Name: accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries
Uploaded: 2020-10-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries at JoVE.com

Dit werk werd mogelijk gemaakt door Victorian State Government Operational Infrastructure Support en Australian Government NHMRC IRIISS en ondersteund door financiering van de National Health and Medical Research Council (ALW #1120300) en de Australian Research Council (KJH #FT190100265). De auteurs willen graag de technische ondersteuning van het Monash Animal Research Platform, Monash Histology Platform en Monash Micro Imaging facility erkennen.

Eierstokken werden verzameld van vrouwelijke C57BL6J muizen. Alle dierprocedures en experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de NHMRC Australian Code of Practice for the Care and Use of Animals en goedgekeurd door de Monash Animal Research Platform Animal Ethics Committee.
OPMERKING: In dit rapport werd een chemotherapiemiddel gebruikt om primordiale follikeloöcyten uit te putten, zoals bepaald met stereologie11 en directe tellingen12</su...

<ol>
	<li>Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+capacity+of+oocytes+for+DNA+repair.">The capacity of oocytes for DNA repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).</li><li>Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+DNA+repair+for+maintaining+oocyte+quality+in+response+to+anti-cancer+treatments,+environmental+toxins+and+maternal+ageing.">The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing.</a> Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).</li><li>Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Mullerian+hormone:+ovarian+reserve+testing+and+its+potential+clinical+implications.">Anti-Mullerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications.</a> Human Reproduction Update. 20 (5), 688-701 (2014).</li><li>Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+quantifying+follicular+numbers+within+the+mouse+ovary.">Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary.</a> Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).</li><li>Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereology:+introduction+to+basic+concepts+and+practical+approaches+for+estimation+of+cell+number.">Design-based stereology: introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number.</a> Toxicologic Pathology. 38 (7), 1011-1025 (2010).</li><li>Ristic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+dexamethasone+treatment+reduces+ovarian+follicle+number+in+neonatal+rat+offspring.">Maternal dexamethasone treatment reduces ovarian follicle number in neonatal rat offspring.</a> Journal of Microscopy. 232 (3), 549-557 (2008).</li><li>Soleimani Mehranjani, M., Mansoori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+study+on+the+effect+of+vitamin+C+in+preventing+the+adverse+effects+of+bisphenol+A+on+rat+ovary.">Stereological study on the effect of vitamin C in preventing the adverse effects of bisphenol A on rat ovary.</a> International Journal of Reproductive Biomedicine (Yazd). 14 (6), 403-410 (2016).</li><li>Brown, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bias+in+image+analysis+and+its+solution:+unbiased+stereology.">Bias in image analysis and its solution: unbiased stereology.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 30 (3), 183-191 (2017).</li><li>Hasselholt, S., Lykkesfeldt, J., Overgaard Larsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thick+methacrylate+sections+devoid+of+lost+caps+simplify+stereological+quantifications+based+on+the+optical+fractionator+design.">Thick methacrylate sections devoid of lost caps simplify stereological quantifications based on the optical fractionator design.</a> Anatomical Record (Hoboken). 298 (12), 2141-2150 (2015).</li><li>Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicle+counts--not+as+simple+as+1,+2,+3.">Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).</li><li>Nguyen, Q. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+PUMA+protects+the+ovarian+reserve+during+DNA-damaging+chemotherapy+and+preserves+fertility.">Loss of PUMA protects the ovarian reserve during DNA-damaging chemotherapy and preserves fertility.</a> Cell Death and Disease. 9 (6), 618 (2018).</li><li>Meirow, D., Assad, G., Dor, J., Rabinovici, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GnRH+antagonist+cetrorelix+reduces+cyclophosphamide-induced+ovarian+follicular+destruction+in+mice.">The GnRH antagonist cetrorelix reduces cyclophosphamide-induced ovarian follicular destruction in mice.</a> Human Reproduction. 19 (6), 1294-1299 (2004).</li><li>Winship, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PARP+inhibitor,+olaparib,+depletes+the+ovarian+reserve+in+mice:+implications+for+fertility+preservation.">The PARP inhibitor, olaparib, depletes the ovarian reserve in mice: implications for fertility preservation.</a> Human Reproduction. , (2020).</li><li>Meirow, D., Lewis, H., Nugent, D., Epstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclinical+depletion+of+primordial+follicular+reserve+in+mice+treated+with+cyclophosphamide:+clinical+importance+and+proposed+accurate+investigative+tool.">Subclinical depletion of primordial follicular reserve in mice treated with cyclophosphamide: clinical importance and proposed accurate investigative tool.</a> Human Reproduction. 14 (7), 1903-1907 (1999).</li><li>Nguyen, Q. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-+and+cyclophosphamide-induced+primordial+follicle+depletion+is+caused+by+direct+damage+to+oocytes.">Cisplatin- and cyclophosphamide-induced primordial follicle depletion is caused by direct damage to oocytes.</a> Molecular Human Reproduction. , (2019).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+and+its+prediction.">The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction.</a> Journal of Microscopy. 147, 229-263 (1987).</li><li>Olesen, M. V., Needham, E. K., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Optical+Fractionator+Technique+to+Estimate+Cell+Numbers+in+a+Rat+Model+of+Electroconvulsive+Therapy.">The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55737 (2017).</li><li>Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Is+the+Number+of+Primordial+Follicles+in+the+Ovarian+Reserve+Established.">How Is the Number of Primordial Follicles in the Ovarian Reserve Established.</a> Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).</li><li>Omari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mcl-1+is+a+key+regulator+of+the+ovarian+reserve.">Mcl-1 is a key regulator of the ovarian reserve.</a> Cell Death and Disease. 6, 1755 (2015).</li><li>Winship, A. L., Bakai, M., Sarma, U., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dacarbazine+depletes+the+ovarian+reserve+in+mice+and+depletion+is+enhanced+with+age.">Dacarbazine depletes the ovarian reserve in mice and depletion is enhanced with age.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6516 (2018).</li><li>Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+accurate,+simple+method+for+unbiased+determination+of+primordial+follicle+number+in+the+primate+ovary.">An accurate, simple method for unbiased determination of primordial follicle number in the primate ovary.</a> Biology of Reproduction. 56 (4), 909-915 (1997).</li><li>Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+primordial+follicle+number+in+pigtailed+monkey+ovaries:+symmetry+and+relationship+with+age.">Morphometric analysis of primordial follicle number in pigtailed monkey ovaries: symmetry and relationship with age.</a> Biology of Reproduction. 61 (2), 553-556 (1999).</li><li>Charleston, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+human+ovarian+non-growing+follicle+number:+the+application+of+modern+stereology+techniques+to+an+old+problem.">Estimating human ovarian non-growing follicle number: the application of modern stereology techniques to an old problem.</a> Human Reproduction. 22 (8), 2103-2110 (2007).</li><li>Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+primordial+and+nongrowing+follicle+counts+according+to+the+Stages+of+Reproductive+Aging+Workshop+(STRAW)+staging+system.">Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system.</a> Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).</li><li>Hansen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+reproductive+aging:+the+decline+in+ovarian+non-growing+follicle+number+from+birth+to+menopause.">A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause.</a> Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).</li><li>Sonigo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+ovarian+follicle+counting+by+an+innovative+deep+learning+approach.">High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).</li><li>McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+iDISCO+and+CUBIC+tissue+clearing+and+lightsheet+microscopy+for+in+toto+analysis+of+the+adult+mouse+ovarydagger.">Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger.</a> Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).</li><li>Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+evaluation+of+murine+ovarian+follicles+using+a+modified+CUBIC+tissue+clearing+method.">Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).</li></ol>

Dit artikel biedt een stapsgewijs protocol voor de gouden standaardtechniek voor het opsommen van primordiale follikels van muizen, stereologie en de vaker gebruikte methode voor het direct tellen van follikels. Chemotherapiebehandeling werd gebruikt om de resultaten van deze twee verschillende methoden in de linker- en rechter eierstok van hetzelfde dier te vergelijken en te contrasteren. Beide methoden onthulden een hoge variabiliteit tussen dieren in primordiale follikelgetallen. Een significante uitputting van de ova...

De onrijpe, meiotically-gearresteerde oöcyten die in primordiale follikels in de eierstok worden opgeslagen zijn de opslageenheid voor de vrouwelijke kiembaan en omvatten de het leven eierstokreserve van een individu. Primordiale follikels nemen op natuurlijke wijze af met de leeftijdvan 1jaar, of kunnen als alternatief voortijdig worden uitgeput na blootstelling aan exogene chemicaliën, waaronder sommige geneesmiddelen en milieutoxische stoffen in lucht, voedsel en water2. Aangezien het primordiale follikelgetal eindig is, bepalen de hoeveelheid en kwaliteit van de follikels in de eierstok grotendeels de vrouwelijke vruchtbaarheid en de gezondheid van nakomelingen. Nauwkeurige kwantificering van het primordiale follikelgetal bij vrouwen is dus essentieel voor het evalueren van de off-target effecten van exogene beledigingen op de ovariële reserve.
Bij vrouwen is analyse van de hele eierstok over het algemeen niet mogelijk, dus niet-invasieve surrogaatmetingen van de eierstokreserve moeten in een klinische omgeving worden gebruikt. Anti-Mħllerian hormoon (AMH) is de meest gebruikte surrogaat biomarker klinisch3. Serum AMH-spiegels worden vaak gemeten bij vrouwen van gevorderde leeftijd van de moeder, of voor en na de behandeling van kanker, zoals chemotherapie. AMH wordt echter geproduceerd door groeiende follikels en niet door primordiale follikels, en dus informeren serumspiegels niet over het absolute primordiale follikelgetal.
Met de afwezigheid van methoden om het primordiale follikelgetal bij vrouwen in situnauwkeurig te bepalen, blijft het tellen van ovariële follikels in kleine diermodellen, zoals knaagdieren, een essentieel onderzoeksinstrument om de mate te beoordelen waarmee exogene beledigingen invloed hebben op primordiale follikels en dus vruchtbaarheid. Helaas zijn rapporten in de literatuur van primordiale follikelgetallen in knaagdiermodellen zeer variabel4. Een belangrijke reden hiervoor zijn de wijdverspreide technische verschillen in de toegepaste telmethode. In de literatuur worden twee verschillende technieken beschreven voor het opsommen van primordiale follikels bij muizen. Deze omvatten stereologie, die de fractionator optische dissector methode gebruikt, en directe follikeltellingen.
Stereologie wordt algemeen beschouwd als de gouden standaard omdat het systematische uniforme willekeurige bemonsteringgebruikt 5, waardoor het de meest nauwkeurige methode is om primordiaal follikelgetal in hele muis te kwantificeren, of ratteneierstokken4,6,7. Stereologie is onbevooroordeeld, omdat het de driedimensionale structuur van het object van belangverklaart 8. Met behulp van een optische dissector/fractionatormethode worden drie bemonsteringsniveaus toegepast om primordiale follikels te kwantificeren met behulp van dikke weefselsecties (bv. 20 μm) binnen een bekende fractie van de totale eierstok van de muis. Ten eerste wordt het bemonsteringsinterval gekozen (bv. elke3e sectie) bij een willekeurige start (bemonsteringsfractie 1, f1)4. Secties worden vervolgens vanaf dit punt op een systematische, uniforme manier door de hele eierstok bemonsterd. Vervolgens wordt een onbevooroordeeld telkader over de eierstoksectie gesupercipeerd en geleidelijk verplaatst langs een gedefinieerd, gerandomiseerd telraster (bemonsteringsfractie 2, f2)8. Ten slotte wordt een bekende fractie van de doorsnededikte optisch bemonsterd (bv. 10 μm) en worden follikels in dit gebied geteld (bemonsteringsfractie 3, f3)4. Het ruwe follikelgetal wordt vermenigvuldigd met de inverse van deze bemonsteringsfracties om de eindwaarde te verkrijgen. Deze methode vereist deskundige training en apparatuur, waaronder een microscoop met een gemotoriseerd podium aangedreven door stereologische software. Weefsels moeten worden bewaard in het fixatieve van een gespecialiseerde Bouin en ingebed in glycolmethacrylaathars om dikke weefselsecties te kunnen snijden met behulp van een microtome van glycolmethacrylaathars met een glazen mes. Deze methode is ontworpen om weefselkrimp en vervorming te verklaren, om de driedimensionale morfologische structuur van de eierstok en follikels het beste te behouden9.
Direct follikeltelling is de meest gebruikte methode voor het tellen van follikels10. Meer voorkomende fixatieven (d.w.z. formaline) kunnen worden gebruikt, gevolgd door inbedding van paraffinewas en uitputtende seriële doorsneden met behulp van een standaardmicrotome met een dikte tussen 4-6 μm. Follikels worden systematisch geteld in de gehele weefselsectie met een bepaald interval en vervolgens vermenigvuldigd met de inverse van het bemonsteringsinterval om de totale follikelraming te verkrijgen. Deze methode is snel, eenvoudig, kan worden uitgevoerd met behulp van gearchiveerde weefsels en worden bereid met behulp van standaard histologische technieken. Het vereist alleen een lichtmicroscoop met standaard beeldvormingsmogelijkheden. Ondanks deze voordelen mist direct follikeltelling echter de nauwkeurigheid en strikte telparameters van stereologie, waardoor het vatbaarder is voor onderzoeksbias. Bovendien kunnen weefsels krimp en vervorming ondergaan tijdens de verwerking, waardoor de integriteit en morfologie van de eierstok worden verstoord en follikelclassificatie en kwantificering moeilijk worden.
Het doel van dit artikel is om twee veelgebruikte methoden te beschrijven om het primordiale follikelgetal in de eierstokken van muizen kwantitatief te beoordelen: stereologie en directe follikeltelling. We zullen gedetailleerde protocollen voor deze twee methoden verstrekken en enkele van hun sterke en zwakke punten benadrukken, om de reproduceerbaarheid in ons vakgebied te verbeteren en onderzoekers in staat te stellen een weloverwogen beslissing te nemen over de meest geschikte telmethode voor hun studies.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Butanol (HPLC)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>#A383-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid alcohol</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#ACDL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#8217;s fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#HT10132</td>
			<td>Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophosphamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C0768-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#06522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#ETH</td>
			<td>Ethanol 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle</td>
			<td>Designs for Vision</td>
			<td>#FEA-745-SR</td>
			<td>Feather blade for dissections (seen in Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin fixative</td>
			<td>Australian Biostain</td>
			<td>#ANBFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MENCS22501GP</td>
			<td>22 mm x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycomethacrylate resin RM2165 microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>#RM2165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycolmethacrylate DPX</td>
			<td>*made in house</td>
			<td></td>
			<td>*Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histolene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#11031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#8217;s haematoxylin</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX50 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#BX50</td>
			<td>Brightfield microscope fitted with 10x dry &#38; 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus immersion oil type-F</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#IMMOIL-F30CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus TH4-200 light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#TH4-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#03987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic acid</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#PERI1%</td>
			<td>Periodic acid 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Microtome CUT 4060</td>
			<td>MicroTec</td>
			<td>#4060R/F</td>
			<td>Used to cut paraffin sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schiff&#8217;s reagent</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#SCHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scott&#39;s tap water</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#SCOT</td>
			<td>Potassium carbonate, magnesium sulphate, water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StereoInvestigator Stereological System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MENSF41296SP</td>
			<td>1 mm, 72 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit 7100 Plastic embedding system</td>
			<td>Emgrid Australia</td>
			<td>#64709003</td>
			<td>500 mL/5 x 1 g/40 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit 3040 yellow</td>
			<td>Emgrid Australia</td>
			<td>#64708805</td>
			<td>100 g/80 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries

Seksueel voortplantende vrouwelijke zoogdieren worden geboren met hun hele leven voorraad oöcyten. Onrijpe, rustgevende oöcyten worden gevonden in primordiale follikels, de opslageenheid van de vrouwelijke kiembaan. Ze zijn niet-hernieuwbaar, dus hun aantal bij de geboorte en het daaropvolgende verliespercentage dicteert grotendeels de vruchtbare levensduur van de vrouw. Nauwkeurige kwantificering van primordiale follikels bij vrouwen en dieren is essentieel voor het bepalen van de impact van geneesmiddelen en toxische stoffen op het eierstokreservaat. Het is ook noodzakelijk voor het evalueren van de behoefte aan en het succes van bestaande en opkomende vruchtbaarheidsbehoudstechnieken. Momenteel bestaan er geen methoden om het aantal primordiale follikels dat de eierstokreserve bij vrouwen omvat, nauwkeurig te meten. Bovendien is het verkrijgen van eierstokweefsel van grote dieren of bedreigde soorten voor experimenten vaak niet haalbaar. Muizen zijn dus een essentieel model geworden voor dergelijke studies en het vermogen om primordiale follikelnummers in hele eierstokken van muizen te evalueren is een cruciaal hulpmiddel. Rapporten van absolute follikelgetallen in de eierstokken van muizen in de literatuur zijn echter zeer variabel, waardoor het moeilijk is om gegevens te vergelijken en / of te repliceren. Dit is te wijten aan een aantal factoren, waaronder spanning, leeftijd, behandelingsgroepen, evenals technische verschillen in de gebruikte telmethoden. In dit artikel bieden we een stapsgewijze instructiegids voor het voorbereiden van histologische secties en het tellen van primordiale follikels in muiseierstokken met behulp van twee verschillende methoden: [1] stereologie, die afhankelijk is van de fractionator / optische dissectortechniek; en [2] de directe tellingstechniek. Enkele van de belangrijkste voor- en nadelen van elke methode zullen worden benadrukt, zodat de reproduceerbaarheid in het veld kan worden verbeterd en onderzoekers in staat worden gesteld de meest geschikte methode voor hun studies te selecteren.

Er werd een goed gekarakteriseerd model van follikeldepletie gebruikt, waarbij jonge volwassen vrouwelijke muizen een enkele dosis cyclofosfamide chemotherapie of zoutoplossing (n=5/groep) kregen toegediend en beide eierstokken na 48 uur van elk dier werden geoogst. Eén eierstok per dier werd bereid zoals beschreven in stap 1 voor elk van de twee methoden: stereologie of directe tellingen. De linker- en rechter eierstok van elk dier werd willekeurig toegewezen aan elke groep. Deze gegevens tonen aan dat bij gebruik van ...

Watch this Scientific Journal Video about Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries at JoVE.com

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Hier beschrijven, vergelijken en contrasteren we twee verschillende technieken voor het nauwkeurig tellen van de follikels van vaste eierstokweefsels van muizen.

Nauwkeurige follikelenumatie in volwassen muiseronden

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Cultuur en co-cultuur van de Muis eierstokken en ovariële follikels

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

Nauwkeurige en Fenol Gratis DNA Sexing van Dag 30 embryo&#39;s van varkens door PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

Isoleren haarfollikel stamcellen en epidermale keratinocyten van Dorsale Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methoden voor Imaging intracellulaire pH van de follikel stamcel overdrachtslijn in Live Drosophila eierstokweefsel

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissectie en kleuring van Drosophila pop eierstokken

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Hele Mount immunofluorescentie en follikel kwantificering van gekweekte muis eierstokken

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiseren van het knooppunt en de Notochordal plaat In Gastrulating muis embryo's met behulp van Scanning elektronen microscopie en hele Mount immunofluorescentie

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Directe bloedlijn herprogrammering van volwassen muis Fibroblast te Erythroid voorlopercellen

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Bepaling van de Galkanaal dichtheid in de lever van de muis

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...