Name: cultivating a three-dimensional reconstructed human epidermis at a large scale
Uploaded: 2021-05-28T13:30:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale at JoVE.com

EU's Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskuddet med tilskudsaftalen nr. 765602 finansieret dette arbejde. Alle forfattere anerkender støtte fra Adolphe Merkle Foundation og University of Ferrara og taknemmeligt anerkende Dow Silikone Belgien. Dr. Miguel Spuch-Calvar er anerkendt for at forberede de grafiske billeder af RhE dyrkningsprocessen. Forfatterne takker Dr. Barbara Drasler, Dr. Franco Cervellati, og Dr. Agnès Tessier for deres tekniske støtte og diskussioner.

Gennemgå og hold dig til nationale og internationale etiske overvejelser og betingelser i forbindelse med brugen af humane væv eller celler, før du planlægger og udfører nogen forskningsaktiviteter, der involverer denne protokol. BEMÆRK: Alle trin i denne protokol skal udføres under aseptiske forhold. Praksis på biosikkerhedsniveau 2 er minimumskravet til dyrkning af rhe.er. Alle nødvendige sikkerhedsforanstaltninger skal træffes ved håndtering af de kemikalier/reagenser, der er beskrevet i denne protokol.
1. Forberedelse af cellekultur medier
BEMÆRK: Der anvendes tre forskellige typer serumfrie dyrkningsmedier til dyrkning af rhes (tabel 1): i) det basale medium med lavt calciumniveau (60 μM Ca2+),der anvendes til NHEKs 2D-dyrkning; ii) det nedsænkede medium med højt calciumniveau (1,5 mM Ca2+),der anvendes til såning af NHEKs i cellekulturens skærsystem og iii) luftvæskemediet (ALI) med højt calciumniveau (1,5 mM Ca2+),ascorbinsyre og keratinocytvækstfaktor (KGF).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Medium</td>
			<td>Mellemstore oplysninger</td>
			<td>Påkrævet antal</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Basalt medium</td>
			<td>Keratinocyte vækstmedium</td>
			<td rowspan="3">36 mL/24 brønde</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] HKGS</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] 100x antibiotika-antimycotisk</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Nedsænket medium</td>
			<td>Keratinocyte vækstmedium</td>
			<td rowspan="4">36 mL/24 brønde</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] HKGS</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] 100x antibiotika-antimycotisk</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1,5 mM Ca2+
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">Luft-flydende interface medium</td>
			<td>Keratinocyte vækstmedium</td>
			<td rowspan="6">216 mL/24 brønde</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] HKGS</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] 100x antibiotika-antimycotisk</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1,5 mM Ca2+
</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 50 μg/mL ascorbinsyre</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 10 ng/mL keratinocyte vækstfaktor</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. Sammenfattende tabel over de forskellige kultur medier, der anvendes til at dyrke RhEs. Liste over forskellige kultur medier med kosttilskud.
<ol><li>Forbered det basale medium.<ol>
<li>Suppler flasken med 500 ml keratinocytvækstmedium (Tabel over materialer) med 5 ml humane keratinocytvæksttilskud (HKGS) for at nå endelige koncentrationer på 0,2% [v/v] kvæggrav ekstrakt (BPE), 0,2 ng/mL human rekombinant epidermal vækstfaktor (EGF), 0,18 μg/mL hydrocortison, 5 μg/mL kvægoverførselrin og 0,01 μg/mL rekombinant human insulinlignende vækstfaktor-I (IGF-I).</li>
		<li>Der tilsættes 5 ml 100x antibiotisk antimykotisk opløsning indeholdende 10.000 enheder/mL penicillin, 10.000 μg/ml streptomycin og 25 μg/mL amphotericin B.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forbered det nedsænkede medium.<ol>
<li>Suppler flasken med 500 ml keratinocytvækstmedium (Tabel over materialer) med 5 ml HKGS for at nå de endelige koncentrationer på 0,2% [v/v] BPE 0,2 ng/mL human rekombinant EGF, 0,18 μg/mL hydrocortison, 5 μg/mL kvægoverførselrin og 0,01 μg/mL human rekombinant IGF-I.</li>
		<li>Der tilsættes 5 ml 100x antibiotisk antimykotisk opløsning.</li>
		<li>Der tilsættes 5 ml af en 0,144 M CaCl2 (calciumchlorid) stamopløsning for at opnå en endelig koncentration på 1,5 mM Ca2+. BEMÆRK: Calciumkoncentrationen øges allerede i den neddykkede fase for at stimulere differentieringen af keratinocytterne og indlede stratificeringsprocessen49.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forbered det luft-flydende interface (ALI) medium.<ol>
<li>Supplere en flaske keratinocytvækstmedium(materialetabel)på 5 ml HKGS med henblik på at nå de endelige koncentrationer på 0,2% [v/v] BPE 0,2 ng/mL human rekombinant EGF, 0,18 μg/mL hydrocortison, 5 μg/mL kvægoverførselrin og 0,01 μg/mL human rekombinant IGF-I.</li>
		<li>Der tilsættes 5 ml 100x antibiotisk antimykotisk opløsning.</li>
		<li>Der tilsættes 5 ml af en 0,144 M CaCl2-stamopløsning for at nå en endelig koncentration på 1,5 mM Ca2+.</li>
		<li>Der tilsættes 1 ml af en ascorbinsyreopløsning på 25 mg/mL for at opnå en endelig koncentration på 50 μg/mL ascorbinsyre.</li>
		<li>Der tilsættes 50 μL af en 100 μg/mL KGF i 1% [w/v] kvægserumalbumin i fosfat-buffered saltvandsopløsning (PBS) for at opnå en endelig koncentration på 10 ng/mL KGF. BEMÆRK: Da ascorbinsyre er følsom over for oxidation, anbefales det at anvende en stabil ascorbinsyrederivat, såsom magnesium l-ascorbyl-2-fosfat59 eller L-ascorbinsyre 2-fosfat sesquimagnesium60. Hvis der anvendes ascorbinsyre, anbefales det at supplere ALI-mediet med ascorbinsyre frisk før hver opdatering.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Kultur NHEKs
BEMÆRK: Da primære humane keratinocytter forbliver proliferative ved deres fjerde eller femte passage61, anvendes NHEKs i deres tredje passage til dyrkning af rhes. Primære keratinocytter bør håndteres meget omhyggeligt på grund af deres høje følsomhed. Omhyggelig og langsom pipettering af celleaffjedringer til enhver tid er meget vigtigt for ikke at forstyrre cellernes tilstand.
<ol><li>Tø et hætteglas med 1 x 106 kryopreserverede NHEL'er op i et vandbad ved 37 °C ved nedsænkning af en del af hætteglasset i vandet. Inkubat hætteglasset i 1-2 minutter i vandbadet, indtil kun en lille splint af is er synlig. ADVARSEL: Du må ikke nedsænke hele hætteglasset i vandbadet for at undgå kontaminering. Cellerne må ikke optøs i mere end 2 minutter. dette kan reducere celle levedygtighed. Hætteglasset tørres af med en 70% ethanolopløsning, inden røret overføres til laminarhætten.</li>
	<li>Genbrug cellerne meget omhyggeligt ved at pipetter op og ned 2-3 gange. Celleophænget overføres til to T75-kolber, der indeholder i alt 15 mL forvarmet optøningsmedium, hvilket resulterer i en såfyldetæthed på 6,7 x 104 celler/cm2. BEMÆRK: I de to første passager og optøning af kryopreserverede NHEKs anvendes cellekulturmediet i henhold til leverandørens anbefalinger.</li>
	<li>Kolberne anbringes i cellekulturinkubatoren (37 °C, 5 % CO2og 95 % relativ luftfugtighed (RH)).</li>
	<li>Efter ca. 24 timer udskiftes optøningsmediet med basalmediet for at fjerne dimethylsulfoxid (DMSO) fra keratinocytfrysningsopløsningen.</li>
	<li>Opdater basalmediet hver anden dag.</li>
	<li>Efter 4-6 dages dyrkning skal cellerne være omkring 80% sammenflydende og klar til såning i skær til dyrkning af rhes. BEMÆRK: Keratinocytter bør dyrkes til maksimalt 80% sammenløb for at bevare deres proliferative kapacitet62. Antallet af celler, der skal optøs, skal tage hensyn til flere parametre, såsom cellepassagenummeret, cellegabiliteten ved optøning, såningseffektiviteten samt fordoblingstiden.</li>
</ol>3. Såning af NHEKs
BEMÆRK: Denne protokol er designet til brug inden for et 24-brønds bærepladeformat. Hvis der kræves andre pladeformater (f.eks. 12-brønds- eller 6-brøndsformat), bør optimeringer i såfylden og middelvolumen overvejes. Figur 1 opsummerer en foreslået tidsplan for rhedyrkning og viser dyrkningsbetingelserne.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig1v4.jpg"> Figur 1: Skematisk tidslinje for rekonstitutionsprotokollen. Præsentation af RhE-modelpræparatet, dyrkningsprocessen og anvendelsen (eksponering for kemisk stof). Skemaet indeholder de relevante cellekulturmedietyper for hvert trin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig1v4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<ol><li>Forfyld 24-brønds plader med 1,5 mL nedsænket medium, ideelt ved hjælp af en dispenserpipette.</li>
	<li>Basalmediet fjernes fra de T75-kolber, der anvendes til NHEKs' kultur.</li>
	<li>Cellerne skylles ved at tilsætte 5 mL forvarmet PBS til hver T75 kolbe.</li>
	<li>Fjern PBS fra kolberne. BEMÆRK: Dette trin er afgørende, da mediet indeholder proteiner og calcium, der vil hæmme trypsinaktiviteten.</li>
	<li>Der tilsættes 2-3 ml forvarmet 0,05% [v/v] trypsin/ethylendiamin tetraeddikesyre (EDTA) til hver T75 kolbe. Sørg for, at trypsinopløsningen er ligeligt fordelt på kolbens cellekulturområde. ADVARSEL: Volumenet på 2 mL er baseret på ovennævnte 80%-sammenløb. Der anvendes 3 mL til kolber med højere sammenløb.</li>
	<li>Kolberne anbringes i 4 minutter i cellekulturinkubatoren (37 °C, 5 % CO2og 95 % RH). Kontroller, om cellerne løsner sig ved hjælp af mikroskopet ved en forstørrelse på 10x. Rap kolben mod håndfladen for at hjælpe cellerne med at slippe ud af overfladen af kolben. Frakoblede celler kan observeres som afrundede celler, der flyder i trypsinopløsningen. ADVARSEL: Cellerne må ikke inkuberes i trypsin i mere end 6 minutter. Over-trypsinisering kan beskadige cellerne og mindske deres overholdelse63.</li>
	<li>Når alle cellerne er løsrevet, tilsættes et lige stort volumen (dvs. 2-3 mL) forvarmet trypsinhæmmer til hver T75-kolbe.</li>
	<li>Celleaffjedringen overføres fra kolberne til et centrifugerør.</li>
	<li>Kolberne skylles med 5 mL forvarmet PBS, og de overføres til centrifugerøret, der indeholder celleaffjedringen. BEMÆRK: Sørg for, at de fleste celler opsamles ved at kontrollere antallet af resterende celler i kolberne under mikroskopet. Overfladen af kolben skal være 95% tom. Hvis dette ikke er tilfældet, er det muligt at gentage trypsiniseringstrinnet (3.3-3.9). Bemærk dog, at re-trypsinization bør undgås.</li>
	<li>Centrifuge de høstede celler ved 400 x g i 5 min.</li>
	<li>Kassér forsigtigt det meste af supernatanten, så der efterlades ca. 100-200 μL i røret. ADVARSEL: Pelletlen må ikke aspireres under denne procedure. </li>
	<li>Forsigtigt genbruge pellet af celler i et lavt volumen af nedsænket medium, pipette op og ned 5-10 gange for at sikre en ensartet celle suspension. Start med et lavt volumen (dvs. 500 μL) for at undgå dannelse af celleaggregater og tilføj op til 1 mL nedsænket medium i alt pr. første T75 kolbe. BEMÆRK: Svirp forsigtigt røret med fingrene for forsigtigt at opløse en del af cellepillen i supernatanten.</li>
	<li>Tæl cellerne i suspensionen ved hjælp af trypan blå udelukkelsesmetode.<ol>
<li>Der fortyndes 0,4% [v/v] trypanblå plet og celleophænget i et 1:1-forhold ved at tilføje 10 μL på 0,4% [v/v] trypanblå plet til 10 μL celleaffjedring. Der tilsættes 10 μL af opløsningen til et tælledias. Mål celleantallet umiddelbart efter blanding af celleophænget med trypanblå, da trypanblå begynder at reducere celledygtigheden efter eksponering længere end 1min. 65. ADVARSEL: Trypan blå viste sig at være en potentiel mutagen, kræftfremkaldende, og teratogen64. Farvestoffet håndteres med forsigtighed, og affaldet bortskaffes sikkert i henhold til lokale laboratoriebestemmelser. BEMÆRK: En alternativ tilgang til brugen af trypanblå er det ufarlige farvestof Erythrosin B66.</li>
	</ol></li>
	<li>Celleaffjedringen fortyndes med yderligere nedsænket medium for at opnå en koncentration på 3,525 x10 5 celler/mL i neddykket medium ved at tilføje volumen V2 som vist i ligning 1: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61802/61802eq01.jpg"> C1 = optalt cellekoncentration i celleophænget opnået i 3,12 (celler/mL) V1 = volumen, der anvendes til at genbruge pellet af celler i 3,12 (mL) C2 = målrettet cellekoncentration i suspensionen (dvs. 3,525 x 105 celler/mL) V2 = volumen, der skal tilsættes for at nå den målrettede cellekoncentration (mL) BEMÆRK: Overfladearealet på den anbefalede dyrkningsindsats er 0,47 cm2; Derfor er den tilsvarende såfylde 3,75 x 105 celler/cm2.</li>
	<li>Der udføres endnu et celleantal (C3) af den fortyndede opløsning, der er opnået i trin 3.14. Brug ligning 2 til at beregne celleaffjedringsvolumen (V4),der skal seededes i kulturindsatsen: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61802/61902eq02.jpg"> C3 = målrettet cellekoncentration i suspensionen (dvs. 3,525 x 105 celler/mL) V3 = målrettet volumen af celleaffjedringen, der skal sås i dyrkningsindsatsen (dvs. 0,5 mL) C4 = optalt cellekoncentration i den fortyndede suspension opnået i 3.14 (celler/mL) V4 = det faktiske volumen af celleaffjedringen, der skal sås i dyrkningsindsatsen (mL)</li>
	<li>Hæng de 24 cellekulturindsatser i den højeste position af den anbefalede bæreplade, og overfør bærepladen til 24-brøndspladen forfyldt med nedsænket medium (jf. 3.1). ADVARSEL: Når bærepladen overføres til multibrøndpladen, skal du sikre dig, at der ikke er fanget luftbobler mellem skærmembranen og det nedsænkede medium fra det basale rum, da dette vil påvirke cellernes fodring og i sidste ende kompromittere RhE-levedygtigheden og morfologien.</li>
	<li>Tilføj den bestemte diskenhed V4 (fra ligning 2) af celleophænget til hver skær. BEMÆRK: Det anbefales at bruge den omvendte pipetteringsteknik til nøjagtigt at dispensere celleaffjedringen til dyrkningsindsatserne. ADVARSEL: Sørg for ikke at beskadige membranen, når du dispenserer celleophænget i dyrkningsindsatsen. En sikkerhedsforanstaltning er at dispensere celleaffjedringen langs væggen i skærsystemet uden at røre membranens overflade.</li>
	<li>Efter såning inkuberes 24-brøndspladerne i 10-15 minutter ved stuetemperatur for at overvinde en kanteffekt (dvs. ikke-ensartet temperaturfordeling mellem alle brønde67). Flyt ikke pladerne i dette tidsrum.</li>
	<li>Pladerne overføres til cellekulturinkubatoren (37 °C, 5% CO2og 95% RH). Cellerne opbevares under nedsænkede forhold i tre dage. BEMÆRK: For at undgå vævsvariation må pladerne i inkubatoren ikke stables efter såning for at sikre, at hver skær får den samme mængde varme. Efter tre dage (dvs. under ALI-dyrkning) er det muligt at stable plader.</li>
</ol>4. Dyrkning på Air-Liquid Interface
<ol><li>Efter en tre-dages inkubation i cellekulturinkubatoren (37 °C, 5% CO2og 95% RH) udsættes de celler, der har klæbet til membranoverfladen, til ALI ved at fjerne det nedsænkede medium fra det apikale rum helst ved hjælp af et aspirationssystem og en glas Pasteur pipette. BEMÆRK: Alternativt kan det nedsænkede medium fra det apikale rum fjernes med en manuel mikropipette.</li>
	<li>Fyld nye 24-brønds plader med 1,5 mL frisk forvarmet ALI-medium og overfør bærepladerne med dyrkningsindsatserne til de nye multibrøndplader.</li>
	<li>Multibrøndpladerne overføres tilbage til cellekulturinkubatoren (37 °C, 5% CO2og 95% RH).</li>
	<li>Opdater ALI-mediet hver 2-3 dage i 14 dage.</li>
	<li>Udfør opdateringen i to trin: 1) forbered en ny plade, der indeholder 1,5 mL/brønd frisk forvarmet ALI-medium, og 2) overfør bærepladen til den nye plade. ADVARSEL: Under hele rekonstitutionsproceduren er det bedst ikke at fjerne låget, der dækker bærepladen, for at holde RhEs beskyttet mod potentiel kontaminering. BEMÆRK: ALI-trinnet er afgørende for udviklingen af en stratificeret epidermal model, da det giver mulighed for terminal differentiering af keratinocytterne68. Efter at have gået til ALI kræves en visuel kontrol af indsatserne for at kontrollere, om der er 'utætte væv': mellemstore dråber på vævsoverfladen, der kommer fra basolateralrummet. Hvis lækagen sker på ALI dag 3, skal du forsigtigt fjerne mediet fra dyrkningsindsatsen uden at røre ved vævets overflade. Hvis lækagen fortsætter, anbefales det at kassere lækkende væv, da det er et tegn på, at der ikke er nogen korrekt barrieredannelse i RhE-modellen.</li>
	<li>I slutningen af rekonstitutionsprocessen kan vævene udsættes for forskellige stressorer for at fremkalde for eksempel oxidativ stress eller betændelse. Parallelt kan de behandles med kemiske forbindelser eller kosmetiske ingredienser. BEMÆRK: Under eksponeringen/behandlingen holdes væv normalt i nedsænket medium med udgangspunkt i ALI D14. Når væv forventes at blive eksponeret/behandlet i lang tid (dvs. 48-72 timer), anbefales det i) at påbegynde eksponeringen/behandlingen tidligere i ALI-dyrkningsprocessen, såsom D7-D9, for at undgå udtynding af de levedygtige lag og fortykkelse af SC og ii) at inkubere vævene i ALI-medium for at holde stimulerende cellespredning.</li>
	<li>Til rhe-høst opsamles vævs- og cellekulturmediet på det tidspunkt, hvor der er interesse for histologiske analyser, levedygtighedsanalyser, protein/RNA-ekstraktion og enzymrelaterede immunosorbentanalyser (ELISAs).</li>
</ol>

Marc Eeman og Benedetta Petracca er ansatte i Dow Silicones Belgium. Alle andre forfattere har intet at afsløre.

RhEs er meget udbredt som screening værktøjer i den farmaceutiske og dermato-kosmetiske felter36,75,76,77,78. Selv om flere virksomheder har stillet sådanne rhes kommercielt tilgængelige, forbliver de dyre og begrænser muligheden for at variere dyrkningsparametrene efter behov for at behandle nye forskningsspørgsmål. Dette papir beskriver produktionsproceduren for interne RHE'er på en robust og pålidelig måde og giver en detaljeret karakterisering af de opnåede væv for at bekræfte modellens relevans som en alternativ tilgang til dyreforsøg.
Nogle af trinene i protokollen er afgørende for at sikre korrekt keratinocyt differentiering og RhE reproducerbarhed. Dette kan gøres ved at udnytte de optimale celler, mellemstore typer og dyrkningsforhold. I den foreslåede RhE-model blev neonatal NHEKs udvalgt på grund af deres manglende antigene eksponering sammenlignet med voksne NHEKs. Desuden var keratinocytter begrænset til kaukasisk etnicitet for at undgå variabilitet mellem arter. Primære keratinocytter bruges typisk til deres evne til at differentiere og stratificere79. De kan fås kommercielt eller ved intern isolering fra voksen hud80. Dyrkningen af en cellelinje (dvs. HaCaT) på en polycarbonatmembran har vist sig at mislykkes differentiering og vist en nedsat evne til at syntetisere lipider, der er nødvendige for barrieredannelse81. Men inddragelsen af forskellige kultur matricer, såsom hydrogels, kollagen, fibrin, og sfæroider kulturer, resulterede i en vellykket udvikling af 3D hudmodeller78,82,83,84,85,86. De udødeliggjorte cellelinjer, N/TERT, har vist sig at være egnede til udvikling af rhes35. Primære keratinocytter forbliver proliferative på deres fjerde eller femte passage61, derfor omfatter den nuværende protokol brugen af keratinocytter i deres tredje passage. De Vuyst et al. har påvist, at cellesåningstætheden er vigtig og skal være tilstrækkelig (dvs. ≥ 2,5 x 105 celler/cm2) for at sikre, at mediet fra basolateralrummet ikke spredes til det apikale rum. En utilstrækkelig såningstæthed (dvs. < 2.5x105 celler/cm2) kan resultere i en manglende evne til at danne en ordentlig barriere, hvilket indikeres af udbredelsen af medium fra basolateral til det apikale rum, hvilket resulterer i nedsænket i stedet for ALI-dyrkningsforhold62. Serumfrit keratinocytvækstmedium (se Tabel over materialer) blev foretrukket til reproducerbarhedsformål, da det giver den fordel, at det arbejder med et kemisk defineret medium og reducerer risikoen for kontaminering. Dette medium har en lavere calciumkoncentration (dvs. 60 μM) og stimulerer derfor spredningen af keratinocytter87. Forøgelse af calciumkoncentrationen (dvs. 1,5 mM) fra det første trin i RhE-dyrkningen, favoriserer keratinocyt differentiering og hudbarrieredannelse og homøostase49. Derudover suppleres ALI-mediet med ascorbinsyre, som har vist sig at være afgørende for dannelsen af SC-lipider og for at fremme differentiering52,53,54. ALI-mediet indeholder også KGF, som er en vækstfaktor udskilt af fibroblaster, der kan binde sig til keratinocyt transmembrane receptorer og ved aktivering har en dobbelt rolle i differentiering og sårreparation55,88. Det er vigtigt at opdatere ALI-mediet med bestemte tidsintervaller for at give en konstant forsyning af friske næringsstoffer til RhEs. Brugen af et bærepladesystem er afgørende for RhE-dyrkning i større skala (dvs. 24 skær/plade). Det giver den fordel at spare tid, reducere risikoen for forurening, og giver mindre plads til indførelsen af menneskelige fejl. Det giver også mulighed for at dyrke rhes i en stor mængde medier (dvs. 1,5 mL), hvilket reducerer det nødvendige antal ALI-medium refreshes. Derudover giver det mulighed for at overføre en fuld plade af skær til en plade med frisk medium, undgå kontakt med indsatserne individuelt eller afdække pladelåget.
Der er flere begrænsninger af RhE-modellen, der skal bemærkes. I den oprindelige menneskelige hud er der en balance mellem spredningen af keratinocytter i det basale lag og løsrivelsen af corneocytter i SC (dvs. desquamation)89. Men in vitro, desquamation finder ikke sted. Derfor forbliver corneocytterne fastgjort til RhE og danner en tyk SC, der er mindre fysiologisk relevant. Derfor er der en begrænset dyrkningstid for RhEs. Desuden er denne RhE-model enkel og ligetil, da den består af en enkelt celletype, dvs. keratinocytten, som er den mest rigelige celletype af epidermis. Der er dog andre celletyper bosiddende i epidermis, såsom melanocytter, dendritiske celler (dvs. Langerhans celler), T-celler (f.eks.+ celler) og Merkel-celler13. For at forbedre hudmodellens fysiologiske relevans har forskere gjort hudmodeller mere komplekse ved at tilføje melanocytter38 , immunceller39eller celler afledt af patienter90. Man bør huske på, at barrieren egenskaber menneskelige hudmodeller er forskellige i forhold til indfødte menneskelige hud, på grund af især en anden SC lipid sammensætning og en højere barriere permeabilitet 91,92,93,94,95. Flere undersøgelser har imidlertid rapporteret om ændringer i barriereegenskaberne for menneskelige hudmodeller ved dyrkning under hypoxi96 eller nedsat relativ luftfugtighed97, gradueringen af den dermale matrix med chitosan98, og ændring af de frie fedtsyrer i kulturmediet99. Desuden kan kulturforholdene og den mellemstore sammensætning i både enkle og mere komplekse RhEs moduleres for at efterligne patologiske træk. Ved at udfordre modellen med cytokiner, en unormal morfologi100 og ændringer i gen- og proteinudtryksniveauer kan fastslås, som typisk observeres i almindelige hudlidelser, såsom atopisk dermatitis og psoriasis35,101,102,103,104,105. Lyddæmpning af specifikke gener i keratinocytter, før du påbegynder rekonstitutionsprocessen for 3D-modellen, er en anden tilgang, der bruges til at efterligne træk ved hudlidelser og undersøge nye terapeutiske løsninger106,107. Ud over kun modellering af et epidermalt lag kan et dermalt rum indgå i modellen (dvs. navngivne menneskelige hudækvivalenter eller modeller med fuld tykkelse) ved at integrere fibroblaster i en kollagenmatrix før RhE-rekonstitution, hvilket gør det mere fysiologisk relevant og egnet til aldrings- og sårhelingsrelaterede undersøgelser108,109,110. Derudover er tumorspærreoider blevet føjet til menneskelige hudækvivalenter for at studere melanom progression111,112. De seneste fremskridt inden for hudmodeller er biotryk og hud-på-en-chip. Flere forskergrupper har for nylig formået at udvikle (perfusable) bio-trykte hudækvivalenter45,113,114. Den foreslåede protokol udnytter et 24-brønds format og en bæreplade og undgår skær, der skal håndteres individuelt. Undersøgelsesskalaen er dog stadig ret begrænset og mangler automatisering. Ved at implementere brugen af biotryk eller hud-på-en-chip kan mindre hudmodeller bruges med mere automatiserede processer og i større skala.
RhE beskrevet i denne protokol har flere ligheder med de allerede udviklede og velkaraktererede kommercielle epidermale modeller. Den morfologiske analyse har vist, at selv om antallet af levedygtige lag i den foreslåede RhE-model er lavere end for indfødt human hud (dvs. 6-7 sammenlignet med 7-14), kan det sammenlignes med EpiDerm RhE-modellen (dvs. 8-12)70. På samme måde som EpiDerm-, EpiSkin- og SkinEthic-modellerne viser det øverste RhE-lag et kurvvævningsmønster af tætpakkede corneocytelag28. Desuden viste TEM-analysen, at antallet af SC-lag i den foreslåede RhE-model (dvs. 15-25) kan sammenlignes med Antallet af EpiDerm (dvs. 16-25)70. Samlet set viser den foreslåede RhE-model en lignende struktur som andre kommercialiserede epidermale modeller, der efterligner den indfødte menneskelige epidermis. Vævsintegriteten målt ved TEER er inden for rækkevidde med kommercielle RhE-modeller (dvs. mellem 3000-5600 Ω,cm2)71,72,73 og andre interne rhes (dvs. ca. 5000 Ω,cm2)74,115. Den foreslåede RhE-model viser sig at være godt differentieret, som det fremgår af tilstedeværelsen og den korrekte lokalisering af differentierings- og vævs vedhæftningsmarkører. Desuden viser den foreslåede RhE-model sig at være lydhør over for proinflammatoriske stimuli (dvs. LPS og TNF-α).
Afslutningsvis vil jeg sige, at den nuværende protokol viser, hvordan rhes kan produceres på en pålidelig måde og i relativt stor skala for at imødekomme forskernes behov i både akademiske og private institutioner. Den foreslåede RhE model viser sig at have lignende morfologi, epidermal differentiering, og biologisk lydhørhed over for andre eksisterende kommercielle modeller. Det giver et alternativt værktøj til både det farmaceutiske og dermato-kosmetiske område, når adgang til en relevant hudmodel er påkrævet.

Epidermis er det yderste lag af huden, på den direkte grænseflade mellem menneskekroppen og det ydre miljø. Dens vigtigste funktioner er at yde beskyttelse og hydrering1. Epidermis fungerer som en effektiv fysisk barriere mod eksterne agenter og forhindrer overdrevent vandtab fra kroppen. Disse hudfunktioner afhænger hovedsageligt af det cellulære arrangement i de yderste lag af huden, sammensætningen og organiseringen af intercellulære lipider2. Epidermis består primært af keratinocytter, der migrerer opad til den ydre side af vævet og gennemgår differentiering. Der er 4-5 epidermale lag, der er kendetegnet ved deres differentieringsstadium. Fra indersiden til ydersiden starter de epidermale lag fra den levedygtige epidermis,dvs. Det basale lag består hovedsageligt af formerende keratinberigede keratinocytter, som migrerer gennem SS ved differentiering4. Under keratinocytmodning sker forskellige ændringer i proteinudtryk og struktur. Keratinocytter klæber gennem dannelsen af desmosomale vejkryds5. I SG, er generationen af lamellar organer indledt. De består af lipidprækursorer og enzymer, der er afgørende for dannelsen af hudbarrierefunktionen6. SG er også kendetegnet ved tilstedeværelsen af keratohyalin granulat i keratinocytternes cytoplasma. Ved grænsefladen med SC, indholdet af lamellar organer er ekstruderet ind i intercellulære rum og ikke-polære lipider såsom ceramider, kolesterol, og frie fedtsyrer organisere i stablet lamellar lipid bilayers at danne ekstracellulære lipid matrix7. I SC mister celler alle cellulære organeller, herunder kernen, på grund af enzymatiske nedbrydningsprocesser og vedtager en flad morfologi. De er omgivet af en cornified kuvert lavet af krydsbundet protein lag, og kaldes corneocytes8,9. Desmosomale komponenter er krydsbundet med den cornified kuvert til at danne corneodesmosomes og binde corneocytes sammen. Det resulterende epitel fornyes løbende fra stamceller med en omsætningstid på ca. 5-6 uger10. Differentieringsprocessen af keratinocytterne, som resulterer i en fuldt stratificeret epidermis, er afgørende for dannelsen af hudensbarrierefunktion 11.
Under sår og betændelse fremkalder keratinocytter ændringer i vedhæftningsmolekyler og overfladereceptorer og udløser proinflammatoriske reaktioner via sekretion af cytokiner, kemokiner og antimikrobielle peptider12. Huden er ikke kun en fysisk barriere mod udefrakommende stoffer; det fungerer også som immunsensor ved udsættelse for patogener. Derudover regulerer det udbredelsen af flere stoffer på tværs af dets lag, såsom vandindhold for at beskytte menneskekroppen mod dehydrering. Huden er også involveret i syntesen af D-vitamin og har forskellige andre metaboliske funktioner3,13,14.
For at vurdere de skadelige virkninger af eksogene stoffer har toksikologer i årtier været afhængige af dyreforsøg, men i dag er det ikke den foretrukne tilgang. Ud over at have begrænset prædiktiv kapacitet til menneskelig toksicitet involverer dyremodeller adskillige etiske spørgsmål. Forbuddet mod dyreforsøg i kosmetikindustrien og henstillingen om at følge 3R-princippet (dvs. udskiftning, reduktion og raffinement) inden for forskning har ført til udvikling af alternative testmetoder baseret på in vitro-tilgange15. De første in vitro hudcellemodeller er allerede beskrevet i 90'erne, og en imponerende udvikling fra enkle menneskelige keratinocyte monokulturer til fuldt differentierede epidermis og modeller i fuld tykkelse er opnået16. I dag har hudvævsteknik fået betydning på både det farmaceutiske og dermato-kosmetiske område. I de sidste to årtier har flere virksomheder kommercialiseret tredimensionelle (3D) rekonstruerede menneskelige epidermis (RhE), der repræsenterer standardiserede og reproducerbare værktøjer til hudrelaterede undersøgelser. Flere kommercielle RhE-modeller accepteres til in vitro-hudtest af kemikalier i henhold til OECD's retningslinjer for testning af hudirritation17,18 (dvs. testretningslinje 43919) og hudkorrosion20 (dvs. testretningslinje 43121). In vitro-testen for hudsensibilisering22 (dvs. SENS-IS-analyse) er i øjeblikket i godkendelsessporet og under peer-review23. Der er også mange andre assays udviklet, der bruger kommercielle RhE-modeller til at evaluere fototoksicitet24, for at teste lægemiddelformuleringer25, kosmetiske formuleringer og aktive ingredienser26, for at studere hudbarrierefunktionen27 og for at teste den biologiske reaktion på miljøstressorer28,29,30,31.
Ud over kommercielt tilgængelige 3D-hudmodeller har flere forskningsgrupper udviklet deres egne RhEs32,33,34,35,36,37. Interne RhEs giver den fordel, at de kontrollerer kulturforholdene i henhold til formålet med undersøgelsen. Specifikt kan forskere vælge typen og kilden til keratinocytterne, der skal bruges til rekonstituering af deres 3D epidermale model (dvs. primær vs udødeliggjort, neonatal vs. alderen, enkelt vs. samlet tilfældige donorer, køn, etnicitet, individuelle levende vaner som rygning osv.). De har mulighed for at variere sammensætningen af kulturmediet og indarbejde vækstfaktorer, vitaminer eller andre forbindelser, der kan modulere ekspressionen af målproteiner eller lipider. Med in-house RhEs kan forskere også undersøge biologiske reaktioner og biomekaniske egenskaber som en funktion af 3D-modellens differentieringstilstand. Ud over disse intuitive parametre er der løbende bestræbelser på at øge kompleksiteten af 3D-hudmodeller og gøre dem mere fysiologisk relevante, f.eks . ved at tilføje andre epidermale celletyper (f.eks. melanocytter og immunceller)38,39, ved at dyrke keratinocytterne oven på en fibroblastbefolket kollagenmatrix40,41,42og ved at inkludere komponenter i det vaskulære netværk43,44,45.
Selv om det er muligt at tune kulturforholdene efter specifikke behov, er der parametre, der skal overholdes for at garantere både kvaliteten og relevansen af en RhE. For at dyrke RhE-væv sås normale humane epidermale keratinocytter (NHEG'er) i specifikke gennemtrængelige dyrkningsindsatser, hvis porøse syntetiske membran adskiller brøndene i to rum, dvs. det apikale og basolaterale rum. Membranens porøsitet (dvs. en porestørrelse på 0,4 μm) er sådan, at den gør det muligt at danne en cellemonomer i det apikale rum uden migration af celler til den basale skærside og fodring af keratinocytterne med essentielle næringsstoffer fra kulturmediet indeholdt i basolateralrummet. I begyndelsen af rekonstitutionsprocessen dyrkes NHEKs under nedsænkede forhold i et par dage for at tillade deres vedhæftning på membranen. Calciumniveauet i begge rum øges i forhold til den calciumkoncentration, der anvendes til NHEKs 2D-dyrkning for at bremse spredningen af celler og i stedet fremme deres differentiering46. En epidermal calciumgradient er afgørende for at regulere barrieredannelsen og homøostase47,48. Høje calciumniveauer (dvs. op til 1,5 mM) fremmer dannelsen af intercellulære vejkryds og modulerer dannelsen af den cornified kuvert under terminal differentiering49. Når keratinocytter danner et kontinuerligt og tæt klæbende monolag på støttemembranen, fjernes mediet fra det apikale rum, og kulturprocessen fortsætter ved den luftvæskegrænseflade (ALI) for at stimulere stratificeringen og etablere en epidermalbarriere 50,51. Særlige kulturforhold er afgørende for at opnå et fuldt stratificeret epitel36. Under rekonstitutionsprocessen hos ALI suppleres mediet i basolateralrummet med keratinocytvækstfaktor (KGF), insulin, calcium og ascorbinsyre. Ascorbinsyre spiller en stor rolle i dannelsen af en passende SC lipid barriere, der ligner den indfødte menneskelige hud52. Keratinocytter dyrket i ascorbinsyre-suppleret medium demonstrere en differentieret fænotype, med et øget antal keratohyalin granulat, samt organiseret intercellulær lipid lamellae i interstices af corneocytes52. En sådan tilskud er afgørende for at forbedre epidermal barriere funktion ved at øge cornified kuvert indhold og undgå udtømning af hydrofile antioxidant butikker53,54. KGF, en vigtig parakrine mægler af epidermal spredning og differentiering, bruges til at stimulere NHEKs55.
De vigtigste ulemper ved interne RHE'er omfatter tab af standardisering mellem forskningsinstitutioner og øget arbejdsintensitet og tidsforbrug (op til 3 uger sammenlignet med de færdige kommercielle modeller). Formålet med dette dokument er at afhjælpe disse ulemper og skabe grundlag for produktionen i større målestok. Ud over ovennævnte fordele ved interne RHE'er har den nuværende protokol til formål at reducere intra- og intervariationen blandt væv, reducere forureningsrisici og strømline dyrkningsprocessen.
Den nuværende protokol beskriver en reproducerbar og robust metode til at dyrke RhEs ved hjælp af neonatal NHEKs. Desuden viser det repræsentative resultater af karakteriseringen af RhEs morfologi, barriereintegritet og udtryk for proteiner, der er specifikke for epidermal differentiering. RhEs morfologiske struktur blev undersøgt ved hjælp af hematoxylin og eosin (H &E) farvning og transmission elektron mikroskopi (TEM). For at vurdere barrierens integritet blev den transepidermale elektriske modstand (TEER) og eksponeringstiden for Triton X-100 for at reducere 50% af vævs levedygtigheden (ET50) målt. Dannelsen af desmosomale vejkryds (dvs. desmoglein 1) blev analyseret af immunfluorescens (IF) for at evaluere keratinocyte vedhæftning. Dannelsen af epidermale strukturelle proteiner (dvs. involucrin, loricrin og filaggrin) blev evalueret og påvist med IF. Disse proteiner er involveret i dannelsen af den stærkt krydsbundet proteinkonvolut , der omgiver SC-corneocytter , og som følge heraf er vigtige markører for sen-fase epidermal differentiering56,57. Derudover blev IF brugt til at analysere keratin 10, et protein induceret i tidlige fase differentierede celler i SS58 og fundet inde i alle differentierede lag. Endelig rhe's reaktion på proinflammatoriske stimuli (dvs. lipopolysaccharid og tumor nekrose faktor alpha) blev undersøgt. Niveauerne af interleukin 1 alpha (IL-1α) og interleukin 8 (IL-8) blev målt i cellekulturmedierne ved hjælp af enzymforbundne immunosorbentanalyser (ELISA).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Acetic acid</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >A6283</td>
			<td >Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibiotic-antimycotic (100x)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aqueous Eosin Y solution</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >HT110280</td>
			<td >Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td >Sigma Aldrich or Merck</td>
			<td>C8106 or 1.02378.0500</td>
			<td >Prepare a stock solution of 0.144 M, filter sterilize and store aliquots at -20 &#176;C.&#160; It is recommended to prepare new aliquots every 6 months.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>Prepare a stock at 100 &#956;g/mL and store aliquots at -20 &#176;C. Working conditon is 1 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Entellan mounting medium</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.07960.0500</td>
			<td>Mounting medium for H&#38;E staining.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EpiLife medium (referred to as keratinocyte growth medium)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>MEPI500CA</td>
			<td >Contains 0.06 mM of Ca2+.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol absolute</td>
			<td >Any supplier</td>
			<td >N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formalin 10%</td>
			<td >Leica Biosystems</td>
			<td >3800770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human keratinocytes growth supplement (HKGS) (100x)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>S0015</td>
			<td >To reach final concentrations of 0.2% [v/v] BPE, 0.2 ng/mL human recombinant EGF, 0.18 &#956;g/mL hydrocortisone,5 &#956;g/mL bovine transferrin, and 0.01 &#181;g/mL human recombinant insulin-like growth factor-I.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropanol</td>
			<td >Biosolve B.V.</td>
			<td >0016264102BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kaiser&#39;s glycerol gelatine, phenol-free</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.08635.0100</td>
			<td>Mounting medium for IF staining.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Keratinocyte growth factor (KGF)</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG-050</td>
			<td >Reconstitute KGF protein at 100 &#956;g/mL in sterile 0.1% [w/v] BSA in PBS. Prepare aliquots and store at -20&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lactate dehydrogenase (LDH) assay kit</td>
			<td >Roche</td>
			<td >4744926001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td >Prepare a stock solution of 25 mg/mL, filter sterilize and store aliquots at -20&#176;C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. Store in the dark.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lipopolysaccharide (LPS), E.coli strain O55:B5</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >L4524</td>
			<td >Prepare a stock of 1 mg/mL in sterile PBS and store aliquots at -20 &#176;C. Working concentration is 100 &#956;g/mL.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mayer&#8217;s Haematoxylin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >MHS80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs)</td>
			<td >Lonza</td>
			<td>00192906</td>
			<td >Human primary keratinocytes isolated from neonatal foreskin, pooled from at least three donors.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10010056 or 10010-015</td>
			<td >Reference numbers can vary between countries.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;)</td>
			<td >ImmunoTools</td>
			<td >11344483</td>
			<td>Prepare a stock of 100 &#956;g/mL in sterile ultrapure water. Working concentration is 40 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile ultrapure water</td>
			<td >Any supplier</td>
			<td >N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M5655</td>
			<td>Prepare a stock of 5 mg/mL MTT in sterile PBS. Working concentration is 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>93426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan blue (0.4% [v/v])</td>
			<td >Any supplier</td>
			<td >N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin inhibitor</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>R007100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA (0.05% [v/v])</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tween 20</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylene</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab150113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tri-sodium citrate dihydrate</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.06448.0500</td>
			<td>For antigen retrieval buffer for IF staining.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Dylight 488)</td>
			<td >Agrisera</td>
			<td>AS09 633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filaggrin Mouse antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP2-53243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Involucrin Rabbit antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP2-33742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Keratin 10 Mouse antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP2-32962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Desmoglein-1 Mouse antibody&#160;</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>MAB944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Loricrin Rabbit antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP1-33610</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivating a three-dimensional reconstructed human epidermis at a large scale

En tre-dimensionel menneskelige epidermis model rekonstrueret fra neonatal primære keratinocytter præsenteres. Heri beskrives en protokol for dyrkningsprocessen og karakteriseringen af modellen. Neonatal primære keratinocytter dyrkes nedsænket på gennemtrængelige polycarbonatindsatser og løftes til den luftvæskegrænseflade tre dage efter såning. Efter fjorten dages stimulering med definerede vækstfaktorer og ascorbinsyre i høj calciumkulturmedium er modellen fuldt differentieret. Histologiske analyser afslørede en fuldstændig stratificeret epidermis, der efterligner morfologien af indfødt menneskelig hud. For at karakterisere modellen og dens barrierefunktioner blev proteinniveauer og lokaliseringsspecifikke for tidlig keratinocytdifferentiering (dvs. keratin 10), sen differentiering (dvs. involucrin, loricrin og filaggrin) og vævslimemiddel (dvs. desmoglein 1) vurderet ved immunfluorescens. Vævsbarrierens integritet blev yderligere evalueret ved at måle transepithelial elektrisk modstand. Røkonstructed human epidermis var lydhør over for proinflammatoriske stimuli (dvs. lipopolysaccharid og tumor nekrose faktor alpha), fører til øget cytokin frigivelse (dvs. interleukin 1 alfa og interleukin 8). Denne protokol repræsenterer en enkel og reproducerbar in vitro-metode til dyrkning af rekonstrueret human epidermis som et redskab til at vurdere miljøvirkninger og en bred vifte af hudrelaterede undersøgelser.

NHEKs dyrket i 2D viser en traditionel morfologi med en ensartet polygonal form (Figur 2A). Som beskrevet ovenfor, NHEKs er seedet i kultur skær efter at have nået en sammenløb på ca 80%. Morfologien af RhEs blev analyseret ved hjælp af H &E farvning og TEM. Efter 15 dage hos ALI opnås et fuldt stratificeret væv som angivet i dets fire vigtigste epidermale lag: SB, SS, SG og SC (Figur 2B). I SB-laget har cellerne en kolonneform. Fra det andet lag mod de øverste lag af RhE differentierer NHEKs som observeret af ændringerne i cellemorfologien (fra en kolonneform i SB-laget mod en spinøs form i SS-laget). I SG-laget har cellerne en mere flad form og viser keratohyalingranulat (KG), der er repræsenteret som lilla prikker i cytoplasmaet. Deres karakteristiske runde og stjerneform fremhæves af hvide pile på H&E-billedet (Figur 2C). Cellerne i SC, er terminalt differentieret og er helt fladtrykt og mangler en cellekerne. De stratificerede rhE'er har en samlet tykkelse på 84,3 ± 2,4 μm, og deres SC har en tykkelse på 19,6 ± 3,2 μm (Figur 2D). Disse værdier kan sammenlignes med dem, der erindberettetfor den oprindelige menneskelige hud, dvs. Antallet af levedygtige lag er 6-7, hvilket er lavere sammenlignet med indfødte menneskelige hud, er ca. 7-1470. Ultrastrukturel analyse af rhe'er på forskellige tidspunkter i rekonstitueringsprotokollen (dvs. 7, 10, 13 og 15 dage) afslører cornification-processen af rhes med et øget antal corneocyte lag over tid(Figur 2E). Efter 15 dage på ALI er SC af RhE-vævet lavet af ca. 15-25 lag, hvilket kan sammenlignes med den værdi, der rapporteres for indfødt human hud (dvs. 15-20 lag)69.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig2v2.jpg"> Figur 2: Primære keratinocytter og rekonstruerede humane epidermis. (A) Mikroskopibillede af fasekontrast af primære keratinocytter, før det sås på skær. Skalalinjen er 50 μm. (B-C) H&E lysfeltmikroskopibillede af RhE. Skalastangen er 50 μm (B) og 25 μm (C). d) kvantificering af rhe- og SC-tykkelsen (middel ± SEM, n=3). (E) Transmissionselektronmikroskopibilleder af RhE-tværsnit efter 7, 10, 13 og 15 dage hos ALI. Skalalinjen er 4 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Ifølge deres differentieringsfase viser NHEKs, der vokser i 3D, forskellige proteinudtryksprofiler i henhold til deres differentieringsfase. Udtrykket af proteiner, der er specifikke for tidlig keratinocytdifferentiering (dvs. keratin 10), sen-trins keratinocyt differentiering (dvs. involucrin, loricrin og filaggrin) og keratinocyte vedhæftning (dvs. desmoglein 1) i RhEs blev bestemt ved hjælp af IF-farvning. Involucrinudtryk forekommer mere overvejende placeret i SG-laget, da dets udtryk indledes tidligere under differentieringsprocessen (Figur 3D), mens filaggrin og loricrin udtrykkes i de øverste lag (Figur 3B-C). Keratin 10-udtryk blev fundet i alle de levedygtige lag, undtagen SB-laget (Figur 3E). RhEs viser funktionelle desmosomale vejkryds, som det fremgår af udtrykket desmoglein 1 i det intercellulære rum af de levedygtige epidermale lag (Figur 3F). Afslutningsvis udtrykkes alle fem markører og placeres i de relevante epidermale lag og oversættes til en sund epidermal differentieringsproces.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig03.jpg"> Figur 3:Epidermal differentiering, vævslimemiddel og vævsintegritet af rekonstrueret human epidermis. Konfokale fluorescensmikroskopibilleder af (B) filaggrin (FLG), (C) loricrin (LOR), (D) involucrin (INV), (E) keratin 10 (K10) og (F) desmoglein 1 (DSG-1) repræsenteret i magenta. Nuclei farvning (DAPI) er repræsenteret i blåt. Skalalinjen er 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
RhE-modellens barriereegenskaber blev undersøgt ved at vurdere både vævs levedygtighed og integritet. Vævsintegriteten blev bestemt efter 15 dage ved at måle TEER ved hjælp af et voltohmmeter. De 2567 ± 415 Ω,cm2-værdier, der er registreret for RhEs, oversætter dannelsen af en kontinuerlig barriere (Figur 4A). Disse værdier ligger inden for interval med dem , der er rapporteret for RhE-modellerne71,72,73,74. Desuden blev den krævede eksponeringstid for et cytotoksisk referencekemikalie (dvs. Triton X-100) til at reducere vævsgabiliteten med 50% (ET50)bestemt med en thiazolylblå tetrazoliumbromid (MTT) analyse. ET50-værdien målt for RhE var 2,1 timer. Denne værdi falder inden for acceptområdet for andre 3D-epidermale modeller , der er kvalificerede til pålidelig forudsigelse af irritationsklassifikation (OECD-retningslinje 439)19.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig4v3.jpg"> Figur 4: Barriereegenskaber for rekonstrueret human epidermis. (A) Vævsintegritet målt med transepithelial elektrisk modstand (middel ± SEM, n=6). (B) ET50 bestemt ved måling af vævs levedygtighed (dvs. MTT-analyse) ved aktuel eksponering for 78,3 μL på 1% Triton X-100 (middel ± SEM, n=3).
RhEs reaktionsevne blev undersøgt på kendte proinflammatoriske stimuli. RhEs blev behandlet systemisk, dvs. tilsætning af stimuli i basolateralrummet, ved hjælp af 100 μg/mL Escherichia coli lipopolysaccharid (LPS) og 40 ng/mL tumornekrosefaktor alpha (TNF-α). Efter 24 timers stimuli blev cellekulturmediet indsamlet. Cytotoksiciteten blev målt ved hjælp af en laktatdehydrogenaseanalyse (LDH) og sammenlignet med værdierne af en kendt membranforstyrrende, Triton X-100-vaskemidlet (Figur 5). En betydelig stigning (p < 0,05, envejs ANOVA, Dunnett's multiple sammenligning test) blev vist i LDH aktivitet i RhEs behandlet med Triton X-100. LPS og TNF-α behandlinger begge viste ikke være cytotoksisk.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig5v3.jpg"> Figur 5: Den cytotoksicitet, der måles ved hjælp af laktatdehydrogenaseanalyse (LDH). Data præsenteres som relative værdier til kontrol, ubehandlet væv (CTRL); middelværdi ± SEM, n=9 (Triton X-100), n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). Betydningen blev testet med envejs ANOVA, Dunnetts multiple sammenligningstest. Stjerne angiver statistisk signifikant forskel i forhold til CTRL, ****p < 0,0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig5v3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Frigivelsen af interleukin 1 alpha (IL-1α) og interleukin 8 (IL-8) i RhE-mediet blev kvantificeret ved hjælp af ELISAs. Figur 6 viser både rhe'ernes kvantificerede og relative IL-1α- og IL-8-udgivelse efter udfordring med LPS og TNF-α. LPS behandling resulterede i en statistisk signifikant (p < 0,05, uparret Student's T-test) induceret frigivelse af IL-8 (9,6 ± 1,0 fold stigning) og IL-1α (2,7 ± 1,3 fold stigning). TNF-α fremkaldte ikke IL-8-udslip, selv om der blev observeret en tendens til øgede IL-8-niveauer (2,3 ± 0,8 gange stigning). Men TNF-α gjorde betydeligt (p < 0,05, uparret Student's T-test) udløse IL-1α frigivelse (1,8 ± 0,5 fold stigning).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig6v3.jpg"> Figur 6:Proinflammatoriske reaktioner i den rekonstruerede menneskelige epidermis. Koncentrationer af IL-8 frigivelse af RhE på en 24-timers udfordring med LPS (A) og TNF-α (B). Data repræsenteres som middelværdi ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (C) Data repræsenteres som gennemsnittet af den relative værdi sammenlignet med kontrol, ubehandlet væv (CTRL) ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). Koncentrationen af IL-1α frigivelse af RhE på en 24-timers udfordring med LPS (D) og TNF-α (E). Data repræsenteres som middelværdi ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (F) Data repræsenteres som gennemsnittet af den relative værdi sammenlignet med CTRL ± SEM, n=4 (LPS), n=3 (TNF-α). Betydningen blev testet af en ulønnet Student's T-test. Stjerne angiver statistisk signifikante forskelle i forhold til CTRL, *p < 0,05, ****p < 0,0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig6v3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale at JoVE.com

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

Denne protokol beskriver en enkel metode til at dyrke tredimensionelle rekonstituerede menneskelige epidermis i en reproducerbar og robust måde. Derudover karakteriserer det strukturfunktionsforholdet mellem den epidermale barrieremodel. De biologiske reaktioner fra den rekonstituerede menneskelige epidermis på proinflammatoriske stimuli præsenteres også.

Dyrke en tre-dimensionel rekonstrueret Human Epidermis i stor skala

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

In vitro eller konstrueret human epidermis model blev først udviklet i halvfemserne med det primære mål at udvikle alternative testmetoder til dyreforsøg. Disse 3D epidermale modeller er nu almindeligt anvendt til at teste både sikkerhed og effekt af kosmetiske ingredienser. Mens det kan købes fra flere vævsleverandører, giver det at være i stand til at rekonstruere en 3D-model i et laboratorium mere fleksibilitet til slutpunktet for interesse.Der er flere forskningsartikler, der kort beskriver rekonstitueringsprotokollen for en 3D-epidermal model, men der var til dato ingen video tilgængelig, der viste de kritiske trin i rekonstitutionsprocessen. Dette er årsagen til offentliggørelsen af denne video papir. Forberedelsen af in-house rekonstrueret menneskelige epidermis giver mulighed for en masse frihed i dyrkningsprocessen, såsom ændringer i kulturens medium sammensætning, proinflammatorisk eller oxidativ stressudløsere, lyddæmpning af gener af interesse og hæmning eller stimulering af visse biologiske processer.Til at begynde med, tø et hætteglas med 1 million cryo-bevaret normale menneskelige epidermal keratinocytter, eller NHEKs, i et vandbad ved 37 grader Celsius ved nedsænkning del af hætteglasset i vand. Inkuber hætteglasset i et til to minutter i vandbadet, indtil kun en lille splint af is er synlig. Genbrug cellerne meget omhyggeligt ved pipetter op og ned to til tre gange.Celleaffjedringen overføres til to T75-kolber, der indeholder i alt 15 milliliter forvarselsmedium, hvilket resulterer i en såfylde på 6,7 gange 10 til de fjerde celler pr. centimeter kvadreret. Forfyld 24 brøndplader med 1,5 milliliter nedsænket medium, ideelt ved hjælp af en dispenserpipette. Efter dyrkning af cellerne til 80% sammenløb, er de klar til såning i skær til dyrkning af rekonstrueret menneskelige epidermis, eller RHEs.Basalmediet fjernes fra T75-kolberne med NHEKs. Cellerne skylles ved at tilsætte fem milliliter forvarmet PBS til hver T75-kolbe, og fjern derefter PBS'en fra kolberne. Der tilsættes to til tre milliliter forvarmet 0,05%Trypsin-EDTA til hver kolbe, og trypsinopløsningen fordeles ligeligt på kolbens cellekulturområde.Kolberne anbringes i cellekulturinkubatoren i fire minutter, og kontroller derefter, om cellerne løsnes ved hjælp af mikroskopet ved en forstørrelse på 10 X. Rap kolben for at hjælpe cellerne med at slippe ud fra overfladen af kolben. Når alle cellerne er løsrevet, tilsættes en lige stor mængde forvarmet trypsinhæmmer til hver T75-kolbe, og celleaffjedringen overføres fra kolberne til et centrifugerør.Kolberne skylles med fem milliliter forvarmet PBS, og den overføres til centrifugerøret, der indeholder celleaffjedringen. Centrifuge de høstede celler ved 400 gange G i fem minutter. Kassér forsigtigt det meste af supernatanten, så der efterlades ca. 100 til 200 mikroliter i røret.Svirp forsigtigt røret med fingrene for forsigtigt at løsne pellet. Forsigtigt genbruges pellet af celler i et lavt volumen af nedsænket medium, pipetter op og ned 5 til 10 gange for at sikre en ensartet celle suspension. Start med et lavt volumen for at undgå dannelse af celleaggregater, og tilføj op til en milliliter nedsænket medium pr indledende T75 kolbe.Tæl cellerne i suspensionen ved hjælp af trypan blå udelukkelsesmetode. Cellens affjedring fortyndes med yderligere nedsænket medium for at nå en koncentration på 3,525 gange 10 til de femte celler pr. milliliter ved hjælp af den første ligning, der er angivet i tekstmanuskriptet. Udfør et andet celleantal af den fortyndede opløsning, og brug den anden ligning i tekstmanuskriptet til at beregne celleaffjedringsvolumenet, der skal seededes i kulturindsatsen.Hæng de 24 brøndkulturindsatser i bærepladens højeste position, og overfør bærepladen til 24-brøndpladen, der er forfyldt med nedsænket medium. Tilføj den bestemte lydstyrke for celleaffjedringen til hver skær, og pas på ikke at røre ved indsatsen. Efter såning inkuberes de 24 brøndplader i 10 til 15 minutter ved stuetemperatur for at overvinde en kanteffekt.Flyt ikke pladerne i dette tidsrum. Overfør pladerne til cellekulturinkubatoren, og lad dem stå i neddykkede forhold i tre dage. Efter en tre-dages inkubation i cellekulturinkubatoren skal du udsætte de celler, der har klæbet til membraneoverfladen, for luftvæskegrænsefladen, eller ALI, ved at fjerne det nedsænkede medium fra det apikale rum med et aspirationssystem og en glas Pasteur pipette.Fyld nye 24 brøndplader med 1,5 milliliter frisk forvarmet ALI-medium, og overfør bærepladerne med dyrkningsindsatserne til de nye multibrøndplader. Overfør multibrøndpladerne tilbage til cellekulturinkubatoren. Opdater ALI-mediet hver anden til tre dage i 14 dage.Keratinocytter i 2D-kultur viser en traditionel morfologi med en ensartet polygonal form. Efter 15 dage hos ALI danner den rekonstruerede menneskelige epidermis et fuldt stratificeret væv, hvilket er angivet med dets fire vigtigste epidermale lag. Ultrastrukturel analyse af den rekonstruerede menneskelige epidermis på forskellige tidspunkter i rekonstitueringsprotokollen afslører cornification-processen med et øget antal hornhindepladslag over tid.Keratinocytter i epidermis viser forskellige proteinudtryksprofiler i henhold til deres differentieringsfase. Involucrinudtryk forekommer mere overvejende i SG-laget, mens udtrykket af filaggrin og loricrin er placeret i de øverste lag. Keratin-10 udtryk blev fundet i alle de levedygtige lag undtagen SB lag.Den rekonstruerede menneskelige epidermis viser funktionelle desmosomale knudepunkter, som det fremgår af udtrykket af Desmoglein-1 i det intercellulære rum af de levedygtige epidermale lag. Den rekonstruerede epidermismodels barriereegenskaber blev undersøgt ved at vurdere vævsgabiliteten ved lokal behandling med en kendt barriereforstyrrende virksomhed og ved at vurdere vævsintegriteten. Vævsintegriteten blev bestemt efter 15 dage ved at måle TEER med et voltmeter.Reaktionsevne epidermis til Lipopolysaccharide og Tumor Necrosis Factor alfa blev undersøgt. Både LPS- og TNF-alfabehandlinger var ikke-giftige. i forhold til Triton X-100-kontrolelementet.Frigivelsen af Interleukin-1 alpha og Interleukin-8 i RHE-mediet blev kvantificeret ved hjælp af IL lysis. LPS behandling resulterede i en statistisk signifikant up-regulering i frigivelsen af Interleukin-1 alfa og Interleukin-8. TNF alpha behandling resulterede i en statistisk signifikant up-regulering i kun frigivelsen af Interleukin-1 alpha.Der blev dog også observeret en klar tendens til øgede Interleukin-8-niveauer ved stimulering med TNF alpha. Efter denne protokol kan TEER måles som en værdi for barrierintegritet. Levedygtigheden eller cytotoksiciteten kan f.eks.Supernatanten kan bruges til at måle udskillelsen af cytokiner eller andre proteiner. Desuden kan vævet bruges til at studere ekspressionen af proteiner eller gener af interesse.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Bioengineering

Unit 1

The Integumentary System

SCIENTISTS IN ACTION

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Planar-og tredimensionelle Udskrivning af ledende blæk

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Menneskelige bruskvæv Fabrication Brug Tre-dimensionel Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analyse af Cell Migration inden for en tre-dimensionel kollagenmatrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Kloning og storstilet produktion af høj kapacitet adenovirusvektorer Baseret på menneskelige adenovirus type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

Tre-dimensionel Biomimetic Teknologi: Novel Biorubber Opretter Defineret mikro- og makro-skala Architectures i Collagen Hydrogeler

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Udarbejdelse og analyse af<em&gt; In vitro</em&gt; Tre Dimensional brystcarcinoma surrogater

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Udvikling af en flercellet Tre-dimensionel organotypisk Model af menneskelige tarmslimhinden Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Lab-on-a-CD-platform til generering af flercellede tredimensionelle Sfæroider

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...