Name: accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries
Uploaded: 2020-10-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries at JoVE.com

Ce travail a été rendu possible grâce au soutien de l’infrastructure opérationnelle du gouvernement de l’État de Victoria et au gouvernement australien NHMRC IRIISS et soutenu par le financement du National Health and Medical Research Council (ALW #1120300) et de l’Australian Research Council (KJH #FT190100265). Les auteurs tiennent à souligner le soutien technique de la plateforme de recherche sur les animaux Monash, de la plateforme d’histologie Monash et de l’installation de micro-imagerie Monash.

Des ovaires ont été prélevés sur des souris femelles C57BL6J. Toutes les procédures et expériences sur les animaux ont été effectuées conformément au code de pratique australien NHMRC pour le soin et l’utilisation des animaux et approuvées par le comité d’éthique animale de la plate-forme de recherche sur les animaux Monash.
REMARQUE: Un agent chimiothérapeutique montré pour épuiser les ovocytes primordiaux de follicule, tel que déterminé utilisant la stéréologie<sup cl...

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	<li>Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+capacity+of+oocytes+for+DNA+repair.">The capacity of oocytes for DNA repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).</li><li>Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+DNA+repair+for+maintaining+oocyte+quality+in+response+to+anti-cancer+treatments,+environmental+toxins+and+maternal+ageing.">The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing.</a> Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).</li><li>Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Mullerian+hormone:+ovarian+reserve+testing+and+its+potential+clinical+implications.">Anti-Mullerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications.</a> Human Reproduction Update. 20 (5), 688-701 (2014).</li><li>Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+quantifying+follicular+numbers+within+the+mouse+ovary.">Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary.</a> Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).</li><li>Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereology:+introduction+to+basic+concepts+and+practical+approaches+for+estimation+of+cell+number.">Design-based stereology: introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number.</a> Toxicologic Pathology. 38 (7), 1011-1025 (2010).</li><li>Ristic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+dexamethasone+treatment+reduces+ovarian+follicle+number+in+neonatal+rat+offspring.">Maternal dexamethasone treatment reduces ovarian follicle number in neonatal rat offspring.</a> Journal of Microscopy. 232 (3), 549-557 (2008).</li><li>Soleimani Mehranjani, M., Mansoori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+study+on+the+effect+of+vitamin+C+in+preventing+the+adverse+effects+of+bisphenol+A+on+rat+ovary.">Stereological study on the effect of vitamin C in preventing the adverse effects of bisphenol A on rat ovary.</a> International Journal of Reproductive Biomedicine (Yazd). 14 (6), 403-410 (2016).</li><li>Brown, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bias+in+image+analysis+and+its+solution:+unbiased+stereology.">Bias in image analysis and its solution: unbiased stereology.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 30 (3), 183-191 (2017).</li><li>Hasselholt, S., Lykkesfeldt, J., Overgaard Larsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thick+methacrylate+sections+devoid+of+lost+caps+simplify+stereological+quantifications+based+on+the+optical+fractionator+design.">Thick methacrylate sections devoid of lost caps simplify stereological quantifications based on the optical fractionator design.</a> Anatomical Record (Hoboken). 298 (12), 2141-2150 (2015).</li><li>Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicle+counts--not+as+simple+as+1,+2,+3.">Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).</li><li>Nguyen, Q. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+PUMA+protects+the+ovarian+reserve+during+DNA-damaging+chemotherapy+and+preserves+fertility.">Loss of PUMA protects the ovarian reserve during DNA-damaging chemotherapy and preserves fertility.</a> Cell Death and Disease. 9 (6), 618 (2018).</li><li>Meirow, D., Assad, G., Dor, J., Rabinovici, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GnRH+antagonist+cetrorelix+reduces+cyclophosphamide-induced+ovarian+follicular+destruction+in+mice.">The GnRH antagonist cetrorelix reduces cyclophosphamide-induced ovarian follicular destruction in mice.</a> Human Reproduction. 19 (6), 1294-1299 (2004).</li><li>Winship, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PARP+inhibitor,+olaparib,+depletes+the+ovarian+reserve+in+mice:+implications+for+fertility+preservation.">The PARP inhibitor, olaparib, depletes the ovarian reserve in mice: implications for fertility preservation.</a> Human Reproduction. , (2020).</li><li>Meirow, D., Lewis, H., Nugent, D., Epstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclinical+depletion+of+primordial+follicular+reserve+in+mice+treated+with+cyclophosphamide:+clinical+importance+and+proposed+accurate+investigative+tool.">Subclinical depletion of primordial follicular reserve in mice treated with cyclophosphamide: clinical importance and proposed accurate investigative tool.</a> Human Reproduction. 14 (7), 1903-1907 (1999).</li><li>Nguyen, Q. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-+and+cyclophosphamide-induced+primordial+follicle+depletion+is+caused+by+direct+damage+to+oocytes.">Cisplatin- and cyclophosphamide-induced primordial follicle depletion is caused by direct damage to oocytes.</a> Molecular Human Reproduction. , (2019).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+and+its+prediction.">The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction.</a> Journal of Microscopy. 147, 229-263 (1987).</li><li>Olesen, M. V., Needham, E. K., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Optical+Fractionator+Technique+to+Estimate+Cell+Numbers+in+a+Rat+Model+of+Electroconvulsive+Therapy.">The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55737 (2017).</li><li>Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Is+the+Number+of+Primordial+Follicles+in+the+Ovarian+Reserve+Established.">How Is the Number of Primordial Follicles in the Ovarian Reserve Established.</a> Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).</li><li>Omari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mcl-1+is+a+key+regulator+of+the+ovarian+reserve.">Mcl-1 is a key regulator of the ovarian reserve.</a> Cell Death and Disease. 6, 1755 (2015).</li><li>Winship, A. L., Bakai, M., Sarma, U., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dacarbazine+depletes+the+ovarian+reserve+in+mice+and+depletion+is+enhanced+with+age.">Dacarbazine depletes the ovarian reserve in mice and depletion is enhanced with age.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6516 (2018).</li><li>Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+accurate,+simple+method+for+unbiased+determination+of+primordial+follicle+number+in+the+primate+ovary.">An accurate, simple method for unbiased determination of primordial follicle number in the primate ovary.</a> Biology of Reproduction. 56 (4), 909-915 (1997).</li><li>Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+primordial+follicle+number+in+pigtailed+monkey+ovaries:+symmetry+and+relationship+with+age.">Morphometric analysis of primordial follicle number in pigtailed monkey ovaries: symmetry and relationship with age.</a> Biology of Reproduction. 61 (2), 553-556 (1999).</li><li>Charleston, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+human+ovarian+non-growing+follicle+number:+the+application+of+modern+stereology+techniques+to+an+old+problem.">Estimating human ovarian non-growing follicle number: the application of modern stereology techniques to an old problem.</a> Human Reproduction. 22 (8), 2103-2110 (2007).</li><li>Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+primordial+and+nongrowing+follicle+counts+according+to+the+Stages+of+Reproductive+Aging+Workshop+(STRAW)+staging+system.">Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system.</a> Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).</li><li>Hansen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+reproductive+aging:+the+decline+in+ovarian+non-growing+follicle+number+from+birth+to+menopause.">A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause.</a> Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).</li><li>Sonigo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+ovarian+follicle+counting+by+an+innovative+deep+learning+approach.">High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).</li><li>McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+iDISCO+and+CUBIC+tissue+clearing+and+lightsheet+microscopy+for+in+toto+analysis+of+the+adult+mouse+ovarydagger.">Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger.</a> Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).</li><li>Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+evaluation+of+murine+ovarian+follicles+using+a+modified+CUBIC+tissue+clearing+method.">Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).</li></ol>

Cet article fournit un protocole étape par étape pour la technique de référence pour énumérer les follicules primordiaux de souris, la stéréologie, et la méthode plus généralement employée de compter direct de follicule. Le traitement de chimiothérapie a été employé pour comparer et contraster les résultats obtenus à partir de ces deux méthodes différentes dans l’ovaire gauche et droit du même animal. Les deux méthodes ont indiqué la variabilité inter-animale élevée dans les nombres primordiau...

Les ovocytes immatures et méiotically-arrêtés stockés dans les follicules primordiaux dans l’ovaire sont l’unité de stockage pour la lignée germinale femelle et comprennent la réserve ovarienne à vie d’un individu. Le nombre de follicules primordiaux diminue naturellement avec l’âgede 1, ou bien, peut être prématurément épuisé à la suite d’une exposition à des produits chimiques exogènes, y compris certains produits pharmaceutiques et toxiques environnementaux dans l’air, les aliments et l’eau2. Étant donné que le nombre de follicules primordiaux est fini, la quantité et la qualité des follicules présents dans l’ovaire déterminent en grande partie la fertilité féminine et la santé de la progéniture. Ainsi, la quantification précise du nombre primordial de follicule chez les femmes est essentielle pour évaluer les impacts hors cible des insultes exogènes sur la réserve ovarienne.
Chez les femmes, l’analyse de l’ovaire entier n’est généralement pas possible, ainsi des mesures de substitution non invasives de la réserve ovarienne doivent être utilisées dans un cadre clinique. L’hormone anti-Mϋllerienne (AMH) est le biomarqueur de substitution le plus largement utilisé cliniquement3. Les taux sériques d’AMH sont souvent mesurés chez les femmes d’âge maternel avancé, ou avant et après le traitement du cancer, comme la chimiothérapie. Cependant, l’AMH est produite par la croissance des follicules et non par les follicules primordiaux, et ainsi, les niveaux de sérum n’informent pas sur le nombre absolu de follicules primordiaux.
En l’absence de méthodes pour déterminer avec précision le nombre de follicules primordiaux chez les femmes in situ,le comptage des follicules ovariens chez les petits modèles animaux, tels que les rongeurs, reste un outil de recherche essentiel pour évaluer le degré d’impact des insultes exogènes sur les follicules primordiaux et donc sur la fertilité. Malheureusement, les rapports dans toute la littérature sur les nombres primordiaux de follicules dans les modèles de rongeurs sont très variables4. L’une des principales raisons en est les différences techniques largement rapportées dans la méthode de comptage utilisée. Principalement, il existe deux techniques différentes décrites dans la littérature pour énumérer les follicules primordiaux chez la souris. Ceux-ci incluent la stéréologie, qui utilise la méthode du dissecteur optique du fractionneur, et le nombre direct de follicules.
La stéréologie est largement considérée comme l’étalon-or car elle utilise un échantillonnage aléatoire uniforme systématique5,ce qui en fait la méthode la plus précise de quantification du nombre de follicules primordiaux chez les ovaires entiers de souris ou de rats4,6,7. La stéréologie est impartiale, car elle tient compte de la structure tridimensionnelle de l’objet d’intérêt8. À l’aide d’une méthode de dissecteur/fractionneur optique, trois niveaux d’échantillonnage sont appliqués pour quantifier les follicules primordiaux à l’aide de sections tissulaires épaisses (p. ex. 20 μm) dans une fraction connue de l’ovaire total de la souris. Tout d’abord, l’intervalle d’échantillonnage est choisi (par exemple, chaque3ème section) à un départ aléatoire (fraction d’échantillonnage 1, f1)4. Les sections sont ensuite échantillonnées de manière systématique et uniforme à partir de ce point à travers l’ovaire entier. Ensuite, une base de comptage non biaisée se superpose à la section ovarienne et se déplace progressivement le long d’une grille de comptage définie et randomisée (fraction d’échantillonnage 2,f2)8. Enfin, une fraction connue de l’épaisseur de la section est échantillonnée optiquement (par exemple, 10 μm) et les follicules à l’intérieur de cette zone sont comptés (fraction d’échantillonnage 3,f3)4. Le nombre de follicules bruts est multiplié par l’inverse de ces fractions d’échantillonnage pour obtenir la valeur finale. Cette méthode nécessite une formation et un équipement d’experts, y compris un microscope avec un étage motorisé piloté par un logiciel téréologique. Les tissus doivent être conservés dans un fixateur de Bouin spécialisé et incorporés dans de la résine de glycolméthacrylate pour permettre de couper des sections de tissus épaisses à l’aide d’un microtome de résine de glycolméthacrylate avec un couteau en verre. Cette méthode est conçue pour tenir compte du rétrécissement et de la déformation des tissus, afin de préserver au mieux la structure morphologique tridimensionnelle de l’ovaire et des follicules9.
Le comptage direct des follicules est la méthode la plus fréquemment utilisée pour compter les follicules10. Des fixateurs plus courants (c.-à-d. le forcine) peuvent être utilisés, suivis de l’encastrement de cire de paraffine et du sectionnement exhaustif en série à l’aide d’un microtome standard à une épaisseur comprise entre 4 et 6 μm. Les follicules sont systématiquement comptés dans toute la section tissulaire à un intervalle défini, puis multipliés par l’inverse de l’intervalle d’échantillonnage pour obtenir l’estimation du follicule total. Cette méthode est rapide, facile, peut être réalisée à l’aide de tissus archivés et préparée à l’aide de techniques histologiques standard. Il ne nécessite qu’un microscope optique avec des capacités d’imagerie standard. Cependant, en dépit de ces avantages, le comptage direct de follicule manque de la précision et des paramètres stricts de comptage de la stéréologie, ce qui le rend plus enclin au biais d’investigateur. En outre, les tissus peuvent subir un rétrécissement et une déformation pendant le traitement, perturbant l’intégrité et la morphologie de l’ovaire et rendant ainsi la classification et la quantification des follicules difficiles.
Le but de cet article est de décrire deux méthodes couramment utilisées pour évaluer quantitativement le nombre primordial de follicule dans les ovaires de souris : stéréologie et comptage direct de follicule. Nous fournirons des protocoles détaillés pour ces deux méthodes et mettrons en évidence certaines de leurs forces et faiblesses, afin d’améliorer la reproductibilité dans notre domaine et de permettre aux chercheurs de prendre une décision éclairée quant à la méthode de comptage la plus appropriée pour leurs études.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Butanol (HPLC)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>#A383-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid alcohol</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#ACDL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#8217;s fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#HT10132</td>
			<td>Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophosphamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C0768-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#06522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#ETH</td>
			<td>Ethanol 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle</td>
			<td>Designs for Vision</td>
			<td>#FEA-745-SR</td>
			<td>Feather blade for dissections (seen in Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin fixative</td>
			<td>Australian Biostain</td>
			<td>#ANBFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MENCS22501GP</td>
			<td>22 mm x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycomethacrylate resin RM2165 microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>#RM2165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycolmethacrylate DPX</td>
			<td>*made in house</td>
			<td></td>
			<td>*Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histolene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#11031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#8217;s haematoxylin</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX50 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#BX50</td>
			<td>Brightfield microscope fitted with 10x dry &#38; 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus immersion oil type-F</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#IMMOIL-F30CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus TH4-200 light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#TH4-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#03987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic acid</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#PERI1%</td>
			<td>Periodic acid 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Microtome CUT 4060</td>
			<td>MicroTec</td>
			<td>#4060R/F</td>
			<td>Used to cut paraffin sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schiff&#8217;s reagent</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#SCHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scott&#39;s tap water</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#SCOT</td>
			<td>Potassium carbonate, magnesium sulphate, water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StereoInvestigator Stereological System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MENSF41296SP</td>
			<td>1 mm, 72 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit 7100 Plastic embedding system</td>
			<td>Emgrid Australia</td>
			<td>#64709003</td>
			<td>500 mL/5 x 1 g/40 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit 3040 yellow</td>
			<td>Emgrid Australia</td>
			<td>#64708805</td>
			<td>100 g/80 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries

Les mammifères femelles se reproduisant sexuellement naissent avec tout leur approvisionnement en ovocytes tout au long de leur vie. Les ovocytes immatures et tranquilles se trouvent dans les follicules primordiaux, l’unité de stockage de la lignée germinale femelle. Ils ne sont pas renouvelables, donc leur nombre à la naissance et le taux de perte qui en résulte dictent en grande partie la durée de vie fertile des femelles. Une quantification précise du nombre de follicules primordiaux chez les femmes et les animaux est essentielle pour déterminer l’impact des médicaments et des toxiques sur la réserve ovarienne. Elle est également nécessaire pour évaluer la nécessité et le succès des techniques existantes et émergentes de préservation de la fertilité. Actuellement, aucune méthode n’existe pour mesurer avec précision le nombre de follicules primordiaux comprenant la réserve ovarienne chez les femmes. En outre, il n’est souvent pas possible d’obtenir du tissu ovarien de gros animaux ou d’espèces en voie de disparition à des fins expérimentales. Ainsi, les souris sont devenues un modèle essentiel pour de telles études, et la capacité d’évaluer le nombre primordial de follicules dans les ovaires entiers de souris est un outil essentiel. Cependant, les rapports du nombre absolu de follicules dans les ovaires de souris dans la littérature sont très variables, ce qui rend difficile la comparaison et/ou la réplication des données. Cela est dû à un certain nombre de facteurs, y compris la souche, l’âge, les groupes de traitement, ainsi que les différences techniques dans les méthodes de comptage utilisées. Dans cet article, nous fournissons un guide d’instruction étape par étape pour la préparation des sections histologiques et le comptage des follicules primordiaux dans les ovaires de souris en utilisant deux méthodes différentes: [1] stéréologie, qui repose sur la technique de fractionnement / dissecteur optique; et [2] la technique du comptage direct. Certains des principaux avantages et inconvénients de chaque méthode seront mis en évidence afin que la reproductibilité puisse être améliorée sur le terrain et pour permettre aux chercheurs de choisir la méthode la plus appropriée pour leurs études.

Un modèle bien caractérisé d’épuisement des follicules a été utilisé, dans lequel de jeunes souris femelles adultes ont reçu une dose unique de chimiothérapie au cyclophosphamide, ou un contrôle de véhicule salin (n = 5/groupe) et les deux ovaires ont été récoltés de chaque animal après 48 heures. Un ovaire par animal a été préparé comme décrit à l’étape 1 pour chacune des deux méthodes : stéréologie ou comptage direct. L’ovaire gauche et droit de chaque animal a été assigné au hasard ?...

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Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Ici, nous décrivons, comparons, et contrastons deux techniques différentes pour le comptage précis de follicule des tissus ovariens fixes de souris.

Dénombrement précis des follicules chez les ovaires de souris adultes

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Culture et co-culture de souris ovaires et follicules ovariens

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Recherche

Biologie du développement

Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

Précis et phénol libre ADN sexage des embryons de porcins Jour 30 par PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

Isoler follicule pileux cellules souches et kératinocytes épidermiques de la peau Dorsale Souris

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Méthodes pour le pH intracellulaire d’imagerie de la lignée de cellules souches de follicule en Live drosophile de tissu ovarien

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection et la coloration des Drosophila ovaires Pupal

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Toute monture Immunofluorescence et Quantification de follicule de souris cultivées ovaires

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiser le nœud et la notochorde plaque en Gastrulating des embryons de souris à l’aide de la microscopie électronique à balayage et toute monture Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Diriger la lignée reprogrammation de fibroblastes de souris adulte de progéniteurs érythroïdes

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Détermination de la densité de duct biliaire dans le foie de souris

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...