Name: accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries
Uploaded: 2020-10-16T15:00:00
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Questo lavoro è stato reso possibile attraverso il supporto alle infrastrutture operative del governo statale vittoriano e l'AUSTRALIAN Government NHMRC IRIISS e supportato dai finanziamenti del National Health and Medical Research Council (ALW #1120300) e dell'Australian Research Council (KJH #FT190100265). Gli autori vorrebbero riconoscere il supporto tecnico della Monash Animal Research Platform, monash Histology Platform e Monash Micro Imaging facility.

Le ovaie sono state raccolte da topi C57BL6J femminili. Tutte le procedure e gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con il Codice di condotta australiano NHMRC per la cura e l'uso degli animali e approvati dal Monash Animal Research Platform Animal Ethics Committee.
NOTA: Un agente chemioterapico ha dimostrato di esaurire gli ovociti follicoli primordiali, come determinato usando lastereologia 11 e il conteggiodiretto 12...

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	<li>Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+capacity+of+oocytes+for+DNA+repair.">The capacity of oocytes for DNA repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).</li><li>Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+DNA+repair+for+maintaining+oocyte+quality+in+response+to+anti-cancer+treatments,+environmental+toxins+and+maternal+ageing.">The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing.</a> Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).</li><li>Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Mullerian+hormone:+ovarian+reserve+testing+and+its+potential+clinical+implications.">Anti-Mullerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications.</a> Human Reproduction Update. 20 (5), 688-701 (2014).</li><li>Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+quantifying+follicular+numbers+within+the+mouse+ovary.">Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary.</a> Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).</li><li>Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereology:+introduction+to+basic+concepts+and+practical+approaches+for+estimation+of+cell+number.">Design-based stereology: introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number.</a> Toxicologic Pathology. 38 (7), 1011-1025 (2010).</li><li>Ristic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+dexamethasone+treatment+reduces+ovarian+follicle+number+in+neonatal+rat+offspring.">Maternal dexamethasone treatment reduces ovarian follicle number in neonatal rat offspring.</a> Journal of Microscopy. 232 (3), 549-557 (2008).</li><li>Soleimani Mehranjani, M., Mansoori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+study+on+the+effect+of+vitamin+C+in+preventing+the+adverse+effects+of+bisphenol+A+on+rat+ovary.">Stereological study on the effect of vitamin C in preventing the adverse effects of bisphenol A on rat ovary.</a> International Journal of Reproductive Biomedicine (Yazd). 14 (6), 403-410 (2016).</li><li>Brown, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bias+in+image+analysis+and+its+solution:+unbiased+stereology.">Bias in image analysis and its solution: unbiased stereology.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 30 (3), 183-191 (2017).</li><li>Hasselholt, S., Lykkesfeldt, J., Overgaard Larsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thick+methacrylate+sections+devoid+of+lost+caps+simplify+stereological+quantifications+based+on+the+optical+fractionator+design.">Thick methacrylate sections devoid of lost caps simplify stereological quantifications based on the optical fractionator design.</a> Anatomical Record (Hoboken). 298 (12), 2141-2150 (2015).</li><li>Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicle+counts--not+as+simple+as+1,+2,+3.">Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).</li><li>Nguyen, Q. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+PUMA+protects+the+ovarian+reserve+during+DNA-damaging+chemotherapy+and+preserves+fertility.">Loss of PUMA protects the ovarian reserve during DNA-damaging chemotherapy and preserves fertility.</a> Cell Death and Disease. 9 (6), 618 (2018).</li><li>Meirow, D., Assad, G., Dor, J., Rabinovici, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GnRH+antagonist+cetrorelix+reduces+cyclophosphamide-induced+ovarian+follicular+destruction+in+mice.">The GnRH antagonist cetrorelix reduces cyclophosphamide-induced ovarian follicular destruction in mice.</a> Human Reproduction. 19 (6), 1294-1299 (2004).</li><li>Winship, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PARP+inhibitor,+olaparib,+depletes+the+ovarian+reserve+in+mice:+implications+for+fertility+preservation.">The PARP inhibitor, olaparib, depletes the ovarian reserve in mice: implications for fertility preservation.</a> Human Reproduction. , (2020).</li><li>Meirow, D., Lewis, H., Nugent, D., Epstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclinical+depletion+of+primordial+follicular+reserve+in+mice+treated+with+cyclophosphamide:+clinical+importance+and+proposed+accurate+investigative+tool.">Subclinical depletion of primordial follicular reserve in mice treated with cyclophosphamide: clinical importance and proposed accurate investigative tool.</a> Human Reproduction. 14 (7), 1903-1907 (1999).</li><li>Nguyen, Q. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-+and+cyclophosphamide-induced+primordial+follicle+depletion+is+caused+by+direct+damage+to+oocytes.">Cisplatin- and cyclophosphamide-induced primordial follicle depletion is caused by direct damage to oocytes.</a> Molecular Human Reproduction. , (2019).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+and+its+prediction.">The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction.</a> Journal of Microscopy. 147, 229-263 (1987).</li><li>Olesen, M. V., Needham, E. K., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Optical+Fractionator+Technique+to+Estimate+Cell+Numbers+in+a+Rat+Model+of+Electroconvulsive+Therapy.">The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55737 (2017).</li><li>Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Is+the+Number+of+Primordial+Follicles+in+the+Ovarian+Reserve+Established.">How Is the Number of Primordial Follicles in the Ovarian Reserve Established.</a> Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).</li><li>Omari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mcl-1+is+a+key+regulator+of+the+ovarian+reserve.">Mcl-1 is a key regulator of the ovarian reserve.</a> Cell Death and Disease. 6, 1755 (2015).</li><li>Winship, A. L., Bakai, M., Sarma, U., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dacarbazine+depletes+the+ovarian+reserve+in+mice+and+depletion+is+enhanced+with+age.">Dacarbazine depletes the ovarian reserve in mice and depletion is enhanced with age.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6516 (2018).</li><li>Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+accurate,+simple+method+for+unbiased+determination+of+primordial+follicle+number+in+the+primate+ovary.">An accurate, simple method for unbiased determination of primordial follicle number in the primate ovary.</a> Biology of Reproduction. 56 (4), 909-915 (1997).</li><li>Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+primordial+follicle+number+in+pigtailed+monkey+ovaries:+symmetry+and+relationship+with+age.">Morphometric analysis of primordial follicle number in pigtailed monkey ovaries: symmetry and relationship with age.</a> Biology of Reproduction. 61 (2), 553-556 (1999).</li><li>Charleston, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+human+ovarian+non-growing+follicle+number:+the+application+of+modern+stereology+techniques+to+an+old+problem.">Estimating human ovarian non-growing follicle number: the application of modern stereology techniques to an old problem.</a> Human Reproduction. 22 (8), 2103-2110 (2007).</li><li>Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+primordial+and+nongrowing+follicle+counts+according+to+the+Stages+of+Reproductive+Aging+Workshop+(STRAW)+staging+system.">Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system.</a> Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).</li><li>Hansen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+reproductive+aging:+the+decline+in+ovarian+non-growing+follicle+number+from+birth+to+menopause.">A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause.</a> Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).</li><li>Sonigo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+ovarian+follicle+counting+by+an+innovative+deep+learning+approach.">High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).</li><li>McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+iDISCO+and+CUBIC+tissue+clearing+and+lightsheet+microscopy+for+in+toto+analysis+of+the+adult+mouse+ovarydagger.">Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger.</a> Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).</li><li>Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+evaluation+of+murine+ovarian+follicles+using+a+modified+CUBIC+tissue+clearing+method.">Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).</li></ol>

Questo articolo fornisce un protocollo passo-passo per la tecnica gold standard per l'enumerazione dei follicoli primordiali del topo, la stereologia e il metodo più comunemente utilizzato per il conteggio diretto dei follicoli. Il trattamento chemioterapico è stato utilizzato per confrontare e confrontare i risultati ottenuti da questi due diversi metodi all'interno dell'ovaio sinistro e destro dello stesso animale. Entrambi i metodi hanno rivelato un'elevata variabilità tra gli animali nei numeri primordiali del fol...

Gli ovociti immaturi, arrestati meioticamente immagazzinati all'interno di follicoli primordiali nell'ovaio sono l'unità di stoccaggio della linea germinale femminile e comprendono la riserva ovarica a vita di un individuo. Il numero primordiale di follicoli diminuisce naturalmentecon l'età di 1, o in alternativa, può essere prematuramente impoverito a seguito dell'esposizione a sostanze chimiche esogene, tra cui alcuni prodotti farmaceutici e sostanze tossiche ambientali nell'aria, negli alimenti enell'acqua 2. Dato che il numero primordiale del follicolo è finito, la quantità e la qualità dei follicoli presenti all'interno dell'ovaio determinano in gran parte la fertilità femminile e la salute della prole. Pertanto, una quantificazione accurata del numero primordiale di follicoli nelle donne è essenziale per valutare gli impatti fuori bersaglio degli insulti esogeni sulla riserva ovarica.
Nelle donne, l'analisi dell'intera ovaia non è generalmente possibile, quindi le misure surrogate non invasive della riserva ovarica devono essere utilizzate in un ambiente clinico. L'Mϋllerian anti-Mϋllerian (AMH) è il biomarcatore surrogato più utilizzato clinicamente3. I livelli di AMH sierico sono spesso misurati nelle donne in età materna avanzata, o prima e dopo il trattamento del cancro, come la chemioterapia. Tuttavia, l'AMH è prodotto dalla crescita dei follicoli e non dai follicoli primordiali, e quindi, i livelli del siero non informano sul numero primordiale assoluto del follicolo.
Con l'assenza di metodi per determinare con precisione il numero primordiale di follicoli nelle donne in situ, il conteggio dei follicoli ovarico in piccoli modelli animali, come i roditori, rimane uno strumento di ricerca essenziale per valutare il grado in cui gli insulti esogeni hanno un impatto sui follicoli primordiali e quindi sulla fertilità. Sfortunatamente, tuttavia, i rapporti in tutta la letteratura sui numeri primordiali dei follicoli nei modelli di roditori sono altamentevariabili 4. Una delle ragioni principali di ciò sono le differenze tecniche ampiamente riportate nel metodo di conteggio utilizzato. Prevalentemente, ci sono due diverse tecniche descritte nella letteratura per enumerare i follicoli primordiali nei topi. Questi includono la stereologia, che utilizza il metodo del dissector ottico del frazionatore, e il conteggio diretto dei follicoli.
La stereologia è ampiamente considerata il gold standard in quanto utilizza un campionamento casuale uniformesistematico 5, rendendolo il metodo più accurato per quantificare il numero primordiale del follicolo nell'intero topo, o ovaiedi ratto 4,6,7. La stereologia è imparziale, in quanto spiega la struttura tridimensionale dell'oggetto di interesse8. Utilizzando un metodo di dissector/frazionatore ottico, vengono applicati tre livelli di campionamento per quantificare i follicoli primordiali utilizzando sezioni di tessuto spesse (ad esempio, 20 μm) all'interno di una frazione nota dell'ovaio totale del topo. In primo luogo, l'intervallo di campionamento viene scelto (ad esempio, ogni 3rd section) ad un inizio casuale (frazione di campionamento 1, f1)4. Le sezioni vengono quindi campionare in modo sistematico e uniforme da questo punto attraverso l'intera ovaia. Quindi, un sistema di conteggio imparziale viene sovrapposto alla sezione ovarica e progressivamente spostato lungo una griglia di conteggio definita e randomizzata (frazione di campionamento 2, f2)8. Infine, una frazione nota dello spessore della sezione viene campionato otticamente (ad esempio, 10 μm) e vengono conteggiati i follicoli all'interno di quest'area (frazione di campionamento 3, f3)4. Il numero del follicolo grezzo viene moltiplicato per l'inverso di queste frazioni di campionamento per ottenere il valore finale. Questo metodo richiede una formazione e attrezzature esperte, incluso un microscopio con uno stadio motorizzato guidato da software stereologico. I tessuti devono essere conservati in un fixativo di Bouin specializzato e incorporati nella resina glicolemetacrilato per consentire il taglio di sezioni di tessuto spesse utilizzando un microtomo di resina glicolemetacrilato con un coltello di vetro. Questo metodo è progettato per tenere conto del restringimento e della deformazione tissutale, per preservare al meglio la struttura morfologica tridimensionale dell'ovaio e dei follicoli9.
Il conteggio diretto dei follicoli è il metodo più utilizzato per contare ifollicoli 10. Possono essere utilizzati fissivi più comuni (cioè formalina), seguiti da incorporamento di cera di paraffina e sessatura seriale esaustiva utilizzando un microtomo standard con uno spessore compreso tra 4-6 μm. I follicoli vengono sistematicamente conteggiati nell'intera sezione tissutale ad un intervallo definito, e quindi moltiplicati per l'inverso dell'intervallo di campionamento per ottenere la stima totale del follicolo. Questo metodo è rapido, facile, può essere eseguito utilizzando tessuti archiviati e preparato utilizzando tecniche istologiche standard. Richiede solo un microscopio a luce con funzionalità di imaging standard. Tuttavia, nonostante questi vantaggi, il conteggio diretto dei follicoli manca dell'accuratezza e dei rigorosi parametri di conteggio della stereologia, rendendolo più incline ai pregiudizi degli investigatori. Inoltre, i tessuti possono subire restringimento e deformazione durante la lavorazione, interrompendo l'integrità e la morfologia dell'ovaio e rendendo così difficile la classificazione e la quantificazione dei follicoli.
Lo scopo di questo articolo è quello di descrivere due metodi comunemente usati per valutare quantitativamente il numero primordiale di follicoli nelle ovaie del topo: stereologia e conteggio diretto dei follicoli. Forniremo protocolli dettagliati per questi due metodi ed evidenzieremo alcuni dei loro punti di forza e di debolezza, al fine di migliorare la riproducibilità nel nostro campo e consentire ai ricercatori di prendere una decisione informata sul metodo di conteggio più appropriato per i loro studi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Butanol (HPLC)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>#A383-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid alcohol</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#ACDL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#8217;s fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#HT10132</td>
			<td>Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophosphamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C0768-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#06522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#ETH</td>
			<td>Ethanol 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle</td>
			<td>Designs for Vision</td>
			<td>#FEA-745-SR</td>
			<td>Feather blade for dissections (seen in Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin fixative</td>
			<td>Australian Biostain</td>
			<td>#ANBFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MENCS22501GP</td>
			<td>22 mm x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycomethacrylate resin RM2165 microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>#RM2165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycolmethacrylate DPX</td>
			<td>*made in house</td>
			<td></td>
			<td>*Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histolene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#11031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#8217;s haematoxylin</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX50 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#BX50</td>
			<td>Brightfield microscope fitted with 10x dry &#38; 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus immersion oil type-F</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#IMMOIL-F30CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus TH4-200 light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#TH4-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#03987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic acid</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#PERI1%</td>
			<td>Periodic acid 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Microtome CUT 4060</td>
			<td>MicroTec</td>
			<td>#4060R/F</td>
			<td>Used to cut paraffin sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schiff&#8217;s reagent</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#SCHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scott&#39;s tap water</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#SCOT</td>
			<td>Potassium carbonate, magnesium sulphate, water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StereoInvestigator Stereological System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MENSF41296SP</td>
			<td>1 mm, 72 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit 7100 Plastic embedding system</td>
			<td>Emgrid Australia</td>
			<td>#64709003</td>
			<td>500 mL/5 x 1 g/40 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit 3040 yellow</td>
			<td>Emgrid Australia</td>
			<td>#64708805</td>
			<td>100 g/80 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries

Mammiferi femminili che si riproducono sessualmente nascono con tutta la loro fornitura di ovociti per tutta la vita. Gli ovociti immaturi e quiescenti si trovano all'interno dei follicoli primordiali, l'unità di stoccaggio della linea germinale femminile. Non sono rinnovabili, quindi il loro numero alla nascita e il conseguente tasso di perdita dettano in gran parte la durata fertile della vita femminile. Una quantificazione accurata del numero primordiale di follicoli nelle donne e negli animali è essenziale per determinare l'impatto di medicinali e sostanze tossiche sulla riserva ovarica. È anche necessario valutare la necessità e il successo delle tecniche di conservazione della fertilità esistenti ed emergenti. Attualmente, non esistono metodi per misurare con precisione il numero di follicoli primordiali che comprendono la riserva ovarica nelle donne. Inoltre, ottenere tessuto ovarico da grandi animali o specie in via di estinzione per la sperimentazione spesso non è fattibile. Pertanto, i topi sono diventati un modello essenziale per tali studi e la capacità di valutare i numeri primordiali dei follicoli nelle ovaie del topo intero è uno strumento critico. Tuttavia, i rapporti sui numeri assoluti dei follicoli nelle ovaie di topo in letteratura sono altamente variabili, rendendo difficile confrontare e / o replicare i dati. Ciò è dovuto a una serie di fattori tra cui tensione, età, gruppi di trattamento, nonché differenze tecniche nei metodi di conteggio impiegati. In questo articolo, forniamo una guida didattica passo-passo per preparare sezioni istologiche e contare follicoli primordiali nelle ovaie di topo usando due metodi diversi: [1] stereologia, che si basa sulla tecnica del frazionamento / dissector ottico; e [2] la tecnica del conteggio diretto. Alcuni dei principali vantaggi e svantaggi di ciascun metodo saranno evidenziati in modo da migliorare la riproducibilità sul campo e consentire ai ricercatori di selezionare il metodo più appropriato per i loro studi.

È stato utilizzato un modello ben caratterizzato di esaurimento del follicolo, in base al quale alle giovani topi adulte è stata somministrata una singola dose di chemioterapia ciclofosfamide, o controllo saline del veicolo (n = 5 / gruppo) ed entrambe le ovaie sono state raccolte da ogni animale dopo 48 ore. Un'ovaia per animale è stata preparata come descritto nel passaggio 1 per ciascuno dei due metodi: stereologia o conteggi diretti. L'ovaio sinistro e destro di ogni animale è stato assegnato casualmente a ciascu...

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Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Qui descriviamo, confrontiamo e confrontiamo due diverse tecniche per un accurato conteggio follicolo dei tessuti ovarico del topo fissi.

Enumerazione accurata del follicolo nelle ovaie di topo adulto

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

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Biologia dello sviluppo

Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

Preciso e fenolo DNA Sexing libera del Giorno 30 suina embrioni mediante PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

Isolare le cellule staminali del follicolo pilifero e epidermico cheratinociti da pelle dorsale del mouse

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Metodi per pH intracellulare Imaging del lignaggio di cellule staminali del follicolo in Live tessuto ovarico di Drosophila

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissezione e colorazione delle ovaie Pupal Drosophila

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Tutta Monte immunofluorescenza e quantificazione del follicolo delle ovaie coltivati del topo

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualizzare il nodo e la piastra Notochordal In embrioni di topo Gastrulating mediante microscopia elettronica a scansione e intero Monte immunofluorescenza

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Diretto lignaggio riprogrammazione di fibroblasti di topo adulto ai progenitori eritroidi

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Determinazione della densità del dotto biliare nel fegato del topo

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...