Name: accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries
Uploaded: 2020-10-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries at JoVE.com

Dette arbeidet ble gjort mulig gjennom viktoriansk statlig operasjonell infrastrukturstøtte og den australske regjeringen NHMRC IRIISS og støttet av midler fra National Health and Medical Research Council (ALW #1120300) og Australian Research Council (KJH #FT190100265). Forfatterne ønsker å anerkjenne den tekniske støtten til Monash Animal Research Platform, Monash Histology Platform og Monash Micro Imaging-anlegget.

Eggstokkene ble samlet inn fra kvinnelige C57BL6J-mus. Alle dyreprosedyrer og eksperimenter ble utført i samsvar med NHMRC Australian Code of Practice for Care and Use of Animals og godkjent av Monash Animal Research Platform Animal Ethics Committee.
MERK: Et kjemoterapimiddel vist å tømme primordiale follikkel oocytter, som bestemt ved hjelp av stereologi11 og direkte teller12,13 ble brukt i denne rapporten ...

<ol>
	<li>Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+capacity+of+oocytes+for+DNA+repair.">The capacity of oocytes for DNA repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).</li><li>Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+DNA+repair+for+maintaining+oocyte+quality+in+response+to+anti-cancer+treatments,+environmental+toxins+and+maternal+ageing.">The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing.</a> Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).</li><li>Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Mullerian+hormone:+ovarian+reserve+testing+and+its+potential+clinical+implications.">Anti-Mullerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications.</a> Human Reproduction Update. 20 (5), 688-701 (2014).</li><li>Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+quantifying+follicular+numbers+within+the+mouse+ovary.">Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary.</a> Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).</li><li>Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereology:+introduction+to+basic+concepts+and+practical+approaches+for+estimation+of+cell+number.">Design-based stereology: introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number.</a> Toxicologic Pathology. 38 (7), 1011-1025 (2010).</li><li>Ristic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+dexamethasone+treatment+reduces+ovarian+follicle+number+in+neonatal+rat+offspring.">Maternal dexamethasone treatment reduces ovarian follicle number in neonatal rat offspring.</a> Journal of Microscopy. 232 (3), 549-557 (2008).</li><li>Soleimani Mehranjani, M., Mansoori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+study+on+the+effect+of+vitamin+C+in+preventing+the+adverse+effects+of+bisphenol+A+on+rat+ovary.">Stereological study on the effect of vitamin C in preventing the adverse effects of bisphenol A on rat ovary.</a> International Journal of Reproductive Biomedicine (Yazd). 14 (6), 403-410 (2016).</li><li>Brown, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bias+in+image+analysis+and+its+solution:+unbiased+stereology.">Bias in image analysis and its solution: unbiased stereology.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 30 (3), 183-191 (2017).</li><li>Hasselholt, S., Lykkesfeldt, J., Overgaard Larsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thick+methacrylate+sections+devoid+of+lost+caps+simplify+stereological+quantifications+based+on+the+optical+fractionator+design.">Thick methacrylate sections devoid of lost caps simplify stereological quantifications based on the optical fractionator design.</a> Anatomical Record (Hoboken). 298 (12), 2141-2150 (2015).</li><li>Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicle+counts--not+as+simple+as+1,+2,+3.">Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).</li><li>Nguyen, Q. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+PUMA+protects+the+ovarian+reserve+during+DNA-damaging+chemotherapy+and+preserves+fertility.">Loss of PUMA protects the ovarian reserve during DNA-damaging chemotherapy and preserves fertility.</a> Cell Death and Disease. 9 (6), 618 (2018).</li><li>Meirow, D., Assad, G., Dor, J., Rabinovici, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GnRH+antagonist+cetrorelix+reduces+cyclophosphamide-induced+ovarian+follicular+destruction+in+mice.">The GnRH antagonist cetrorelix reduces cyclophosphamide-induced ovarian follicular destruction in mice.</a> Human Reproduction. 19 (6), 1294-1299 (2004).</li><li>Winship, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PARP+inhibitor,+olaparib,+depletes+the+ovarian+reserve+in+mice:+implications+for+fertility+preservation.">The PARP inhibitor, olaparib, depletes the ovarian reserve in mice: implications for fertility preservation.</a> Human Reproduction. , (2020).</li><li>Meirow, D., Lewis, H., Nugent, D., Epstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclinical+depletion+of+primordial+follicular+reserve+in+mice+treated+with+cyclophosphamide:+clinical+importance+and+proposed+accurate+investigative+tool.">Subclinical depletion of primordial follicular reserve in mice treated with cyclophosphamide: clinical importance and proposed accurate investigative tool.</a> Human Reproduction. 14 (7), 1903-1907 (1999).</li><li>Nguyen, Q. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-+and+cyclophosphamide-induced+primordial+follicle+depletion+is+caused+by+direct+damage+to+oocytes.">Cisplatin- and cyclophosphamide-induced primordial follicle depletion is caused by direct damage to oocytes.</a> Molecular Human Reproduction. , (2019).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+and+its+prediction.">The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction.</a> Journal of Microscopy. 147, 229-263 (1987).</li><li>Olesen, M. V., Needham, E. K., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Optical+Fractionator+Technique+to+Estimate+Cell+Numbers+in+a+Rat+Model+of+Electroconvulsive+Therapy.">The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55737 (2017).</li><li>Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Is+the+Number+of+Primordial+Follicles+in+the+Ovarian+Reserve+Established.">How Is the Number of Primordial Follicles in the Ovarian Reserve Established.</a> Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).</li><li>Omari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mcl-1+is+a+key+regulator+of+the+ovarian+reserve.">Mcl-1 is a key regulator of the ovarian reserve.</a> Cell Death and Disease. 6, 1755 (2015).</li><li>Winship, A. L., Bakai, M., Sarma, U., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dacarbazine+depletes+the+ovarian+reserve+in+mice+and+depletion+is+enhanced+with+age.">Dacarbazine depletes the ovarian reserve in mice and depletion is enhanced with age.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6516 (2018).</li><li>Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+accurate,+simple+method+for+unbiased+determination+of+primordial+follicle+number+in+the+primate+ovary.">An accurate, simple method for unbiased determination of primordial follicle number in the primate ovary.</a> Biology of Reproduction. 56 (4), 909-915 (1997).</li><li>Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+primordial+follicle+number+in+pigtailed+monkey+ovaries:+symmetry+and+relationship+with+age.">Morphometric analysis of primordial follicle number in pigtailed monkey ovaries: symmetry and relationship with age.</a> Biology of Reproduction. 61 (2), 553-556 (1999).</li><li>Charleston, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+human+ovarian+non-growing+follicle+number:+the+application+of+modern+stereology+techniques+to+an+old+problem.">Estimating human ovarian non-growing follicle number: the application of modern stereology techniques to an old problem.</a> Human Reproduction. 22 (8), 2103-2110 (2007).</li><li>Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+primordial+and+nongrowing+follicle+counts+according+to+the+Stages+of+Reproductive+Aging+Workshop+(STRAW)+staging+system.">Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system.</a> Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).</li><li>Hansen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+reproductive+aging:+the+decline+in+ovarian+non-growing+follicle+number+from+birth+to+menopause.">A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause.</a> Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).</li><li>Sonigo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+ovarian+follicle+counting+by+an+innovative+deep+learning+approach.">High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).</li><li>McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+iDISCO+and+CUBIC+tissue+clearing+and+lightsheet+microscopy+for+in+toto+analysis+of+the+adult+mouse+ovarydagger.">Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger.</a> Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).</li><li>Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+evaluation+of+murine+ovarian+follicles+using+a+modified+CUBIC+tissue+clearing+method.">Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).</li></ol>

Denne artikkelen inneholder en trinnvis protokoll for gullstandardteknikken for opplisting av musprimordiale follikler, stereologi og den mer brukte metoden for direkte follikkeltelling. Kjemoterapi behandling ble brukt til å sammenligne og kontrast resultatene oppnådd fra disse to forskjellige metoder innenfor venstre og høyre eggstokk fra samme dyr. Begge metodene avdekket høy variasjon mellom dyr i opprinnelige follikkeltall. En betydelig uttømming av ovariereservatet ble registrert ved hjelp av stereologi, men d...

De umodne, meiotisk arresterte oocyttene som er lagret i primordiale follikler i eggstokken, er lagringsenheten for den kvinnelige bakterien og utgjør en persons livstids eggstokkreservat. Primordial follikkel tall avtar naturlig med alder1, eller alternativt, kan være for tidlig utarmet etter eksponering for eksogene kjemikalier, inkludert noen legemidler og miljøgifter i luft, mat og vann2. Gitt at det opprinnelige follikkelnummeret er begrenset, bestemmer mengden og kvaliteten på follikler som er tilstede i eggstokken i stor grad kvinnelig fruktbarhet og avkom helse. Dermed er nøyaktig kvantifisering av primordial follikkeltall hos kvinner avgjørende for å evaluere off-target virkningene av eksogene fornærmelser på eggstokkreservatet.
Hos kvinner er analyse av hele eggstokken generelt ikke mulig, og dermed må ikke-invasive surrogatmål av eggstokkreservatet brukes i en klinisk setting. Anti-Mϋllerian hormon (AMH) er den mest brukte surrogat biomarkør klinisk3. Serum AMH nivåer måles ofte hos kvinner i avansert mors alder, eller før og etter kreft behandling, for eksempel kjemoterapi. AMH produseres imidlertid av voksende follikler og ikke av primordiale follikler, og dermed informerer serumnivåer ikke om absolutt primordial follikkelnummer.
Med fravær av metoder for å nøyaktig bestemme primordial follikkel nummer hos kvinner in situ, teller ovarie follikler i små dyremodeller, som gnagere, er fortsatt et viktig forskningsverktøy for å vurdere i hvilken grad eksogene fornærmelser påvirker primordiale follikler og dermed fruktbarhet. Dessverre er rapporter gjennom hele litteraturen av primordiale follikkeltall i gnagermodeller svært variable4. En viktig årsak til dette er mye rapporterte tekniske forskjeller i tellemetoden som benyttes. Overveiende er det to forskjellige teknikker beskrevet i litteraturen for opplisting av primordiale follikler hos mus. Disse inkluderer stereologi, som benytter fraksjonator optisk dissektormetode, og direkte follikkel teller.
Stereologi er allment ansett gullstandarden som den bruker systematisk ensartet tilfeldig prøvetaking5, noe som gjør den til den mest nøyaktige metoden for å kvantifisere primordial follikkel nummer i hel mus, eller rotte eggstokkene4,6,7. Stereologi er objektiv, da den står for den tredimensjonale strukturen til objektet av interesse8. Ved hjelp av en optisk dissektor/fraksjonatormetode påføres tre nivåer av prøvetaking for å kvantifisere primordiale follikler ved hjelp av tykke vevsseksjoner (f.eks. 20 μm) innenfor en kjent brøkdel av den totale museovalogen. For det første velges prøvetakingsintervallet (f.eks. hver3. seksjon) ved en tilfeldig start (prøvetakingsfraksjon 1, f1)4. Seksjoner prøves deretter på en systematisk, ensartet måte fra dette punktet gjennom hele eggstokken. Deretter legges en objektiv telleramme over eggstokkdelen og flyttes gradvis langs et definert, randomisert tellerutenett (prøvetakingsbrøk 2, f2)8. Til slutt blir en kjent brøkdel av seksjonstykkelsen optisk samplet (f.eks. 10 μm) og follikler innenfor dette området telles (prøvetakingsfraksjon 3, f3)4. Råfosikknummeret multipliseres med det motsatte av disse prøvetakingsfraksjonene for å oppnå den endelige verdien. Denne metoden krever ekspertopplæring og utstyr, inkludert et mikroskop med et motorisert stadium drevet av stereologisk programvare. Vev bør bevares i en spesialisert Bouins fixative, og innebygd i glykolmethacrylate harpiks for å tillate tykke vevsseksjoner å bli kuttet ved hjelp av en glykolmethacrylate harpiksmikrotom med en glasskniv. Denne metoden er designet for å ta hensyn til vevskrymping og deformasjon, for best å bevare den tredimensjonale morfologiske strukturen til eggstokken og folliklene9.
Direkte follikkeltelling er den mest brukte metoden for å telle follikler10. Mer vanlige fikseringer (dvs. formalin) kan brukes, etterfulgt av parafinvoksinnbygging og uttømmende seriell seksjonering ved hjelp av en standard mikrotom med en tykkelse på mellom 4-6 μm. Follikler telles systematisk i hele vevsdelen med et definert intervall, og multipliseres deretter med det motsatte av prøvetakingsintervallet for å oppnå det totale follikkelestimatet. Denne metoden er rask, enkel, kan utføres ved hjelp av arkivert vev, og fremstilles ved hjelp av standard histologiske teknikker. Det krever bare et lett mikroskop med standard bildebehandlingsfunksjoner. Til tross for disse fordelene mangler imidlertid direkte follikkeltelling nøyaktigheten og strenge telleparametere for stereologi, noe som gjør den mer utsatt for undersøkerbias. I tillegg kan vev gjennomgå krymping og deformasjon under behandling, forstyrre integriteten og morfologien til eggstokken og dermed gjøre follikkelklassifisering og kvantifisering vanskelig.
Målet med denne artikkelen er å beskrive to ofte brukte metoder for kvantitativt å vurdere primordial follikkelnummer i museovaries: stereologi og direkte follikkeltelling. Vi vil gi detaljerte protokoller for disse to metodene og fremheve noen av deres styrker og svakheter, for å forbedre reproduserbarheten på vårt felt og la forskere ta en informert beslutning om den mest hensiktsmessige tellemetoden for studiene.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Butanol (HPLC)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>#A383-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid alcohol</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#ACDL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#8217;s fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#HT10132</td>
			<td>Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophosphamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C0768-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#06522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#ETH</td>
			<td>Ethanol 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle</td>
			<td>Designs for Vision</td>
			<td>#FEA-745-SR</td>
			<td>Feather blade for dissections (seen in Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin fixative</td>
			<td>Australian Biostain</td>
			<td>#ANBFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MENCS22501GP</td>
			<td>22 mm x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycomethacrylate resin RM2165 microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>#RM2165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycolmethacrylate DPX</td>
			<td>*made in house</td>
			<td></td>
			<td>*Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histolene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#11031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#8217;s haematoxylin</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX50 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#BX50</td>
			<td>Brightfield microscope fitted with 10x dry &#38; 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus immersion oil type-F</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#IMMOIL-F30CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus TH4-200 light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#TH4-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#03987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic acid</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#PERI1%</td>
			<td>Periodic acid 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Microtome CUT 4060</td>
			<td>MicroTec</td>
			<td>#4060R/F</td>
			<td>Used to cut paraffin sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schiff&#8217;s reagent</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#SCHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scott&#39;s tap water</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#SCOT</td>
			<td>Potassium carbonate, magnesium sulphate, water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StereoInvestigator Stereological System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MENSF41296SP</td>
			<td>1 mm, 72 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit 7100 Plastic embedding system</td>
			<td>Emgrid Australia</td>
			<td>#64709003</td>
			<td>500 mL/5 x 1 g/40 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit 3040 yellow</td>
			<td>Emgrid Australia</td>
			<td>#64708805</td>
			<td>100 g/80 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries

Seksuelt reproduserende kvinnelige pattedyr er født med hele livet tilførsel av oocytter. Umodne, quiescent oocytter finnes i primordiale follikler, lagringsenheten til den kvinnelige bakterien. De er ikke-fornybare, og dermed deres antall ved fødselen og påfølgende tapsrate dikterer i stor grad den kvinnelige fruktbare levetiden. Nøyaktig kvantifisering av opprinnelige follikkeltall hos kvinner og dyr er avgjørende for å bestemme virkningen av medisiner og toksiske stoffer på eggstokkreservatet. Det er også nødvendig for å evaluere behovet for, og suksess av, eksisterende og fremvoksende fruktbarhet bevaring teknikker. For tiden finnes det ingen metoder for å nøyaktig måle antall primordiale follikler som består av eggstokkreservatet hos kvinner. Videre er det ofte ikke mulig å skaffe eggstokkvev fra store dyr eller truede arter for eksperimentering. Dermed har mus blitt en viktig modell for slike studier, og evnen til å evaluere opprinnelige follikkeltall i hele museovaries er et kritisk verktøy. Rapporter om absolutte follikkeltall i museovaries i litteraturen er imidlertid svært variable, noe som gjør det vanskelig å sammenligne og / eller replikere data. Dette skyldes en rekke faktorer, inkludert belastning, alder, behandlingsgrupper, samt tekniske forskjeller i metodene for telling ansatt. I denne artikkelen gir vi en trinnvis instruksjonsveiledning for å forberede histologiske seksjoner og telle primordiale follikler i museovaries ved hjelp av to forskjellige metoder: [1] stereologi, som er avhengig av fraksjonator / optisk dissektorteknikk; og [2] den direkte telleteknikken. Noen av de viktigste fordelene og ulempene ved hver metode vil bli fremhevet slik at reproduserbarhet kan forbedres på feltet og for å gjøre det mulig for forskere å velge den mest hensiktsmessige metoden for studiene.

En godt karakterisert modell av follikkeluttømming ble brukt, hvorved unge voksne kvinnelige mus ble administrert en enkelt dose cyklofosfamid kjemoterapi, eller saltvannsbilkontroll (n = 5 / gruppe) og begge eggstokkene ble høstet fra hvert dyr etter 48 timer. En eggstokk per dyr ble utarbeidet som beskrevet i trinn 1 for hver av de to metodene: stereologi eller direkte teller. Venstre og høyre eggstokk fra hvert dyr ble tilfeldig tildelt hver gruppe. Disse dataene viser at ved bruk av stereologi kan en betydelig utt...

Watch this Scientific Journal Video about Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries at JoVE.com

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Her beskriver, sammenligner og kontrasterer vi to forskjellige teknikker for nøyaktig follikkeltelling av fast musovarisk vev.

Nøyaktig follikkelopplisting i voksenmusovaries

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Kultur og Co-Culture of Mouse Eggstokkene og ovariefollikler

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

Nøyaktig og Fenol Gratis DNA sexing av Dag 30 svinekjøtt embryoer ved PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

Isolere hårsekken stamceller og epidermal Keratinocytter fra Dorsal Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disseksjon og Immunofluorescent flekker av sopp kropp og Photoreceptor Neurons i voksen Drosophila melanogaster hjernen

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Metoder for Imaging intracellulær pH i hårsekken stamcelleforskningen slektslinje i Live Drosophila Ovarian vev

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Disseksjon og flekker av Drosophila Pupal eggstokkene

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Hele Mount Immunofluorescence og hårsekken kvantifisering av kultivert musen eggstokkene

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal Plate i Gastrulating Mouse embryoer skanning elektronmikroskop og hele Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Direkte avstamning omprogrammering av voksen mus Fibroblast å Erythroid Progenitors

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Bestemme galle duct tetthet i musen Liver

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...