Name: accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries
Uploaded: 2020-10-16T15:00:00
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Este trabalho foi viabilizado através do Apoio à Infraestrutura Operacional do Governo do Estado vitoriano e do Governo Australiano NHMRC IRIISS e apoiado por financiamento do National Health and Medical Research Council (ALW #1120300) e do Australian Research Council (KJH #FT190100265). Os autores gostariam de reconhecer o apoio técnico da Plataforma monash de pesquisa animal, da Plataforma de Histologia Monash e da instalação Monash Micro Imaging.

Os ovários foram coletados de camundongos C57BL6J femininos. Todos os procedimentos e experimentos em animais foram realizados de acordo com o Código australiano de Prática para o Cuidado e Uso de Animais e aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Plataforma de Pesquisa Animal de Monash.
NOTA: Um agente quimioterápico mostrou esgotar oócitos folículos primordiais, conforme determinado por meio da estereologia11 e conta 12diretas12</s...

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	<li>Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+capacity+of+oocytes+for+DNA+repair.">The capacity of oocytes for DNA repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).</li><li>Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+DNA+repair+for+maintaining+oocyte+quality+in+response+to+anti-cancer+treatments,+environmental+toxins+and+maternal+ageing.">The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing.</a> Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).</li><li>Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-Mullerian+hormone:+ovarian+reserve+testing+and+its+potential+clinical+implications.">Anti-Mullerian hormone: ovarian reserve testing and its potential clinical implications.</a> Human Reproduction Update. 20 (5), 688-701 (2014).</li><li>Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+quantifying+follicular+numbers+within+the+mouse+ovary.">Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary.</a> Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).</li><li>Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design-based+stereology:+introduction+to+basic+concepts+and+practical+approaches+for+estimation+of+cell+number.">Design-based stereology: introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number.</a> Toxicologic Pathology. 38 (7), 1011-1025 (2010).</li><li>Ristic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+dexamethasone+treatment+reduces+ovarian+follicle+number+in+neonatal+rat+offspring.">Maternal dexamethasone treatment reduces ovarian follicle number in neonatal rat offspring.</a> Journal of Microscopy. 232 (3), 549-557 (2008).</li><li>Soleimani Mehranjani, M., Mansoori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereological+study+on+the+effect+of+vitamin+C+in+preventing+the+adverse+effects+of+bisphenol+A+on+rat+ovary.">Stereological study on the effect of vitamin C in preventing the adverse effects of bisphenol A on rat ovary.</a> International Journal of Reproductive Biomedicine (Yazd). 14 (6), 403-410 (2016).</li><li>Brown, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bias+in+image+analysis+and+its+solution:+unbiased+stereology.">Bias in image analysis and its solution: unbiased stereology.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 30 (3), 183-191 (2017).</li><li>Hasselholt, S., Lykkesfeldt, J., Overgaard Larsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thick+methacrylate+sections+devoid+of+lost+caps+simplify+stereological+quantifications+based+on+the+optical+fractionator+design.">Thick methacrylate sections devoid of lost caps simplify stereological quantifications based on the optical fractionator design.</a> Anatomical Record (Hoboken). 298 (12), 2141-2150 (2015).</li><li>Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+follicle+counts--not+as+simple+as+1,+2,+3.">Ovarian follicle counts--not as simple as 1, 2, 3.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11 (2003).</li><li>Nguyen, Q. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+PUMA+protects+the+ovarian+reserve+during+DNA-damaging+chemotherapy+and+preserves+fertility.">Loss of PUMA protects the ovarian reserve during DNA-damaging chemotherapy and preserves fertility.</a> Cell Death and Disease. 9 (6), 618 (2018).</li><li>Meirow, D., Assad, G., Dor, J., Rabinovici, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GnRH+antagonist+cetrorelix+reduces+cyclophosphamide-induced+ovarian+follicular+destruction+in+mice.">The GnRH antagonist cetrorelix reduces cyclophosphamide-induced ovarian follicular destruction in mice.</a> Human Reproduction. 19 (6), 1294-1299 (2004).</li><li>Winship, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PARP+inhibitor,+olaparib,+depletes+the+ovarian+reserve+in+mice:+implications+for+fertility+preservation.">The PARP inhibitor, olaparib, depletes the ovarian reserve in mice: implications for fertility preservation.</a> Human Reproduction. , (2020).</li><li>Meirow, D., Lewis, H., Nugent, D., Epstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclinical+depletion+of+primordial+follicular+reserve+in+mice+treated+with+cyclophosphamide:+clinical+importance+and+proposed+accurate+investigative+tool.">Subclinical depletion of primordial follicular reserve in mice treated with cyclophosphamide: clinical importance and proposed accurate investigative tool.</a> Human Reproduction. 14 (7), 1903-1907 (1999).</li><li>Nguyen, Q. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-+and+cyclophosphamide-induced+primordial+follicle+depletion+is+caused+by+direct+damage+to+oocytes.">Cisplatin- and cyclophosphamide-induced primordial follicle depletion is caused by direct damage to oocytes.</a> Molecular Human Reproduction. , (2019).</li><li>Gundersen, H. J., Jensen, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficiency+of+systematic+sampling+in+stereology+and+its+prediction.">The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction.</a> Journal of Microscopy. 147, 229-263 (1987).</li><li>Olesen, M. V., Needham, E. K., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Optical+Fractionator+Technique+to+Estimate+Cell+Numbers+in+a+Rat+Model+of+Electroconvulsive+Therapy.">The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55737 (2017).</li><li>Findlay, J. K., Hutt, K. J., Hickey, M., Anderson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Is+the+Number+of+Primordial+Follicles+in+the+Ovarian+Reserve+Established.">How Is the Number of Primordial Follicles in the Ovarian Reserve Established.</a> Biology of Reproduction. 93 (5), 111 (2015).</li><li>Omari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mcl-1+is+a+key+regulator+of+the+ovarian+reserve.">Mcl-1 is a key regulator of the ovarian reserve.</a> Cell Death and Disease. 6, 1755 (2015).</li><li>Winship, A. L., Bakai, M., Sarma, U., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dacarbazine+depletes+the+ovarian+reserve+in+mice+and+depletion+is+enhanced+with+age.">Dacarbazine depletes the ovarian reserve in mice and depletion is enhanced with age.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6516 (2018).</li><li>Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+accurate,+simple+method+for+unbiased+determination+of+primordial+follicle+number+in+the+primate+ovary.">An accurate, simple method for unbiased determination of primordial follicle number in the primate ovary.</a> Biology of Reproduction. 56 (4), 909-915 (1997).</li><li>Miller, P. B., Charleston, J. S., Battaglia, D. E., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+analysis+of+primordial+follicle+number+in+pigtailed+monkey+ovaries:+symmetry+and+relationship+with+age.">Morphometric analysis of primordial follicle number in pigtailed monkey ovaries: symmetry and relationship with age.</a> Biology of Reproduction. 61 (2), 553-556 (1999).</li><li>Charleston, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+human+ovarian+non-growing+follicle+number:+the+application+of+modern+stereology+techniques+to+an+old+problem.">Estimating human ovarian non-growing follicle number: the application of modern stereology techniques to an old problem.</a> Human Reproduction. 22 (8), 2103-2110 (2007).</li><li>Hansen, K. R., Craig, L. B., Zavy, M. T., Klein, N. A., Soules, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+primordial+and+nongrowing+follicle+counts+according+to+the+Stages+of+Reproductive+Aging+Workshop+(STRAW)+staging+system.">Ovarian primordial and nongrowing follicle counts according to the Stages of Reproductive Aging Workshop (STRAW) staging system.</a> Menopause. 19 (2), 164-171 (2012).</li><li>Hansen, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+reproductive+aging:+the+decline+in+ovarian+non-growing+follicle+number+from+birth+to+menopause.">A new model of reproductive aging: the decline in ovarian non-growing follicle number from birth to menopause.</a> Human Reproduction. 23 (3), 699-708 (2008).</li><li>Sonigo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+ovarian+follicle+counting+by+an+innovative+deep+learning+approach.">High-throughput ovarian follicle counting by an innovative deep learning approach.</a> Scientific Reports. 8 (1), 13499 (2018).</li><li>McKey, J., Cameron, L. A., Lewis, D., Batchvarov, I. S., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+iDISCO+and+CUBIC+tissue+clearing+and+lightsheet+microscopy+for+in+toto+analysis+of+the+adult+mouse+ovarydagger.">Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger.</a> Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).</li><li>Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+evaluation+of+murine+ovarian+follicles+using+a+modified+CUBIC+tissue+clearing+method.">Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).</li></ol>

Este artigo fornece um protocolo passo-a-passo para a técnica padrão-ouro para enumerar folículos primordiais do rato, estereologia e o método mais comumente empregado de contagem direta de folículos. O tratamento quimioterápico foi utilizado para comparar e contrastar os resultados obtidos a partir desses dois métodos diferentes dentro do ovário esquerdo e direito do mesmo animal. Ambos os métodos revelaram alta variabilidade inter-animal em números de folículos primordiais. Um esgotamento significativo da re...

Os oócitos imaturos e meioticamente presos armazenados dentro de folículos primordiais no ovário são a unidade de armazenamento da germe feminina e compõem a reserva ovariana vitalícia de um indivíduo. Os números de folículos primordiais diminuem naturalmente com a idade1, ou alternativamente, podem ser prematuramente esgotados após a exposição a produtos químicos exógenos, incluindo alguns fármacos e tóxicos ambientais no ar, alimentos e água2. Dado que o número primordial do folículo é finito, a quantidade e a qualidade dos folículos presentes dentro do ovário determinam em grande parte a fertilidade feminina e a saúde dos filhos. Assim, a quantificação precisa do número de folículos primordiais nas mulheres é essencial para avaliar os impactos fora do alvo de insultos exógenos na reserva ovariana.
Nas mulheres, a análise de todo o ovário geralmente não é possível, portanto, medidas não invasivas de substituto da reserva ovariana devem ser utilizadas em um ambiente clínico. O hormônio anti-Mϋllerian (AMH) é o biomarcador substituto mais utilizado clinicamente3. Os níveis de AMH do soro são frequentemente medidos em mulheres com idade materna avançada, ou antes e depois do tratamento do câncer, como a quimioterapia. No entanto, a AMH é produzida por folículos crescentes e não por folículos primordiais, e, portanto, os níveis de soro não informam sobre o número absoluto de folículos primordiais.
Com a ausência de métodos para determinar com precisão o número de folículos primordiais em mulheres in situ, contar folículos ovarianos em pequenos modelos animais, como roedores, continua sendo uma ferramenta de pesquisa essencial para avaliar o grau pelo qual insultos exógenos impactam nos folículos primordiais e, portanto, na fertilidade. Infelizmente, porém, os relatos ao longo da literatura de números de folículos primordiais em modelos de roedores são altamentevariáveis 4. Uma das principais razões para isso são as diferenças técnicas amplamente relatadas no método de contagem empregado. Predominantemente, existem duas técnicas diferentes descritas na literatura para enumerar folículos primordiais em camundongos. Estes incluem estereologia, que emprega o método de dissetor óptico fracionado, e contagem direta de folículos.
A estereologia é amplamente considerada o padrão-ouro, pois utiliza amostragem aleatória uniforme sistemática5, tornando-se o método mais preciso de quantificar o número de folículo primordial em todo o rato, ou ovários de ratos4,6,7. A estereologia é imparcial, pois explica a estrutura tridimensional do objeto de interesse8. Utilizando um método de dissetor/fracionado óptico, três níveis de amostragem são aplicados para quantificar folículos primordiais usando seções de tecido grosso (por exemplo, 20 μm) dentro de uma fração conhecida do ovário total do rato. Em primeiro lugar, o intervalo amostral é escolhido (por exemplo, cada 3seção) em um início aleatório (fração amostral 1, f1)4. As seções são então amostradas de forma sistemática e uniforme a partir deste ponto através de todo o ovário. Em seguida, um quadro de contagem imparcial é sobreposto sobre a seção ovariana e movido progressivamente ao longo de uma grade de contagem definida e aleatória (fração amostral 2, f2)8. Por fim, uma fração conhecida da espessura da seção é amostrada opticamente (por exemplo, 10 μm) e folículos dentro desta área são contados (fração amostral 3, f3)4. O número do folículo bruto é multiplicado pelo inverso dessas frações amostrais para obter o valor final. Este método requer treinamento especializado e equipamentos, incluindo um microscópio com um estágio motorizado conduzido por software stereológico. Os tecidos devem ser preservados em um fixador especializado de Bouin, e embutidos na resina glicolmetatocrila para permitir que seções de tecido grosso sejam cortadas usando um microtome de resina glicolmetatocrila com uma faca de vidro. Este método é projetado para explicar o encolhimento e deformação tecidual, para preservar melhor a estrutura morfológica tridimensional do ovário e dos folículos9.
A contagem direta de folículos é o método mais utilizado para contar folículos10. Fixativos mais comuns (ou seja, formalina) podem ser usados, seguidos de incorporação de cera de parafina e seção serial exaustiva usando um microtome padrão com uma espessura entre 4-6 μm. Os folículos são sistematicamente contados em toda a seção tecidual em um intervalo definido e multiplicados pelo inverso do intervalo amostral para obter a estimativa total do folículo. Este método é rápido, fácil, pode ser realizado usando tecidos arquivados, e preparado usando técnicas histológicas padrão. Requer apenas um microscópio leve com recursos de imagem padrão. No entanto, apesar dessas vantagens, a contagem direta de folículos carece da precisão e dos rigorosos parâmetros de contagem de estereologia, tornando-o mais propenso ao viés do investigador. Além disso, os tecidos podem sofrer encolhimento e deformação durante o processamento, interrompendo a integridade e a morfologia do ovário e dificultando a classificação e quantificação do folículo.
O objetivo deste artigo é descrever dois métodos comumente utilizados para avaliar quantitativamente o número de folículos primordiais nos ovários do rato: estereologia e contagem direta de folículos. Forneceremos protocolos detalhados para esses dois métodos e destacaremos alguns de seus pontos fortes e fracos, a fim de melhorar a reprodutibilidade em nosso campo e permitir que os pesquisadores tossem uma decisão informada do método de contagem mais adequado para seus estudos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Butanol (HPLC)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>#A383-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid alcohol</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#ACDL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#8217;s fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#HT10132</td>
			<td>Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclophosphamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C0768-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#06522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#ETH</td>
			<td>Ethanol 100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle</td>
			<td>Designs for Vision</td>
			<td>#FEA-745-SR</td>
			<td>Feather blade for dissections (seen in Figure 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin fixative</td>
			<td>Australian Biostain</td>
			<td>#ANBFC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MENCS22501GP</td>
			<td>22 mm x 50 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycomethacrylate resin RM2165 microtome</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>#RM2165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycolmethacrylate DPX</td>
			<td>*made in house</td>
			<td></td>
			<td>*Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histolene</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#11031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#8217;s haematoxylin</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX50 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#BX50</td>
			<td>Brightfield microscope fitted with 10x dry &#38; 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus immersion oil type-F</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#IMMOIL-F30CC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus TH4-200 light source</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>#TH4-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin wax</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#03987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Periodic acid</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#PERI1%</td>
			<td>Periodic acid 1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Microtome CUT 4060</td>
			<td>MicroTec</td>
			<td>#4060R/F</td>
			<td>Used to cut paraffin sections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schiff&#8217;s reagent</td>
			<td>Trajan</td>
			<td>#SCHF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scott&#39;s tap water</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>#SCOT</td>
			<td>Potassium carbonate, magnesium sulphate, water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StereoInvestigator Stereological System</td>
			<td>MBF Bioscience</td>
			<td></td>
			<td>Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#MENSF41296SP</td>
			<td>1 mm, 72 pcs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit 7100 Plastic embedding system</td>
			<td>Emgrid Australia</td>
			<td>#64709003</td>
			<td>500 mL/5 x 1 g/40 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Technovit 3040 yellow</td>
			<td>Emgrid Australia</td>
			<td>#64708805</td>
			<td>100 g/80 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries

Mamíferos fêmeas sexualmente reprodutos nascem com todo o seu suprimento de oócitos. Oócitos imaturos e quiescentes são encontrados dentro de folículos primordiais, a unidade de armazenamento da germina feminina. Eles não são renováveis, assim seu número ao nascer e a taxa subsequente de perda dita em grande parte a vida fértil feminina. A quantificação precisa dos números de folículos primordiais em mulheres e animais é essencial para determinar o impacto de medicamentos e toxicantes na reserva ovariana. Também é necessário avaliar a necessidade e o sucesso das técnicas de preservação da fertilidade existentes e emergentes. Atualmente, não existem métodos para medir com precisão o número de folículos primordiais que compõem a reserva ovariana em mulheres. Além disso, a obtenção de tecido ovariano de animais grandes ou espécies ameaçadas para experimentação muitas vezes não é viável. Assim, os camundongos tornaram-se um modelo essencial para tais estudos, e a capacidade de avaliar números de folículos primordiais em ovários inteiros de camundongos é uma ferramenta crítica. No entanto, os relatos de números absolutos de folículos em ovários de camundongos na literatura são altamente variáveis, dificultando a comparação e/ou replicação de dados. Isso se deve a uma série de fatores, incluindo tensão, idade, grupos de tratamento, bem como diferenças técnicas nos métodos de contagem empregados. Neste artigo, fornecemos um guia instrutivo passo a passo para preparar seções histológicas e contar folículos primordiais em ovários de camundongos usando dois métodos diferentes: [1] estereologia, que conta com a técnica de dissetor fracionado/óptico; e [2] a técnica de contagem direta. Algumas das principais vantagens e desvantagens de cada método serão destacadas para que a reprodutibilidade possa ser melhorada no campo e para permitir que os pesquisadores selecionem o método mais adequado para seus estudos.

Utilizou-se um modelo bem caracterizado de esgotamento folículo, pelo qual foram administrados camundongos adultos jovens de uma única dose de quimioterapia ciclofosfamida, ou controle de veículo salino (n=5/grupo) e ambos os ovários foram colhidos de cada animal após 48 horas. Um ovário por animal foi preparado como descrito no Passo 1 para cada um dos dois métodos: estereologia ou contagem direta. O ovário esquerdo e direito de cada animal foi aleatoriamente atribuído a cada grupo. Esses dados mostram que, ao ...

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Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Aqui, descrevemos, comparamos e contrastamos duas técnicas diferentes para a contagem precisa de folículos de tecidos ovarianos fixos do rato.

Enumeração de folículo preciso em ovários de rato adulto

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Cultura e Co-Culture of Mouse ovários e folículos ovarianos

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Biologia do Desenvolvimento

Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

Precisas e Fenol DNA Sexagem gratuito do dia 30 de Porcina embriões por PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

Isolando células-tronco do folículo piloso e epidérmico queratinócitos da Dorsal rato Pele

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissecção e imunofluorescência coloração de cogumelo corpo e fotoreceptor neurônios em cérebros adultos Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Métodos para o pH intracelular Imaging da linhagem de células-tronco do folículo em tecido ovariano de Drosophila

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissecção e coloração dos ovários Pupal drosófila

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Toda montagem de imunofluorescência e quantificação de folículo de ovários Mouse culta

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

Direto de linhagem reprogramação de fibroblastos de rato adulto de progenitores eritroide

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Determinando a densidade do ducto biliar no fígado do rato

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...