom. Enter one micrometer for the step size.Select Top Bottom for the z-scan direction and click run to acquire a z-stack. When the z-stack acquisition is complete, use a pipette to gently add the reagent of interest to the chamber without disturbing the cells. After 10 minutes, change the file name and acquire a second z-stack image.After imaging, create new folders with the same file names as the spectral z-stack images and open the spectral image file of interest. Click File, Import/Export, and Export ND Document. In the pop-up window, select the newly created folder, TIFF for the file type, Mono image for each channel, and keep bit depth.Click export to export the individual files to the folder and open the linear spectral unmixing software. Open the Linear Unmixing. m file and click Run.Browse and select the folder containing the exported TIFF file sequence and click OK to open the wavelength and z-slice window. Copy the file name of the first file without the z-slice and channel number from the folder and paste it into the first step of the Enter of the imagename box, enter the number of channels in the Enter the number of wavelength bands box, and the number of z-slices in the Enter the number of Z Slices box and click OK.Then in the pop-up window, browse and select the Wavelength. mat file and click Open.Browse and select the Library. mat file in the new pop-up window and click Open again to initiate the slice unmixing. To calculate the FRET efficiency, open the multiFRRCF.m programming script and enter the number of experimental trials to analyze in the How many folders to reslice box. Click OK.Browse to select the unmixed folders and click OK again. In the new pop-up window, set the scaling factor to 12.4, the threshold to 56, the X, Y, and Z frequency to five, five, and one respectively, and the smoothing algorithm to Gaussian.Then click Run to perform the FRET measurements and reslicing. To map the FRET efficiency to cyclic AMP levels, open the Mapping_FRET.Efficiency_to_cAMP_concentration. m file and click Run.Navigate to and select the first grayscale FRET image and click OK.Then open the FRET cyclic AMP images to inspect the distribution of the cyclic AMP signals in three dimensions. In these images, three-dimensional views of false colored raw hyperspectral image data acquired using confocal microscopy at baseline and 10 minutes after forskolin treatment can be observed. In this analysis, an acceptor fluorophore was completely photo destructed allowing spectral signatures of the donor and acceptor with one-to-one stoichiometry to be obtained.Non-transfected cells labeled with a nuclear dye were utilized to obtain the pure spectrum of the dye fluorophore. Combining the spectra of the donor, acceptor, and nuclear dye fluorophores allows the creation of a three component library. Here, the sources of three background spectral signatures can be observed.Although these signals are distributed non-uniformly within the sample and cannot simply be subtracted out, adding the spectral signatures of these signals to the spectral library and using linear unmixing to separate the signals provides an approach for removing these confounding signals from the donor and acceptor signals prior to calculating their FRET efficiencies. The six component spectral library can then be used to perform linear spectral unmixing for each slice in the axial image. Here, the changes in FRET efficiency and cyclic AMP levels in different XY plane slices can be observed allowing a comparison between the baseline conditions and the conditions 10 minutes after forskolin treatment.This technique could also be used to quantify the FRET efficiency of other reporters in three dimensions in both cells and tissues.

Research

JoVE Journal

Biology

Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional (x, y, z, and &lambda;) Hyperspectral FRET Imaging and Analysis

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Импульсно-погони Анализ N-связанных цепей сахар из гликопротеинов в клетках млекопитающих

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

Иммуноцитохимическая Анализ стволовых клеток человека плюрипотентных использованием Self-Made цитоспина аппарата

Human pluripotent stem cells (hPSCs) that include human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are exciting cell ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Изображениями сотовый изменения формы в живых Drosophila Эмбрионы

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Быстрое Генетический анализ эпителиальных мезенхимальных сигнализации во время регенерации волос

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Измерение Одновременное рН в эндоцитотических и цитозольные отсеков в живых клетках с помощью конфокальной микроскопии

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

В режиме реального времени изображений Единого Engineered РНК-транскриптов в живых клетках, используя Логометрический Бимолекулярные маяки

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Флуоресценции изображений с Один-нм Точность (Fiona)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Измерение флуктуаций кальция в пределах саркоплазматического ретикулума культивируемых клеток гладкой мышцы с использованием FRET на основе конфокальной микроскопии

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

FRET визуализации в трехмерных гидрогелей

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...