Name: cultivating a three-dimensional reconstructed human epidermis at a large scale
Uploaded: 2021-05-28T13:30:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale at JoVE.com

وقد مول هذا العمل برنامج الاتحاد الأوروبي للأبحاث والابتكار في أفق 2020 في إطار منحة ماري سكلودوسكا كوري مع اتفاق المنحة رقم 765602. جميع المؤلفين الاعتراف بدعم من مؤسسة أدولف ميركل وجامعة فيرارا ونعترف بامتنان داو سيليكونس بلجيكا. ومن المسلم به الدكتور ميغيل سبوك كالفار لإعداد الصور الرسومية لعملية زراعة RhE. يشكر المؤلفون الدكتورة باربرا دراسلر، والدكتور فرانكو سيرفيلاتي، والدكتورة أنييس تيسييه على دعمهم التقني ومناقشاتهم.

مارك إيمان وبينيديتا بيتراكا موظفان في داو سيليكون بلجيكا. جميع المؤلفين الآخرين ليس لديهم ما يكشفون عنه.

وتستخدم على نطاق واسع ريس كأدوات الفحص في المجالات الصيدلانية ومستحضرات التجميل dermato36،75،76،77،78. وعلى الرغم من أن عدة شركات أتاحت هذه النباتات غير الزراعية تجاريا، فإنها تظل مكلفة وتحد من إمكانية تغيير بارامترات الزراعة حسب الاقتضاء لمعالجة مسائل البحث الجديدة. تصف هذه الورقة إجراءات إنتاج ال RhEs الداخلية بطريقة قوية وموثوقة وتقدم وصفا مفصلا للأنسجة التي تم الحصول عليها لتأكيد أهمية النموذج كنهج بديل لاختبار الحيوانات.
بعض الخطوات في البروتوكول حاسمة لضمان التمايز keratinocyte السليم وRhE استنساخ. ويمكن تنفيذ ذلك باستخدام الخلايا المثلى، والنوع (الأنواع) المتوسطة، وظروف الزراعة. وفي نموذج RhE المقترح، تم اختيار NHEKs حديثي الولادة لعدم تعرضهم لمضادات المنشأ، مقارنة بالنهايات NHEKs البالغة. وعلاوة على ذلك، اقتصرت الكريات الكيراتينية على العرق القوقازي لتجنب التباين بين الأنواع. وعادة ما تستخدم الخلايا الكيراتينية الأولية لقدرتها على التفريق والتقسيم الطبقي79. ويمكن الحصول عليها تجاريا أو عن طريق العزلة الداخلية من الجلد الكبار80. وقد أظهرت زراعة خط الخلية (أي HaCaT) على غشاء البولي، أن تفشل التمايز وأظهرت ضعف القدرة على توليف الدهون التي هي ضرورية لتشكيل الحاجز81. ومع ذلك ، فإن إدراج المصفوفات الثقافية المختلفة ، مثل الهيدروجيل والكولاجين والفيبرين وثقافات كرويدات ، أدى إلى التطور الناجح لنماذج الجلد ثلاثية الأبعاد78,82,83,84,85,86. خطوط الخلية الخالدة، N/TERT، وقد ثبت أن تكون مناسبة لتطوير RhEs35. تظل الخلايا الكيراتينية الأولية منتشرة عند مرورها الرابع أو الخامس61، وبالتالي فإن البروتوكول الحالي يتضمن استخدام الخلايا الكيراتينية في مرورها الثالث. وقد أثبت دي فويست وآخرون أن كثافة بذر الخلايا ذات أهمية ويجب أن تكون كافية (أي ≥ 2.5x105 خلايا/سم2) لضمان عدم انتشار الوسط من المقصورة القاعدية إلى المقصورة apical. كثافة بذر غير كافية (أي، < 2.5x105 خلايا/سم2) يمكن أن يؤدي إلى عدم القدرة على تشكيل حاجز مناسب، والذي يشار إليه من خلال نشر المتوسطة من القاعدية إلى المقصورة apical، مما أدى إلى المغمورة بدلا من ظروف الثقافة ALI62. مصل خالية من الكيراتينوسيت نمو المتوسطة (انظر جدول المواد) كان يفضل لأغراض استنساخ، لأنه يوفر ميزة العمل مع وسيط محدد كيميائيا ويقلل من خطر التلوث. هذا الوسط يحتوي على تركيز أقل من الكالسيوم (أي 60 ميكرومتر) وبالتالي يحفز انتشار الخلايا الكيراتينية87. زيادة تركيز الكالسيوم (أي 1.5 mM) من الخطوة الأولى من زراعة RhE، تفضل التمايز الكيراتينية وتشكيل حاجز الجلد وهوسط49. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استكمال المتوسط ALI مع حمض الأسكوربيك ، والتي أظهرت أن تكون حاسمة لتشكيل الدهون SC وتعزيز التمايز52,53,54. يحتوي المتوسط ALI أيضا KGF، وهو عامل نمو تفرزها الخلايا الليفية التي يمكن أن ترتبط مستقبلات الخلايا الكيراتينية transmembrane وعند التنشيط له دور مزدوج في التمايز وإصلاح الجروح55,88. من المهم تحديث المتوسط ALI في فترات زمنية محددة، لتوفير إمدادات مستمرة من المواد الغذائية الطازجة إلى RhEs. استخدام نظام لوحة الناقل أمر بالغ الأهمية لزراعة ال RhE على نطاق أوسع (أي 24 إدراج / لوحة). فهو يوفر ميزة توفير الوقت، والحد من خطر التلوث، ويترك مجالا أقل لإدخال الأخطاء البشرية. كما يوفر إمكانية زراعة RhEs في حجم كبير من الوسائط (أي 1.5 مل) ، مما يقلل من العدد المطلوب من التحديث المتوسط ALI. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يوفر إمكانية نقل لوحة كاملة من إدراج إلى لوحة مع المتوسطة الطازجة، وتجنب الاتصال مع إدراج بشكل فردي أو الكشف عن غطاء لوحة.
هناك العديد من القيود على نموذج RhE التي تجدر الإشارة إليها. في الجلد البشري الأصلي هناك توازن بين انتشار الخلايا الكيراتينية في الطبقة القاعدية وانفصال الخلايا القرنية في SC (أي الديسكواميشن)89. ومع ذلك ، في المختبر ، لا يحدث التكون. لذلك ، تظل الخلايا القرنية مرتبطة ب RhE وتشكل SC سميكة أقل أهمية من الناحية الفسيولوجية. ومن ثم، هناك فترة زمنية محدودة للزراعة من RhEs. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النموذج RhE بسيط ومباشر، لأنه يتكون من نوع الخلية المفرد، أي الكيراتينوسي، وهو نوع الخلية الأكثر وفرة من البشرة. ومع ذلك، هناك أنواع أخرى من الخلايا المقيمة في البشرة، مثل الخلايا الصباغية، والخلايا التشعبية (أي خلايا لانغرهان)، والخلايا التائية (على سبيل المثال، CD8+ الخلايا)، وخلايا ميركل13. لتعزيز الأهمية الفسيولوجية لنموذج الجلد، جعل الباحثون نماذج الجلد أكثر تعقيدا عن طريق إضافة الخلايا الصباغية38 , خلايا مناعية39، أو الخلايا المشتقة من المريض90. يجب على المرء أن نضع في اعتبارنا أن خصائص حاجز من نماذج الجلد البشري مختلفة بالمقارنة مع الجلد البشري الأصلي، ويرجع ذلك إلى تكوين الدهون SC مختلفة و نفاذية حاجز أعلى 91,92,93,94,95. ومع ذلك، فقد أبلغت العديد من الدراسات عن تغييرات في خصائص الحاجز لنماذج الجلد البشري من خلال زراعة تحت نقص الأكxia96 أو انخفاض الرطوبة النسبية97، وتعديل مصفوفة الجلد مع الشيتوزان98، والتغيير في الأحماض الدهنية الحرة في وسط الثقافة99. وعلاوة على ذلك ، في كل من RhEs بسيطة وأكثر تعقيدا ، يمكن تعديل الظروف الثقافية والتركيب المتوسط لمحاكاة الميزات المرضية. من خلال تحدي النموذج مع السيتوكينات ، ومورفولوجيا غير طبيعية100 ويمكن إثبات التغيرات في مستويات التعبير الجيني والبروتين التي لوحظت عادة في اضطرابات الجلد الشائعة، مثل التهاب الجلد التأتبي والصدفية35,101,102,103,104,105. إسكات جينات محددة في الخلايا القرنية قبل البدء في عملية إعادة تشكيل النموذج ثلاثي الأبعاد هو نهج آخر يستخدم لمحاكاة ميزات اضطرابات الجلد والتحقيق في الحلول العلاجية الجديدة106,107. إلى جانب نمذجة طبقة البشرة فقط ، يمكن تضمين مقصورة جلدية في النموذج (أي معادلات الجلد البشري المسماة أو نماذج سمك كامل) عن طريق تضمين الخلايا الليفية في مصفوفة الكولاجين قبل إعادة تشكيل RhE ، مما يجعلها أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية ومناسبة للدراسات المتعلقة بالشيخوخة وشفاء الجروح108,109,110. بالإضافة إلى ذلك، تمت إضافة كرويات الورم إلى مكافئات الجلد البشري لدراسة تطور الورم الميلانيني111,112. أحدث التطورات في مجال نماذج البشرة هي الطباعة الحيوية والجلد على رقاقة. نجحت مجموعات بحثية متعددة مؤخرا في تطوير مكافئات الجلد المطبوعة بيولوجيا (القابلة للتشويش)45,113,114. ويستفيد البروتوكول المقترح من شكل 24 بئرا ولوحة حاملة، مع تجنب إدراجها لمعالجتها على حدة. ومع ذلك، لا يزال مقياس الدراسة محدودا جدا ويفتقر إلى التشغيل الآلي. من خلال تنفيذ استخدام الطباعة الحيوية أو الجلد على رقاقة، يمكن استخدام نماذج أصغر الجلد مع عمليات أكثر الآلي وعلى نطاق أوسع.
وRhE وصفها في هذا البروتوكول لديه أوجه تشابه متعددة لنماذج البشرة التجارية المتقدمة بالفعل وتتميز بشكل جيد. وقد أثبت التحليل المورفولوجي أنه على الرغم من أن عدد الطبقات القابلة للتطبيق في نموذج RhE المقترح أقل مقارنة بجلد الإنسان الأصلي (أي 6-7 مقارنة ب 7-14) ، إلا أنه مماثل لنموذج EpiDerm RhE (أي 8-12)70. وبالمثل لنماذج EpiDerm و EpiSkin و SkinEthic ، تظهر طبقة RhE العليا نمطا نسج السلة من طبقات القرنية المعبأة بكثافة28. وعلاوة على ذلك، كشف تحليل TEM أن عدد طبقات SC في نموذج RhE المقترح (أي 15-25) مماثل لعدد EpiDerm (أي 16-25)70. وعموما، فإن نموذج RhE المقترح يوضح بنية مماثلة لهيكل نماذج البشرة التجارية الأخرى، التي تحاكي البشرة البشرية الأصلية. سلامة الأنسجة كما تقاس TEER في نطاق مع نماذج RhE التجارية (أي بين 3000-5600 Ω.cm2)71،72،73 وغيرها من RhEs في المنزل (أي ما يقرب من 5000 Ω.cm2)74،115. ويبين نموذج ال RhE المقترح أنه متمايز بشكل جيد، كما هو مبين في وجود علامات التمايز والتصاق الأنسجة وتصحيحها. وعلاوة على ذلك، فإن نموذج ال RhE المقترح يظهر أنه يستجيب للمحفزات proinflammatory (أي LPS و TNF-α).
وختاما، يبين البروتوكول الحالي كيفية إنتاج الاستراتيجيات والاستراتيجيات على نحو موثوق وعلى نطاق واسع نسبيا لتلبية احتياجات الباحثين في المؤسسات الأكاديمية والخاصة على حد سواء. ويبين نموذج RhE المقترح أن له مورفولوجيا مماثلة، وتمايز البشرة، والاستجابة البيولوجية للنماذج التجارية القائمة الأخرى. ويوفر أداة بديلة لكل من المجال الصيدلاني ومستحضرات التجميل الجلدية عندما يكون الوصول إلى نموذج الجلد ذات الصلة مطلوب.

البشرة هي الطبقة الخارجية من الجلد ، في الواجهة المباشرة بين جسم الإنسان والبيئة الخارجية. وظائفها الرئيسية هي توفير الحماية والترطيب1. البشرة بمثابة حاجز مادي فعال ضد عوامل خارجية ويمنع فقدان المياه المفرط من الجسم. تعتمد وظائف الجلد هذه بشكل رئيسي على الترتيب الخلوي في الطبقات الخارجية من الجلد ، وتكوين وتنظيم الدهون بين الخلايا2. تتكون البشرة في المقام الأول من الخلايا القرنية التي تهاجر صعودا إلى الجانب الخارجي من الأنسجة وتخضع للتمايز. هناك 4-5 طبقات البشرة التي تتميز مرحلة التمايز. من الداخل إلى الخارج ، تبدأ طبقات البشرة من البشرة القابلة للحياة ، أي طبقة basale (SB) ، وطبقة سبينوسوم (SS) ، والجرانوبولوسوم الطبقي (SG) ، إلى الطبقة العليا غير القابلة للحياة ، أي الذرة الطبقية (SC)3. تتكون الطبقة القاعدية بشكل رئيسي من الكيراتينات المثرية بالكيراتين المنتشرة ، والتي تهاجر عبر SS عند التمايز4. أثناء نضوج الكيراتينوسيت، تحدث تغييرات مختلفة في التعبير عن البروتين وهيكله. الكريات الكيراتينية تلتزم من خلال تشكيل تقاطعات desmosomal5. في SG، يتم بدء جيل من الهيئات lamellar. وهي تتكون من السلائف الدهنية والإنزيمات التي تعتبر حاسمة لتشكيل وظيفة حاجز الجلد6. يتميز SG أيضا بوجود حبيبات كيراتوثيالين في السيتوبلازم في الخلايا الكيراتينية. في واجهة مع SC، يتم قذف محتوى الهيئات lamellar في المساحات بين الخلايا والدهون غير القطبية مثل سيراميد، والكوليسترول، والأحماض الدهنية الحرة تنظيم في الطبقات ثنائية الدهون الدهون لاميلار مكدسة لتشكيل مصفوفة الدهون خارج الخلية7. في SC، تفقد الخلايا جميع العضيات الخلوية بما في ذلك النواة، وذلك بسبب عمليات التدهور الأنزيمي واعتماد مورفولوجيا بالارض. وهي محاطة بمغلف قرني مصنوع من طبقات بروتينية متصلة ، ويشار إليها باسم الخلايا القرنية8،9. ترتبط مكونات Desmosomal عبر المغلف القرنية لتشكيل corneodesmosomes وربط الخلايا القرنية معا. يتم تجديد الظهارة الناتجة باستمرار من الخلايا الجذعية ، مع وقت دوران من حوالي 5-6 أسابيع10. عملية التفريق بين الخلايا القرنية ، والتي تؤدي إلى البشرة الطبقية بالكامل ، أمر بالغ الأهمية لتشكيل وظيفة الحاجز للبشرة11.
أثناء الجرح والالتهاب ، تحفز الخلايا القرنية تغييرات في جزيئات التصاق والمستقبلات السطحية وتحفز الاستجابات proinflammatory عن طريق إفراز السيتوكينات ، والكيموكينات ، والببتيدات المضادة للميكروبات12. الجلد ليس فقط حاجزا ماديا ضد المواد الخارجية. كما أنه يعمل كمستشعر مناعي عند التعرض لمسببات الأمراض. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه ينظم انتشار العديد من المواد عبر طبقاته ، مثل محتوى الماء لحماية جسم الإنسان من الجفاف. وتشارك أيضا في الجلد في تركيب فيتامين (د) ولها وظائف التمثيل الغذائي الأخرى المختلفة3,13,14.
لتقييم الآثار السلبية للمواد الخارجية، اعتمد علماء السموم لعقود على اختبار الحيوانات، ولكن في الوقت الحاضر ليس النهج المفضل. وإلى جانب محدودية القدرة التنبؤية للسمية البشرية، تنطوي النماذج الحيوانية على العديد من القضايا الأخلاقية. وقد أدى الحظر المفروض على التجارب على الحيوانات في صناعة مستحضرات التجميل والتوصية باتباع مبدأ 3R (أي الاستبدال والحد والصقل) في البحوث إلى تطوير طرق اختبار بديلة تستند إلى نهج المختبر15. وقد وصفت بالفعل أول نماذج خلايا الجلد في المختبر في 90، وتطور مثير للإعجاب من الثقافات الأحادية الكيراتينية البشرية البسيطة إلى البشرة المتمايزة تماما ونماذج سمك كامل تم تحقيقه16. في الوقت الحاضر، اكتسبت هندسة أنسجة الجلد أهمية في كل من المجالات الصيدلانية ومستحضرات التجميل الجلدية. في العقدين الماضيين، قامت العديد من الشركات بتسوية البشرة البشرية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) التي تمثل أدوات موحدة وقابلة للاستنساخ للدراسات المتعلقة بالبشرة. يتم قبول العديد من نماذج RhE التجارية لاختبار الجلد في المختبر للمواد الكيميائية وفقا للمبادئ التوجيهية لمنظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي لاختبار تهيج الجلد17،18 (أي اختبار المبدأ التوجيهي 43919)وتآكل الجلد20 (أي اختبار المبدأ التوجيهي 43121). الاختبار في المختبر للتوعية بالبشرة22 (أي، SENS-IS المقايسة) هو حاليا في مسار الموافقة وتحت استعراض الأقران23. وهناك أيضا العديد من المقايسات الأخرى التي وضعت الاستفادة من نماذج RhE التجارية، لتقييم السمية الضوئية24،لاختبار تركيبات المخدرات25،تركيبات التجميل والمكونات النشطة26، لدراسةوظيفة حاجز الجلد27 واختبار الاستجابة البيولوجية للضغوط البيئية28،29،30،31.
بالإضافة إلى نماذج الجلد ثلاثية الأبعاد المتاحة تجاريا، طورت مجموعات بحثية متعددة موديلاتها البحثيةالخاصة بها 32و33و34و35و36و37. توفر RhEs الداخلية ميزة التحكم في ظروف الثقافة وفقا لغرض الدراسة. على وجه التحديد ، يمكن للباحثين اختيار نوع ومصدر الخلايا القرنية التي ستستخدم لإعادة تشكيل نموذج البشرة ثلاثي الأبعاد (أي الأولية مقابل الخالدة ، حديثي الولادة مقابل المسنين ، والمتبرعين العشوائيين الفرديين مقابل المتبرعين العشوائيين المجمعين ، والجنس ، والعرق ، والعادات المعيشية الفردية مثل التدخين ، وما إلى ذلك). لديهم إمكانية تغيير تكوين وسط الثقافة ودمج عوامل النمو والفيتامينات أو غيرها من المركبات التي يمكن أن تعدل التعبير عن البروتينات المستهدفة أو الدهون. مع RhEs في المنزل ، يمكن للباحثين أيضا التحقيق في الاستجابات البيولوجية والخصائص الميكانيكية الحيوية كدالة لحالة التمايز للنموذج ثلاثي الأبعاد. بالإضافة إلى تلك المعلمات بديهية، وهناك جهود مستمرة لزيادة تعقيد نماذج الجلد 3D وجعلها أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية، على سبيل المثال عن طريق إضافة أنواع أخرى من خلايا البشرة (مثل الخلايا الصباغية والخلايا المناعية)38،39، عن طريق زرع الخلايا القرنية فوق مصفوفة الكولاجين المأهولة بالخلايا الليفية40،41،42، وبإضافة مكونات شبكة الأوعية الدموية43،44،45.
على الرغم من أنه من الممكن ضبط ظروف الثقافة وفقا لاحتياجات محددة، هناك معايير يجب احترامها لضمان جودة وأهمية ال RhE. لزراعة أنسجة RhE ، يتم بذر خلايا القرنية البشرة البشرية العادية (NHEKs) في إدراج ثقافة نفاذية محددة يفصل غشاءها الاصطناعي المسامية الآبار إلى مقصورتين ، أي المقصورة apical و basolateral. المسامية من الغشاء (أي حجم المسام من 0.4 ميكرومتر) هو من هذا القبيل أنه يسمح لتشكيل أحادي الطبقة الخلية في المقصورة apical مع عدم وجود هجرة الخلايا إلى الجانب إدراج القاعدية، وتغذية الخلايا القرنية مع المواد الغذائية الأساسية من وسط الثقافة الواردة في المقصورة القاعدية. في بداية عملية إعادة التشكيل ، يتم استزراع NHEKs في ظروف مغمورة لبضعة أيام للسماح بالالتصاق بها على الغشاء. يتم زيادة مستوى الكالسيوم في كلا المقصورتين مقارنة بتركيز الكالسيوم المستخدم في الثقافة 2D من NHEKs لإبطاء انتشار الخلايا وتعزيز بدلا من ذلكتمايزها 46. تدرج الكالسيوم البشرة ضروري لتنظيم تشكيل الحاجز و التوازن47،48. ارتفاع مستويات الكالسيوم (أي ما يصل إلى 1.5 مليون متر) تعزيز تشكيل تقاطعات بين الخلايا وتعديل تشكيل المغلف المحقن خلال التمايز محطة49. مرة واحدة الخلايا القرنية تشكل أحادية مستمرة وملتصقة بإحكام على الغشاء الداعم، تتم إزالة المتوسطة من المقصورة apical وتستمر عملية الثقافة في واجهة الهواء السائل (ALI) لتحفيز الطبقية وإنشاء حاجز البشرة50،51. شروط ثقافية محددة حاسمة للحصول على ظهارة طبقية بالكامل36. خلال عملية إعادة التشكيل في ALI ، يتم استكمال الوسط في المقصورة القاعدية بعامل نمو الكيراتينوسيت (KGF) والأنسولين والكالسيوم وحمض الأسكوربيك. حمض الأسكوربيك يلعب دورا رئيسيا في تشكيل حاجز الدهون SC المناسبة، تشبه إلى حد كبير أن من الجلد البشري الأصلي52. الخلايا الكيراتينية التي تزرع في الوسط المكمل بحمض الأسكوربيك تظهر النمط الظاهري المتمايز ، مع عدد معزز من حبيبات الكيراتوثيالين ، وكذلك lamellae الدهنية بين الخلايا المنظمة في فترة ما بين خلايا القرنية52. مثل هذا التكميل ضروري لتحسين وظيفة حاجز البشرة عن طريق زيادة محتوى المغلف المحقن وتجنب استنفاد مخازن مضادات الأكسدة الهيدروفيلية53،54. يستخدم KGF ، وهو وسيط الباراكورين مهم لانتشار البشرة والتمايز ، لتحفيز NHEKs55.
وتشمل الجوانب السلبية الرئيسية ل RhEs الداخلية فقدان التوحيد القياسي بين مؤسسات البحث وزيادة كثافة اليد العاملة واستهلاك الوقت (ما يصل إلى 3 أسابيع مقارنة بالنماذج التجارية الجاهزة للاستخدام). والهدف من هذه الورقة هو معالجة هذه العيوب، ووضع أساس للإنتاج على نطاق أوسع. وبالإضافة إلى المزايا المذكورة أعلاه للفوائد الداخلية للملوثات المضادة للانسان، يهدف البروتوكول الحالي إلى الحد من التباين داخل الأنسجة وفيما بينها، والحد من مخاطر التلوث، وتبسيط عملية الزراعة.
يصف البروتوكول الحالي طريقة قابلة للاستنساخ وقوية لزراعة الريس باستخدام NHEKs حديثي الولادة. وعلاوة على ذلك، فإنه يظهر نتائج تمثيلية لتوصيف مورفولوجيا ريس، سلامة الحاجز، والتعبير عن البروتينات التي هي محددة لتمايز البشرة. تم فحص بنية مورفولوجية RhEs باستخدام الهيماتوكسيلين والإيوسين (H &amp؛ E) تلطيخ ونقل المجهر الإلكتروني (TEM). لتقييم سلامة الحاجز، تم قياس المقاومة الكهربائية عبر الحدود (TEER) ووقت التعرض ل Triton X-100 لتقليل 50٪ من صلاحية الأنسجة (ET50). تم تحليل تشكيل تقاطعات desmosomal (أي desmoglein 1) عن طريق immunofluorescence (IF) لتقييم التصاق الكيراتينية. تم تقييم تكوين البروتينات الهيكلية البشرة (أي إنفولوكرين، لوريكورين، وفيلاغرين) والكشف مع IF. وتشارك هذه البروتينات في تشكيل مغلف البروتين عبر المرتبطة للغاية التي تحيط الخلايا القرنية SC ونتيجة لذلك هي علامات هامة للتمايز البشرة في مرحلة متأخرة56,57. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام IF لتحليل الكيراتين 10، وهو بروتين مستحث في الخلايا المتمايزة في المراحل المبكرة في SS58 ووجد داخل جميع الطبقات المتمايزة. وأخيرا، تم التحقيق في استجابة RhE للمحفزات proinflammatory (أي، شحم الدهون وعامل نخر الورم ألفا). تم قياس مستويات إنترلوكين 1 ألفا (IL-1α) وإنترلوكين 8 (IL-8) في وسائل الإعلام ثقافة الخلية، وذلك باستخدام المقايسات المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Acetic acid</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >A6283</td>
			<td >Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibiotic-antimycotic (100x)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aqueous Eosin Y solution</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >HT110280</td>
			<td >Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td >Sigma Aldrich or Merck</td>
			<td>C8106 or 1.02378.0500</td>
			<td >Prepare a stock solution of 0.144 M, filter sterilize and store aliquots at -20 &#176;C.&#160; It is recommended to prepare new aliquots every 6 months.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>Prepare a stock at 100 &#956;g/mL and store aliquots at -20 &#176;C. Working conditon is 1 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Entellan mounting medium</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.07960.0500</td>
			<td>Mounting medium for H&#38;E staining.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EpiLife medium (referred to as keratinocyte growth medium)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>MEPI500CA</td>
			<td >Contains 0.06 mM of Ca2+.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol absolute</td>
			<td >Any supplier</td>
			<td >N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formalin 10%</td>
			<td >Leica Biosystems</td>
			<td >3800770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human keratinocytes growth supplement (HKGS) (100x)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>S0015</td>
			<td >To reach final concentrations of 0.2% [v/v] BPE, 0.2 ng/mL human recombinant EGF, 0.18 &#956;g/mL hydrocortisone,5 &#956;g/mL bovine transferrin, and 0.01 &#181;g/mL human recombinant insulin-like growth factor-I.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropanol</td>
			<td >Biosolve B.V.</td>
			<td >0016264102BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kaiser&#39;s glycerol gelatine, phenol-free</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.08635.0100</td>
			<td>Mounting medium for IF staining.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Keratinocyte growth factor (KGF)</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG-050</td>
			<td >Reconstitute KGF protein at 100 &#956;g/mL in sterile 0.1% [w/v] BSA in PBS. Prepare aliquots and store at -20&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lactate dehydrogenase (LDH) assay kit</td>
			<td >Roche</td>
			<td >4744926001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td >Prepare a stock solution of 25 mg/mL, filter sterilize and store aliquots at -20&#176;C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. Store in the dark.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lipopolysaccharide (LPS), E.coli strain O55:B5</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >L4524</td>
			<td >Prepare a stock of 1 mg/mL in sterile PBS and store aliquots at -20 &#176;C. Working concentration is 100 &#956;g/mL.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mayer&#8217;s Haematoxylin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >MHS80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs)</td>
			<td >Lonza</td>
			<td>00192906</td>
			<td >Human primary keratinocytes isolated from neonatal foreskin, pooled from at least three donors.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10010056 or 10010-015</td>
			<td >Reference numbers can vary between countries.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;)</td>
			<td >ImmunoTools</td>
			<td >11344483</td>
			<td>Prepare a stock of 100 &#956;g/mL in sterile ultrapure water. Working concentration is 40 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile ultrapure water</td>
			<td >Any supplier</td>
			<td >N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M5655</td>
			<td>Prepare a stock of 5 mg/mL MTT in sterile PBS. Working concentration is 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>93426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan blue (0.4% [v/v])</td>
			<td >Any supplier</td>
			<td >N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin inhibitor</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>R007100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA (0.05% [v/v])</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tween 20</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylene</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab150113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tri-sodium citrate dihydrate</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.06448.0500</td>
			<td>For antigen retrieval buffer for IF staining.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Dylight 488)</td>
			<td >Agrisera</td>
			<td>AS09 633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filaggrin Mouse antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP2-53243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Involucrin Rabbit antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP2-33742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Keratin 10 Mouse antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP2-32962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Desmoglein-1 Mouse antibody&#160;</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>MAB944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Loricrin Rabbit antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP1-33610</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivating a three-dimensional reconstructed human epidermis at a large scale

يتم تقديم نموذج البشرة البشري ثلاثي الأبعاد المعاد بناؤه من خلايا القرنية الأولية الوليدية. وفي هذا الهنا، وصف بروتوكول لعملية الزراعة وتوصيف النموذج. تزرع الخلايا الكيراتينية الأولية الوليدية مغمورة على إدراجات البولي نفاذية ورفعها إلى واجهة الهواء السائل بعد ثلاثة أيام من البذر. بعد أربعة عشر يوما من التحفيز مع عوامل النمو المحددة وحمض الأسكوربيك في المتوسطة ثقافة الكالسيوم عالية, يتم تمييز النموذج تماما. كشف التحليل النسيجي عن بشرة طبقية بالكامل ، تحاكي مورفولوجيا الجلد البشري الأصلي. لتوصيف النموذج ووظائف حاجزه، تم تقييم مستويات البروتين وتوطين محددة لتمايز الكيراتينوسيت في المراحل المبكرة (أي الكيراتين 10)، والتمايز في المراحل المتأخرة (أي الإنفولوكورين واللوريكرين والفيلاغرين) والالتصاق بالأنسجة (أي desmoglein 1)، عن طريق الفلورة المناعية. تم تقييم سلامة حاجز الأنسجة بشكل أكبر من خلال قياس المقاومة الكهربائية عبر الإبط. كان البشرةالبشرية المهيكلة بيئيا مستجيبا للمحفزات البروينفلامية (أي شحم الدهون وعنصر نخر الورم ألفا)، مما أدى إلى زيادة إطلاق السيتوكين (أي إنترلوكين 1 ألفا وإنترلوكين 8). يمثل هذا البروتوكول طريقة مباشرة وقابلة للاستنساخ في المختبر لزراعة البشرة البشرية المعاد بناؤها كأداة لتقييم الآثار البيئية ومجموعة واسعة من الدراسات المتعلقة بالبشرة.

NHEKs المستزرعة في 2D عرض مورفولوجيا التقليدية مع شكل مضلع متسقة(الشكل 2A). كما هو موضح أعلاه، يتم زرع NHEKs في إدراج الثقافة بعد الوصول إلى التقاء ما يقرب من 80٪. تم تحليل مورفولوجيا RhEs باستخدام تلطيخ H &amp؛ E وTEM. بعد 15 يوما في ALI ، يتم الحصول على نسيج طبقي بالكامل كما هو مبين في طبقات البشرة الرئيسية الأربع: SB ، وSS ، وSG ، وSC (الشكل 2B). في طبقة SB، يكون للخلايا شكل عمودي. من الطبقة الثانية باتجاه الطبقات العليا من RhE ، تميز NHEKs كما لوحظ من خلال التغيرات في مورفولوجيا الخلية (من شكل عمودي في طبقة SB ، نحو شكل مغزلي في طبقة SS). في طبقة SG ، يكون للخلايا شكل أكثر تسطيحا وتعرض حبيبات كيراتوالين (KG) التي يتم تمثيلها كنقاط أرجوانية في السيتوبلازم. يتم تمييز شكلها المستدير النجمي المميز بواسطة الأسهم البيضاء على صورة H &amp؛ E(الشكل 2C). الخلايا في SC، هي متمايزة بشكل نهائي وسويت تماما وتفتقر إلى نواة الخلية. و RhEs الطبقية لديها سمك إجمالي 84.3 ± 2.4 ميكرومتر وسمك SC لها من 19.6 ± 3.2 ميكرومتر (الشكل 2D). وهذه القيم مماثلة لتلك المبلغ عنها للبشرة البشرية الأصلية، أي 60-120 ميكرومتر و10-20 ميكرومتر، على التوالي69. عدد الطبقات القابلة للحياة هو 6-7 ، وهو أقل مقارنة ببشرة الإنسان الأصلية ، حيث يبلغ حوالي 7-1470. التحليل Ultrastructural من RhEs في نقاط زمنية مختلفة في بروتوكول إعادة تشكيل (أي 7 و 10 و 13 و 15 يوما) يكشف عن عملية تطويع الريس مع زيادة عدد طبقات الخلايا القرنية مع مرور الوقت(الشكل 2E). بعد 15 يوما في ALI ، يتكون SC من أنسجة RhE من حوالي 15-25 طبقة ، وهو ما يماثل القيمة المبلغ عنها للبشرة البشرية الأصلية (أي 15-20 طبقة)69.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig2v2.jpg"> الشكل 2: الخلايا القرنية الأولية والبشرة البشرية المعاد بناؤها. (A) صورة المجهر على النقيض من المرحلة من الخلايا القرنية الأولية قبل البذر على إدراج. شريط مقياس هو 50 ميكرومتر(B-C) H &amp؛ E صورة المجهر حقل مشرق من RhE. شريط المقياس هو 50 ميكرومتر (ب) و 25 ميكرومتر (C). (د)تحديد كمية سمك RHE وSC (متوسط ± SEM، n = 3). (E) صور المجهر الإلكتروني انتقال المقاطع العرضية RhE بعد 7, 10, 13, و 15 أيام في ALI. مقياس الشريط هو 4 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig2v2large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
وفقا لمرحلة التمايز ، تظهر NHEKs المتنامية في 3D ملامح تعبير البروتين المختلفة وفقا لمرحلة التفريق. تم تحديد التعبير عن البروتينات المحددة لتمايز الكيراتينوسي في المراحل المبكرة (أي الكيراتين 10) ، وتمايز الكيراتينوسي في مرحلة متأخرة (أي involucrin و loricrin و filaggrin) ، والالتصاق بالخلايا القرنية (أي desmoglein 1) في RhEs باستخدام IF تلطيخ. يظهر تعبير Involucrin أكثر في الغالب في طبقة SG منذ أن بدأ تعبيره في وقت سابق خلال عملية التمايز(الشكل 3D)، في حين يتم التعبير عن الفيلاغرين واللوريكرين في الطبقات العليا (الشكل 3B- C). تم العثور على تعبير الكيراتين 10 في جميع الطبقات القابلة للحياة ، باستثناء طبقة SB(الشكل 3E). عرض RhEs تقاطعات desmosomal وظيفية، كما هو مبين في التعبير عن desmoglein 1 في الفضاء بين الخلايا من طبقات البشرة قابلة للحياة (الشكل 3F). وختاما، يتم التعبير عن جميع العلامات الخمسة وتقع في طبقات البشرة المناسبة وتترجم إلى عملية تمايز البشرة الصحية.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig03.jpg"> الشكل 3:تمايز البشرة، التصاق الأنسجة، وسلامة الأنسجة من البشرة البشرية المعاد بناؤها. (A) H &amp؛ E صورة المجهر حقل مشرق من RhE. صور المجهر الفلوري Confocal من (ب) filaggrin (FLG) ،(C)لوريكورين (لور) ،(د)involucrin (INV) ،(ه) الكيراتين 10 (K10) ، و (F) desmoglein 1 (DSG-1) ممثلة في أرجواني. يتم تمثيل تلطيخ النوى (DAPI) باللون الأزرق. مقياس الشريط هو 25 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
تم التحقيق في خصائص الحاجز لنموذج RhE من خلال تقييم كل من صلاحية الأنسجة وسلامتها. تم تحديد سلامة الأنسجة بعد 15 يوما عن طريق قياس TEER باستخدام مقياس فولتوهمتر. 2567 ± 415 Ω.cm2 القيم المسجلة لRhEs ترجمة تشكيل حاجز مستمر(الشكل 4A). هذه القيم هي في نطاق مع تلك التي ذكرت لنماذج RhE71،72،73،74. بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد وقت التعرض المطلوب للمواد الكيميائية المرجعية السامة للخلايا (أي تريتون X-100) للحد من صلاحية الأنسجة بنسبة 50٪ (ET50)مع فحص بروميد رباعي الزيوم الأزرق الثيازوليل (MTT). وكانت قيمة ET50 التي تم قياسها ل RhE 2.1 ساعة. تقع هذه القيمة ضمن نطاق القبول لنماذج البشرة ثلاثية الأبعاد الأخرى المؤهلة للتنبؤ الموثوق بتصنيف التهيج (المبدأ التوجيهي لمنظمة التعاون الاقتصادي والتنمية 439)19.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig4v3.jpg"> الشكل 4:خصائص الحاجز للبشرة البشرية المعاد بناؤها. (أ) سلامة الأنسجة مقاسة بمقاومة كهربائية عبر الإبط (متوسط ± SEM، n=6). (ب)ET50 يحدده قياس صلاحية الأنسجة (أي، MTT المقايسة) عند التعرض الموضعي ل78.3 ميكرولتر من 1٪ تريتون X-100 (متوسط ± SEM، ن = 3).
تم التحقيق في استجابة RhEs بناء على محفزات proinflammatory المعروفة. وعولجت الريس بشكل منهجي، أي إضافة المحفزات في وسط المقصورة القاعدية، باستخدام 100 ميكروغرام/مل إيشريشيا كولاي ليبوبوليسيساكاريد (LPS) و40 نانوغرام/مل عامل نخر الورم ألفا (TNF-α). بعد 24 ساعة من المحفزات، تم جمع وسيط ثقافة الخلية. تم قياس السمية الخلوية باستخدام مقايسة ديهيدروجيناز اللاكتات (LDH) وبالمقارنة مع قيم معرقل الغشاء المعروف ، المنظفات Triton X-100(الشكل 5). زيادة كبيرة (ص < 0.05، ANOVA في اتجاه واحد، اختبار مقارنة متعددة دونيت) وقد تبين في نشاط LDH في RhEs تعامل مع تريتون X-100. أظهرت كل من LPS وعلاجات TNF-α عدم السمية الخلوية.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig5v3.jpg"> الشكل 5:السمية الخلوية التي تقاس عن طريق فحص ديهيدروجيناز اللاكتات (LDH). وتقدم البيانات كقيم نسبية للسيطرة، والأنسجة غير المعالجة (CTRL)؛ متوسط ± SEM، n=9 (Triton X-100)، n=8 (LPS)، n=3 (TNF-α). تم اختبار الأهمية مع ANOVA في اتجاه واحد ، اختبار مقارنة دونيت المتعدد. النجمة يدل على اختلاف مهم إحصائيا بالمقارنة مع CTRL، ****p < 0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig5v3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
تم تحديد كمية إطلاق إنترلوكين 1 ألفا (IL-1α) وإنترلوكين 8 (IL-8) في وسط RhE باستخدام ELISAs. ويبين الشكل 6 كلا من إطلاق ال RHEs لل IL-1α وIL-8 المحددين والنسبيين عند التحدي باستخدام LPS و TNF-α. أدى علاج LPS إلى إطلاق سراح مستحث من IL-8 (9.6 ± زيادة 1.0 أضعاف) وIL-1α (زيادة 2.7 ± 1.3 مرة) ذات دلالة إحصائية (p < 0.05، اختبار T للطالب غير المدفوع). لم يحدث α TNF إطلاق IL-8 بشكل كبير ، على الرغم من ملاحظة ميل لزيادة مستويات IL-8 (زيادة 2.3 ± 0.8 أضعاف). ومع ذلك ، لم TNF - α بشكل كبير (ص < 0.05 ، غير مدفوعة الأجر الطالب تي اختبار) الزناد IL - 1α الافراج (1.8 ± 0.5 أضعاف الزيادة).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig6v3.jpg"> الشكل 6: استجابات Proinflammatory في البشرة البشرية التي أعيد بناؤها. تركيزات IL-8 الإفراج عن طريق RhE على التحدي 24 ساعة مع LPS (أ) و TNF-α (ب). يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط ± SEM، n = 8 (LPS)، n = 3 (TNF-α). (ج)يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط القيمة النسبية مقارنة بالتحكم، والأنسجة غير المعالجة (CTRL) ± SEM، n=8 (LPS)، n=3 (TNF-α). تركيز IL-1α الإفراج عن RhE على التحدي 24 ساعة مع LPS (D) و TNF-α (E). يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط ± SEM، n = 8 (LPS)، n = 3 (TNF-α). (F)يتم تمثيل البيانات على أنها متوسط القيمة النسبية مقارنة ب CTRL ± SEM، n = 4 (LPS)، n = 3 (TNF-α). تم اختبار الأهمية من خلال اختبار T للطالب غير المدفوع الأجر. النجمة يدل على اختلافات ذات دلالة إحصائية بالمقارنة مع CTRL، * ص < 0.05، ****p < 0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig6v3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale at JoVE.com

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

يصف هذا البروتوكول طريقة مباشرة لزراعة البشرة البشرية ثلاثية الأبعاد المعاد تشكيلها بطريقة قابلة للاستنساخ وقوية. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يميز العلاقة بين هيكل وظيفة من نموذج حاجز البشرة. كما يتم تقديم الاستجابات البيولوجية للبشر المعاد تشكيلها على المحفزات النهمة.

زراعة بشرة بشرية ثلاثية الأبعاد أعيد بناؤها على نطاق واسع

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

في المختبر أو شيدت نموذج البشرة البشرية وضعت لأول مرة في التسعينات بهدف أساسي لتطوير طرق اختبار بديلة للتجارب الحيوانية. هذه النماذج البشرة 3D تستخدم الآن عادة لاختبار كل من سلامة وفعالية المكونات التجميلية. في حين أنه يمكن شراؤها من العديد من موردي الأنسجة، والقدرة على إعادة تشكيل نموذج 3D في المختبر يعطي المزيد من المرونة إلى نقطة النهاية من الاهتمام.هناك العديد من المقالات البحثية التي تصف بإيجاز بروتوكول إعادة تشكيل نموذج البشرة ثلاثي الأبعاد ، ولكن لم يكن هناك ، حتى الآن ، أي فيديو متاح يظهر الخطوات الحاسمة لعملية إعادة التشكيل. هذا هو السبب وراء نشر هذه الورقة الفيديو. إعداد البشرة البشرية التي أعيد بناؤها في المنزل يسمح بالكثير من الحرية في عملية زراعة الطبيعة ، مثل التغييرات في التركيب المتوسط للثقافة ، ومشغلات الإجهاد المؤيدة للالتهابات أو التأكسدية ، وإسكات الجينات ذات الاهتمام ، وتثبيط أو تحفيز بعض العمليات البيولوجية.للبدء، إذابة قارورة مع 1 مليون كريات القرنية البشرة البشرية المحفوظة بالتبريد، أو NHEKs، في حمام مائي في 37 درجة مئوية عن طريق غمر جزء من القارورة في الماء. احتضان القارورة لمدة دقيقة إلى دقيقتين في حمام الماء، حتى فقط قطعة صغيرة من الجليد مرئية. Resuspend الخلايا بعناية فائقة عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا مرتين إلى ثلاث مرات.نقل تعليق الخلية إلى قارورتين T75 تحتوي على ما مجموعه 15 ملليلتر من وسيط ذوبان حذر مسبقا، مما أدى إلى كثافة البذر من 6.7 مرات 10 إلى الخلايا الرابعة لكل سنتيمتر مربع. ملء ما قبل 24 لوحات البئر مع 1.5 ملليلتر من المتوسط المغمورة، وذلك من الناحية المثالية باستخدام ماصة موزع. بعد زراعة الخلايا إلى التقاء 80٪، فهي جاهزة للبذر في إدراج لزراعة البشرة البشرية المعاد بناؤها، أو RHEs.إزالة الوسط القاعدي من قوارير T75 مع NHEKs. شطف الخلايا عن طريق إضافة خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني قبل الحارة إلى كل قارورة T75، ثم إزالة برنامج تلفزيوني من القوارير. إضافة 2 إلى ثلاثة ملليلترات من 0.05٪ تريبسين-EDTA pre-warmed إلى كل قارورة، مع التأكد من أن يتم توزيع حل التريبسين بالتساوي على منطقة ثقافة الخلية من القارورة.ضع القوارير في حاضنة ثقافة الخلية لمدة أربع دقائق ، ثم تحقق مما إذا كانت الخلايا تنفصل باستخدام المجهر عند تكبير 10 X. الراب قارورة لمساعدة الخلايا على الافراج عن سطح القارورة. بمجرد فصل جميع الخلايا، أضف حجما متساويا من مثبط التريبسين الذي تم تسخينه مسبقا إلى كل قارورة T75، ونقل تعليق الخلية من القوارير إلى أنبوب طرد مركزي.شطف قوارير مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني قبل الحارة ونقله إلى أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على تعليق الخلية. الطرد المركزي الخلايا التي تم حصادها في 400 مرة G لمدة خمس دقائق. تجاهل بعناية معظم supernatant ترك ما يقرب من 100 إلى 200 ميكرولتر في الأنبوب.نفض الغبار بلطف أنبوب مع أصابعك لتخفيف بعناية بيليه. إعادة إنفاق بيليه الخلايا بلطف في حجم منخفض من المتوسط المغمورة، pipetting صعودا وهبوطا 5 إلى 10 مرات لضمان تعليق الخلية موحدة. ابدأ بحجم منخفض لتجنب تكوين مجاميع الخلايا، وأضف ما يصل إلى ملليلتر واحد من المتوسط المغمور لكل قارورة T75 أولية.عد الخلايا في التعليق باستخدام طريقة استبعاد الأزرق تريبان. تمييع تعليق الخلية مع وسيطة مغمورة إضافية للوصول إلى تركيز 3.525 × 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر ، وذلك باستخدام المعادلة الأولى الواردة في مخطوطة النص. قم بإجراء تعداد خلية ثاني للمحلول المخفف واستخدم المعادلة الثانية في المخطوطة النصية لحساب حجم تعليق الخلية ليتم زرعه في إدراج الثقافة.تعليق إدراج ثقافة البئر 24 في أعلى موقف من لوحة الناقل، ونقل لوحة الناقل إلى لوحة البئر 24 مليئة مسبقا مع المتوسط المغمورة. أضف الحجم المحدد لتعليق الخلية إلى كل إدراج، مع الحرص على عدم لمس الإدراج. بعد البذر، احتضان 24 لوحة بئر لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للتغلب على تأثير الحافة.لا تحرك اللوحات خلال هذا الوقت. نقل لوحات إلى حاضنة ثقافة الخلية، وتركها في ظروف مغمورة لمدة ثلاثة أيام. بعد حضانة لمدة ثلاثة أيام في حاضنة ثقافة الخلية ، يعرض الخلايا التي التزمت بسطح الغشاء إلى واجهة سائل الهواء ، أو ALI ، عن طريق إزالة الوسط المغمور من المقصورة apical مع نظام الطموح وماصة باستور زجاجية.ملء لوحات جديدة 24 بئر مع 1.5 ملليلتر من المتوسطة ALI الطازجة قبل الحارة، ونقل لوحات الناقل مع إدراج الثقافة إلى لوحات جديدة متعددة الآبار. نقل لوحات متعددة الآبار مرة أخرى إلى حاضنة ثقافة الخلية. تحديث المتوسطة ALI كل يومين إلى ثلاثة أيام، لمدة 14 يوما.الخلايا الكيراتينية في الثقافة ثنائية الأبعاد تعرض مورفولوجيا تقليدية ذات شكل مضلع متسق. بعد 15 يوما في ALI ، تشكل البشرة البشرية المعاد بناؤها نسيجا طبقيا بالكامل ، والذي يشار إليه بطبقاته الأربع الرئيسية. يكشف التحليل الهيكلي الفائق للبشرة البشرية المعاد بناؤها في نقاط زمنية مختلفة في بروتوكول إعادة التشكيل عن عملية القرنية ، مع زيادة عدد طبقات موقع القرنية بمرور الوقت.تظهر الكريات الكيراتينية في البشرة ملامح تعبير بروتين مختلفة وفقا لمرحلة التفريق. يظهر تعبير Involucrin بشكل أكثر غلبة في طبقة SG ، في حين يقع تعبير الفيلاغرين واللوريكرين في الطبقات العليا. تم العثور على تعبير الكيراتين-10 في جميع الطبقات القابلة للحياة باستثناء طبقة SB.يعرض البشرة البشرية المعاد بناؤها تقاطعات ديسسومال وظيفية ، كما هو مبين في تعبير Desmoglein-1 في الفضاء بين الخلايا للطبقات البشرة القابلة للحياة. تم التحقيق في خصائص الحاجز لنموذج البشرة المعاد بناؤه من خلال تقييم صلاحية الأنسجة عند العلاج الموضعي مع تعطيل حاجز معروف ، وتقييم سلامة الأنسجة. تم تحديد سلامة الأنسجة بعد 15 يوما عن طريق قياس TEER مع فولتميتر.تم التحقيق في استجابة البشرة لليبوبوليساكريد وعامل نخر الورم ألفا. وكانت كل من LPS والعلاجات ألفا TNF غير سامة. بالنسبة إلى عنصر تحكم تريتون X-100.تم تحديد كمية إطلاق إنترلوكين-1 ألفا وإنترلوكين-8 في وسط RHE باستخدام تحلل IL. أدى علاج LPS إلى تنظيم تنظيمي مهم إحصائيا في إصدار إنترلوكين-1 ألفا وإنترلوكين-8. أدى العلاج ألفا TNF في تنظيم أعلى ذات دلالة إحصائية في الافراج فقط من انترلوكين-1 ألفا.ومع ذلك، لوحظ أيضا ميل واضح لزيادة مستويات إنترلوكين-8 عند التحفيز مع TNF ألفا. باتباع هذا البروتوكول، يمكن قياس TEER كقيمة لسلامة الحاجز. يمكن قياس قابلية البقاء أو السمية الخلوية بواسطة اختبار MTT أو LDH ، على سبيل المثال.يمكن استخدام الناتنات لقياس إفراز السيتوكينات أو البروتينات الأخرى. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الأنسجة لدراسة التعبير عن البروتينات أو الجينات ذات الاهتمام.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Bioengineering

Unit 1

The Integumentary System

SCIENTISTS IN ACTION

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

ألجينات الهلاميات المائية للثقافة الجهاز ثلاثي الأبعاد من المبيضين وناقلة البيضات

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

الجلد ثلاثي الأبعاد إعادة بناء الإنسان النموذجي : أداة لدراسة بشرة العادية والتقدم الميلانوما

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

مستو وثلاثي الابعاد من أحبار الطباعة موصل

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

الغضروف الإنسان الأنسجة التصنيع باستخدام ثلاثي الأبعاد تكنولوجيا الطباعة النافثة للحبر

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

تحليل الهجرة خلية داخل الكولاجين مصفوفة ثلاثية الأبعاد

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

الاستنساخ واسع النطاق إنتاج ذات قدرة عالية ناقلات الفيروسة الغدانية استنادا إلى نوع اتش 5 الإنسان

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

ثلاثي الأبعاد تكنولوجيا المحاكاة البيولوجية: رواية Biorubber يخلق معرف الصغرى، وعلى نطاق والماكرو-البنى في الكولاجين الهلاميات المائية

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

إعداد وتحليل<em&gt; في المختبر</em&gt; ثلاثة الثدي الأبعاد سرطان البدائل

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

تطوير عضوي نموذج متعددة الخلايا ثلاثي الأبعاد من الأمعاء الغشاء المخاطي الإنسان نمت في ظل الجاذبية

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

منصة مختبر علي القرص المضغوط لتوليد خزان ثلاثي الابعاد متعدد الخلايا

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...