Name: cultivating a three-dimensional reconstructed human epidermis at a large scale
Uploaded: 2021-05-28T13:30:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale at JoVE.com

תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת מענק מארי סקלודובסקי-קירי עם הסכם המענק מס' 765602 מימנה עבודה זו. כל המחברים מכירים בתמיכת קרן אדולף מרקל ואוניברסיטת פרארה ומכירים בהכרת תודה בדאו סיליקון בלגיה. ד"ר מיגל Spuch-Calvar הוא הודה להכנת התמונות הגרפיות של תהליך הטיפוח RhE. המחברים מודים לד"ר ברברה דרסלר, ד"ר פרנקו סרבלטי וד"ר אגנס טסייה על התמיכה הטכנית והדיונים.

מארק איימן ובנדטה פטרקה הם עובדים של דאו סיליקון בלגיה. לכל המחברים האחרים אין מה לחשוף.

RhEs נמצאים בשימוש נרחב ככלי הקרנה בתחום התרופות והדרמטו-קוסמטיקה36,75,76,77,78. למרות שמספר חברות הפכו RhEs כאלה לזמינים מסחרית, הן נשארות יקרות ומגבילות את האפשרות לשנות את הפרמטרים של הטיפוח כנדרש כדי לענות על שאלות מחקר חדשות. מאמר זה מתאר את הליך הייצור של ריס בתוך הבית בצורה חזקה ואמינה ומספק אפיון מפורט של הרקמות המתקבלות כדי לאשר את הרלוונטיות של המודל כגישה חלופית לניסויים בבעלי חיים.
חלק מהשלבים בפרוטוקול חיוניים כדי להבטיח בידול קרטינוציט נאותה ושחזור RhE. זה יכול להתבצע על ידי ניצול התאים האופטימליים, סוגים בינוניים, ותנאי טיפוח. במודל RhE המוצע, NHEKs יילודים נבחרו בשל חוסר החשיפה האנטיגנית שלהם, בהשוואה NHEKs מבוגרים. יתר על כן, קרטינוציטים הוגבלו למוצא האתני הקווקזי כדי למנוע שונות בין מינים. קרטינוציטים ראשוניים משמשים בדרך כלל ליכולתם להבדיל ולריבוד79. ניתן להשיגם באופן מסחרי או על ידי בידוד פנימי מעור מבוגר80. הטיפוח של קו תאים (כלומר, HaCaT) על קרום פוליקרבונט, הוכיח להיכשל בידול והפגין יכולת לקויה לסנתז שומנים הדרושים להיווצרות מחסום81. עם זאת, הכללת מטריצות תרבות שונות, כגון הידרוג'לים, קולגן, פיברין ותרבויות ספרואידים, הביאה להתפתחות מוצלחת של דגמי עור תלת-ממדיים78,82,83,84,85,86. קווי התאים המונצחים, N/TERT, הוכחו כמתאימים לפיתוח RhEs35. קרטינוציטים ראשוניים נשארים מתרבים בקטע הרביעי או החמישי שלהם61לכן הפרוטוקול הנוכחי כולל שימוש בקרטינוציטים בקטע השלישי שלהם. דה Vuyst ואח ' הוכיחו כי צפיפות זריעת התא הוא בעל חשיבות צריך להיות מספיק (כלומר, ≥ 2.5x105 תאים/ס"מ2) כדי להבטיח שהמדיום מתא הבזולטרלי לא יתפזר לתא האפical. צפיפות זריעה לא מספקת (כלומר, < 2.5x105 תאים/ס"מ2) יכול לגרום לחוסר יכולת ליצור מחסום ראוי, אשר מסומן על ידי דיפוזיה של מדיום מן basolateral לתא apical, וכתוצאה מכך שקוע במקום תנאי תרבות ALI62. מדיום צמיחה קרטינוציט ללא סרום (ראה טבלת חומרים) הועדף למטרות רבייה, שכן הוא מציע את היתרון של עבודה עם מדיום מוגדר כימית ומפחית את הסיכון לזיהום. למדיום זה יש ריכוז סידן נמוך יותר (כלומר, 60 מיקרומטר) ולכן מגרה את התפשטות הקרטינוציטים87. הגדלת ריכוז הסידן (כלומר, 1.5 מ"מ) מהשלב הראשון של טיפוח RhE, מעדיף בידול קרטינוציט והיווצרות מחסום עור והומאוסטזיס49. בנוסף, המדיום ALI הוא בתוספת חומצה אסקורבית, אשר הוכיחה להיות חיוני להיווצרות של שומנים SC ולקדם בידול52,53,54. המדיום ALI מכיל גם KGF, שהוא גורם גדילה המופרש על ידי פיברובלסטים שיכולים להיקשר לקולטנים transmembrane קרטינוציט ותוקפה יש תפקיד כפול בידול ותיקון פצעים55,88. חשוב לרענן את המדיום ALI במרווחי זמן ספציפיים, כדי לספק אספקה מתמדת של חומרים מזינים טריים RhEs. השימוש במערכת לוח נושא חיוני לטיפוח RhE בקנה מידה גדול יותר (כלומר, 24 מוסיף / צלחת). הוא מציע את היתרון של חיסכון בזמן, הפחתת הסיכון לזיהום, ומשאיר פחות מקום להכנסת טעויות אנוש. זה גם מספק את האפשרות לתרבות RhEs בנפח גבוה של מדיה (כלומר, 1.5 מ"ל), אשר מקטין את המספר הנדרש של רענון בינוני ALI. בנוסף, הוא מציע את האפשרות להעביר צלחת מלאה של מוסיף לצלחת עם מדיום טרי, הימנעות ממגע עם מוסיף בנפרד או לחשוף את מכסה הצלחת.
ישנן מספר מגבלות של מודל RhE שיש לציין. בעור האדם המקומי יש שיווי משקל בין התפשטות הקרטינוציטים בשכבת הבסיס לבין ניתוק הקורנפלומיטים ב- SC (כלומר, פירוק)89. עם זאת, במבחנה, desquamation אינו מתרחש. לכן, corneocytes להישאר מחובר RhE וליצור SC עבה כי הוא פחות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. לפיכך, יש טווח זמן טיפוח מוגבל של RhEs. יתר על כן, מודל RhE זה הוא פשוט וישיר, שכן הוא מורכב מסוג תא יחיד, כלומר, קרטינוציט, שהוא סוג התא הנפוץ ביותר של האפידרמיס. עם זאת, ישנם סוגי תאים אחרים המתגוררים באפידרמיס, כגון מלנוציטים, תאים דנדריטיים (כלומר, תאי לנגרהאנס), תאי T (למשל, CD8+ תאים) ותאי מרקל13. כדי לשפר את הרלוונטיות הפיזיולוגית של מודל העור, החוקרים הפכו את מודלי העור למורכבים יותר על ידי הוספת מלנוציטים38 תאי מערכת החיסון,39או תאים שמקורם על-ידי המטופל,90. יש לזכור כי תכונות המחסום של מודלים עור אנושי שונים בהשוואה לעור אנושי ילידי, בשל הרכב שומני SC שונה חדירות מחסום גבוה יותר 91,92,93,94,95. עם זאת, מספר מחקרים דיווחו על שינויים במאפייני המחסום של מודלים של עור אנושי על ידי טיפוח תחת היפוקסיה96 או ירידה בלחות יחסית97אפנון המטריצה העורית עם צ'יטוסאן,98ושינוי בחומצות השומן החופשיות במדיום התרבות,99. יתר על כן, הן RhEs פשוט ומורכב יותר, תנאי התרבות הרכב בינוני ניתן לווסת לחקות תכונות פתולוגיות. על ידי קריאת תיגר על המודל עם ציטוקינים, מורפולוגיה חריגה100 ושינויים ברמות ביטוי גנים וחלבונים ניתן לקבוע כי הם נצפו בדרך כלל בהפרעות עור נפוצות, כגון אטופיק דרמטיטיס ופסוריאזיס35,101,102,103,104,105. השתקת גנים ספציפיים בקרטינוציטים לפני ייזום תהליך ההשתקה מחדש של מודל תלת-ממד היא גישה נוספת המשמשת לחיקוי תכונות של הפרעות עור ולחקור פתרונות טיפוליים חדשים106,107. מלבד דוגמנות שכבת אפידרמיס בלבד, ניתן לכלול במודל תא עורי (כלומר, שווה ערך לעור אנושי או מודלים בעובי מלא) על ידי הטמעת פיברובלסטים במטריצת קולגן לפני ארגון מחדש של RhE, מה שהופך אותו לרלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית ומתאים למחקרים הקשורים להזדקנות וריפוי פצעים.108,109,110. בנוסף, ספירואידים גידול נוספו שווה ערך לעור האדם כדי ללמוד התקדמות מלנומה111,112. ההתקדמות האחרונה בתחום דגמי העור היא ביו-הדפסה ועור על שבב. קבוצות מחקר מרובות הצליחו לאחרונה בפיתוח מקבילות עור ביו-מודפסות (perfusable)45,113,114. הפרוטוקול המוצע מנצל פורמט של 24 באר ולוחית צליל תקשורת, ונמנע מתוספות שיש לטפל בהן בנפרד. עם זאת, סולם המחקר עדיין מוגבל למדי וחסר אוטומציה. על ידי יישום השימוש בביו-הדפסה או עור על שבב, ניתן להשתמש בדגמי עור קטנים יותר עם תהליכים אוטומטיים יותר ובקנה מידה גדול יותר.
ל- RhE המתואר בפרוטוקול זה יש קווי דמיון רבים לדגמי האפידרמיס המסחריים שכבר פותחו ומאופיינים היטב. הניתוח המורפולוגי הוכיח כי למרות שמספר השכבות המעשיות במודל RhE המוצע נמוך יותר בהשוואה לזה של עור אנושי מקומי (כלומר, 6-7 לעומת 7-14), הוא דומה לזה של מודל EpiDerm RhE (כלומר, 8-12)70. בדומה לדגמי האפידרם, האפיסקין ו- SkinEthic, שכבת RhE העליונה מציגה תבנית אריגת סל של שכבות קורנוציטים צפופות28. יתר על כן, ניתוח TEM גילה כי מספר שכבות SC במודל RhE המוצע (כלומר, 15-25) דומה לזה של EpiDerm (כלומר, 16-25)70. בסך הכל, מודל RhE המוצע מדגים מבנה דומה לזה של מודלים אפידרמיס ממוסחרים אחרים, מחקה את האפידרמיס האנושי יליד. שלמות הרקמה כפי שהיא נמדדת על ידי TEER היא בטווח עם דגמי RhE מסחריים (כלומר, בין 3000-5600 Ω.cm2)71,72,73 ו RhEs אחרים בתוך הבית (כלומר, כ 5000 Ω.cm2)74,115. מודל RhE המוצע מראה להיות מובחן היטב, כפי שצוין על ידי נוכחות ולוקליזציה נכונה של בידול וסמני הידבקות רקמות. יתר על כן, מודל RhE המוצע מראה להיות מגיב גירויים proinflammatory (כלומר, LPS ו TNF-α).
לסיכום, הפרוטוקול הנוכחי מראה כיצד לייצר RhEs בצורה אמינה ובקנה מידה גדול יחסית כדי לענות על הצרכים של חוקרים במוסדות אקדמיים ופרטיים כאחד. מודל RhE המוצע מראה שיש מורפולוגיה דומה, בידול אפידרמיס, והיענות ביולוגית למודלים מסחריים קיימים אחרים. הוא מספק כלי חלופי הן לתחום התרופות והן לתחום הדרמטו-קוסמטיקה כאשר נדרשת גישה למודל עור רלוונטי.

האפידרמיס הוא השכבה החיצונית ביותר של העור, בממשק הישיר בין גוף האדם לסביבה החיצונית. תפקידיו העיקריים הם לספק הגנה והידרציה1. האפידרמיס פועל כמחסום פיזי יעיל נגד גורמים חיצוניים ומונע אובדן מים מוגזם מהגוף. תפקודי עור אלה תלויים בעיקר בסידור התאי בשכבות החיצוניות ביותר של העור, בהרכב ובארגון השומנים הבין-תאיים2. האפידרמיס מורכב בעיקר מקרטינוציטים הנודדים כלפי מעלה לצד החיצוני של הרקמה ועוברים בידול. ישנן 4-5 שכבות אפידרמיס המאופיינים בשלב הבידול שלהן. מבפנים החוצה, שכבות האפידרמיס מתחילות מהאפידרמיס בר קיימא, כלומר, השכבה basale (SB), ספינוסום השכבה (SS), ואת גרנולוזום השכבה (SG), לשכבה העליונה שאינה בת קיימא, כלומר, קרן השכבה (SC)3. שכבת הבסיס מורכבת בעיקר מקרטינוציטים מועשרים בקרטין מתרבים, הנודדים דרך ה- SS עם הבידול4. במהלך התבגרות קרטינוציט, מתרחשים שינויים שונים בביטוי ובמבנה החלבון. קרטינוציטים דבקים בהיווצרות צמתים דמוסומליים5. בס"ג, דור גופי המללר הוא יזם. הם מורכבים מבשרי שומנים ואנזימים החיוניים להיווצרות תפקוד מחסום העור6. SG מאופיין גם על ידי נוכחות של גרגירי keratohyalin בציטופלסמה של קרטינוציטים. בממשק עם SC, התוכן של גופים lamellar מובלט לתוך החללים הבין תאיים ואת השומנים שאינם קוטב כגון ceramides, כולסטרול, וחומצות שומן חינם להתארגן לתוך bilayers השומנים לאמלרי מוערם כדי ליצור את מטריצת השומנים חוץ תאיים7. ב SC, תאים לאבד את כל אברונים הסלולר כולל הגרעין, בשל תהליכי השפלה אנזימטית לאמץ מורפולוגיה שטוחה. הם מוקפים מעטפה cornified עשוי שכבות חלבון מקושרים, והם מכונים corneocytes8,9. רכיבים דמוסומליים מקושרים למעטפת הקרנית כדי ליצור corneodesmosomes ולקשור את corneocytes יחד. האפיתל שנוצר מתחדש ללא הרף מתאי גזע, עם זמן מחזור של כ 5-6 שבועות10. תהליך הבידול של הקרטינוציטים, שתוצאתו אפידרמיס מרובד לחלוטין, הוא חיוני להיווצרות פונקציית המחסום של העור11.
במהלך פציעה ודלקת, קרטינוציטים לגרום לשינויים מולקולות הידבקות קולטני פני השטח ולהפעיל תגובות proinflammatory באמצעות הפרשת ציטוקינים, כימוקינים, פפטידים מיקרוביאלית12. העור הוא לא רק מחסום פיזי נגד חומרים אקסוגני; הוא משמש גם כחיישן חיסוני בעת חשיפה לפתוגנים. בנוסף, הוא מסדיר את הדיפוזיה של מספר חומרים על פני שכבותיו, כגון תכולת המים כדי להגן על גוף האדם מפני התייבשות. העור מעורב גם בסינתזה של ויטמין D ויש לו פונקציות מטבוליות שונות אחרות3,13,14.
כדי להעריך את ההשפעות השליליות של חומרים אקסוגניים, טוקסיקולוגים הסתמכו במשך עשרות שנים על ניסויים בבעלי חיים, אבל כיום זה לא הגישה המועדפת. מלבד יכולת חיזוי מוגבלת של רעילות אנושית, מודלים של בעלי חיים כרוכים בסוגיות אתיות רבות. האיסור על ניסויים בבעלי חיים בתעשיית הקוסמטיקה וההמלצה לפעול על פי עקרון 3R (כלומר החלפה, הפחתה ועידון) במחקר הובילו לפיתוח שיטות בדיקה חלופיות המבוססות על גישות במבחנה15. מודלים ראשונים של תאי עור במבחנה כבר תוארו בשנות ה -90, והתפתחות מרשימה מתרבויות מונו קרטינוציטים אנושיות פשוטות לאפידרמיס מובחן לחלוטין ומודלים בעובי מלא הושגה16. כיום, הנדסת רקמת העור צברה חשיבות הן בתחום התרופות והן בתחום הדרמטו-קוסמטיקה. בשני העשורים האחרונים, מספר חברות מיסחרו אפידרמיס אנושי תלת מימדי (3D) המשוחזר (RhE) המייצגים כלים סטנדרטיים ומשוחזרים למחקרים הקשורים לעור. מספר דגמי RhE מסחריים מתקבלים לבדיקת עור במבחנה של כימיקלים על פי הנחיות ה-OECD לבדיקת גירוי בעור17,18 (כלומר, הנחיות בדיקה 43919) וקורוזיה בעור20 (כלומר, הנחיות בדיקה 43121). מבחן במבחנה עבור רגישות העור22 (כלומר, SENS-IS assay) נמצא כעת במסלול האישור ותחת ביקורת עמיתים23. ישנם גם מבחנים רבים אחרים שפותחו כי לנצל מודלים מסחריים RhE, כדי להעריך phototoxicity24, כדי לבדוק ניסוחים סמים25, ניסוחים קוסמטיים ומרכיבים פעילים26, כדי ללמוד את תפקוד מחסום העור27 ולבדוק את התגובה הביולוגית לחצים סביבתיים28,29,30,31.
בנוסף לדגמי עור תלת מימדיים זמינים מסחרית, קבוצות מחקר מרובות פיתחו RhEs משלהם32,33,34,35,36,37. Es בתוך הבית מציעים את היתרון לשליטה בתנאי התרבות בהתאם למטרת המחקר. באופן ספציפי, החוקרים יכולים לבחור את הסוג ואת המקור של keratinocytes לשמש לשיחזור מודל האפידרמיס 3D שלהם (כלומר, ראשוני לעומת מונצח, יילודים לעומת גיל, יחיד לעומת בריכה תורמים אקראיים, מין, מוצא אתני, הרגלי חיים בודדים כגון עישון, וכו '). יש להם את האפשרות לשנות את הרכב מדיום התרבות ולשלב גורמי גדילה, ויטמינים, או תרכובות אחרות שיכולות לווסת את הביטוי של חלבוני היעד או שומנים. עם RhEs בתוך הבית, החוקרים יכולים גם לחקור תגובות ביולוגיות ותכונות ביומכניות כפונקציה של מצב הבידול של מודל 3D. בנוסף לפרמטרים אינטואיטיביים אלה, ישנם מאמצים מתמשכים להגביר את המורכבות של מודלים עור 3D ולהפוך אותם רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית, למשל על ידי הוספת סוגי תאים אפידרמליים אחרים (למשל מלנוציטים ותאיחיסון) 38,39, על ידי culturing keratinocytes על גבי מטריצת קולגן מאוכלס פיברובלסט40,41,42, ועל ידי הכללת רכיבים של רשת כלי הדם43,44,45.
למרות שניתן לכוונן את תנאי התרבות בהתאם לצרכים ספציפיים, ישנם פרמטרים שיש לכבד כדי להבטיח הן את האיכות ואת הרלוונטיות של RhE. כדי לטפח רקמות RhE, קרטינוציטים אפידרמליים אנושיים נורמליים (NHEKs) נזרעים לתוך תוספות תרבות חדירות ספציפיות אשר קרום סינתטי נקבובי מפריד את הבארות לשני תאים, כלומר, תא apical ו basolateral. נקבוביות הממברנה (כלומר, גודל נקבוביות של 0.4 מיקרומטר) היא כזו שהיא מאפשרת היווצרות של מונולאייר תא בתא האפסי ללא הגירה של תאים לצד הכנס הבסיסי, והאכלת הקרטינוציטים בחומרים מזינים חיוניים מאמצעי התרבות הכלולים בתא הבזולטרלי. בתחילת תהליך ההשבה, NHEKs מתורבתים בתנאים שקועים במשך כמה ימים כדי לאפשר את הדבקותם על הממברנה. רמת הסידן בשני התאים מוגברת בהשוואה לריכוז הסידן המשמש לתרבות הדו-ממד של NHEKs כדי להאט את התפשטות התאים ולקדם במקום זאת את הבידול שלהם46. שיפוע סידן אפידרמלי חיוני כדי לווסת את היווצרות המחסום ואת הומאוסטזיס47,48. רמות סידן גבוהות (כלומר, עד 1.5 מ"מ) לקדם את היווצרותם של צמתים בין תאיים לווסת את היווצרות המעטפה cornified במהלך בידול סופני49. לאחר קרטינוציטים יוצרים monolayer רציף ודבק בחוזקה על הממברנה התומכת, המדיום מהתא apical מוסר ואת תהליך התרבות ממשיך בממשק אוויר נוזלי (עלי) כדי לעורר ריבוד ולהקים מחסום אפידרמיס50,51. תנאי תרבות ספציפיים חיוניים להשגת אפיתל מרובד לחלוטין36. במהלך תהליך ההשבה ב ALI, המדיום בתא basolateral מתווסף פקטורי גדילה קרטינוציט (KGF), אינסולין, סידן, וחומצה אסקורבית. חומצה אסקורבית ממלאת תפקיד מרכזי בהיווצרות מחסום השומנים המתאים SC, דומה מאוד לזה של העור האנושי הילידי52. קרטינוציטים הגדלים במדיום אסקורבי בתוספת חומצה מדגימים פנוטיפ מובחן, עם מספר משופר של גרגירי קרטוהילין, כמו גם לאמלה שומנים בין תאיים מאורגנים ב interstices של corneocytes52. תוספת כזו חיונית כדי לשפר את תפקוד מחסום האפידרמיס על ידי הגדלת תכולת מעטפה cornified והימנעות דלדול של חנויות נוגדות חמצוןהידרופיליות 53,54. KGF, מתווך פרקרין חשוב של התפשטות אפידרמיס ובידול, משמש כדי לעורר את NHEKs55.
החסרונות העיקריים של RhEs בתוך הבית כוללים את אובדן התקינה בין מוסדות מחקר ועוצמה עבודה מוגברת וצריכת זמן (עד 3 שבועות לעומת מודלים מסחריים מוכנים לשימוש). מטרת הנייר הנוכחי היא לטפל בחסרונות אלה, הגדרת הבסיס לייצור בקנה מידה גדול יותר. בנוסף ליתרונות הנ"ל של RhEs בתוך הבית, הפרוטוקול הנוכחי נועד להפחית את השונות התוך-אינטר-משתנה בין הרקמות, להפחית את סיכוני הזיהום ולייעל את תהליך הטיפוח.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה הניתנת לשחזור וחזקה לטיפוח RhEs באמצעות NHEKs יילודים. יתר על כן, הוא מראה תוצאות מייצגות של אפיון המורפולוגיה RhEs, שלמות המחסום, וביטוי של חלבונים ספציפיים לבידול אפידרמיס. המבנה המורפולוגי של ורס נבדק באמצעות מטוקסילין ואאוסין (H&E) מכתימים ומיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM). כדי להעריך את שלמות המחסום, נמדדו ההתנגדות החשמלית הטרנס-פידרמלית (TEER) וזמן החשיפה לטריטון X-100 כדי להפחית 50% מכדאיות הרקמות (ET50). היווצרות צמתים desmosomal (כלומר, desmoglein 1) נותח על ידי immunofluorescence (IF) כדי להעריך הידבקות קרטינוציטית. היווצרותם של חלבונים מבניים אפידרמליים (כלומר, involucrin, loricrin, ו filaggrin) הוערך וזוהה עם IF. חלבונים אלה מעורבים בהיווצרות מעטפת החלבון המקושרת מאוד המקיפה את הקורנאוציטים של SC וכתוצאה מכך הם סמנים חשובים לבידול אפידרמיס בשלב מאוחר56,57. בנוסף, IF שימש לניתוח קרטין 10, חלבון המושרה בתאים מובחנים בשלב מוקדם ב- SS58 ונמצא בתוך כל השכבות המובחנות. לבסוף, התגובה של RhE לגירויים פרואינפלמטוריים (כלומר, lipopolysaccharide וגורם נמק הגידול אלפא) נחקרה. רמות האינטרלוקין 1 אלפא (IL-1α) והאינטרלוקין 8 (IL-8) נמדדו במדיית תרבות התא, באמצעות מבחנים אימונוסורבנטיים הקשורים לאנזימים (ELISA).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Acetic acid</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >A6283</td>
			<td >Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibiotic-antimycotic (100x)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aqueous Eosin Y solution</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >HT110280</td>
			<td >Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td >Sigma Aldrich or Merck</td>
			<td>C8106 or 1.02378.0500</td>
			<td >Prepare a stock solution of 0.144 M, filter sterilize and store aliquots at -20 &#176;C.&#160; It is recommended to prepare new aliquots every 6 months.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>Prepare a stock at 100 &#956;g/mL and store aliquots at -20 &#176;C. Working conditon is 1 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Entellan mounting medium</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.07960.0500</td>
			<td>Mounting medium for H&#38;E staining.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EpiLife medium (referred to as keratinocyte growth medium)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>MEPI500CA</td>
			<td >Contains 0.06 mM of Ca2+.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol absolute</td>
			<td >Any supplier</td>
			<td >N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formalin 10%</td>
			<td >Leica Biosystems</td>
			<td >3800770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human keratinocytes growth supplement (HKGS) (100x)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>S0015</td>
			<td >To reach final concentrations of 0.2% [v/v] BPE, 0.2 ng/mL human recombinant EGF, 0.18 &#956;g/mL hydrocortisone,5 &#956;g/mL bovine transferrin, and 0.01 &#181;g/mL human recombinant insulin-like growth factor-I.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropanol</td>
			<td >Biosolve B.V.</td>
			<td >0016264102BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kaiser&#39;s glycerol gelatine, phenol-free</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.08635.0100</td>
			<td>Mounting medium for IF staining.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Keratinocyte growth factor (KGF)</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG-050</td>
			<td >Reconstitute KGF protein at 100 &#956;g/mL in sterile 0.1% [w/v] BSA in PBS. Prepare aliquots and store at -20&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lactate dehydrogenase (LDH) assay kit</td>
			<td >Roche</td>
			<td >4744926001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td >Prepare a stock solution of 25 mg/mL, filter sterilize and store aliquots at -20&#176;C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. Store in the dark.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lipopolysaccharide (LPS), E.coli strain O55:B5</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >L4524</td>
			<td >Prepare a stock of 1 mg/mL in sterile PBS and store aliquots at -20 &#176;C. Working concentration is 100 &#956;g/mL.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mayer&#8217;s Haematoxylin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >MHS80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs)</td>
			<td >Lonza</td>
			<td>00192906</td>
			<td >Human primary keratinocytes isolated from neonatal foreskin, pooled from at least three donors.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10010056 or 10010-015</td>
			<td >Reference numbers can vary between countries.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;)</td>
			<td >ImmunoTools</td>
			<td >11344483</td>
			<td>Prepare a stock of 100 &#956;g/mL in sterile ultrapure water. Working concentration is 40 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile ultrapure water</td>
			<td >Any supplier</td>
			<td >N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M5655</td>
			<td>Prepare a stock of 5 mg/mL MTT in sterile PBS. Working concentration is 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>93426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan blue (0.4% [v/v])</td>
			<td >Any supplier</td>
			<td >N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin inhibitor</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>R007100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA (0.05% [v/v])</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tween 20</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylene</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab150113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tri-sodium citrate dihydrate</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.06448.0500</td>
			<td>For antigen retrieval buffer for IF staining.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Dylight 488)</td>
			<td >Agrisera</td>
			<td>AS09 633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filaggrin Mouse antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP2-53243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Involucrin Rabbit antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP2-33742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Keratin 10 Mouse antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP2-32962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Desmoglein-1 Mouse antibody&#160;</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>MAB944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Loricrin Rabbit antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP1-33610</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivating a three-dimensional reconstructed human epidermis at a large scale

מודל אפידרמיס אנושי תלת מימדי ששוחזר מקרטינוציטים ראשוניים של יילודים מוצג. להלן מתואר פרוטוקול לתהליך הטיפוח ולאפיון המודל. קרטינוציטים ראשוניים של יילודים גדלים שקועים על מוסיף פוליקרבונט חדיר ומרימים לממשק נוזלי האוויר שלושה ימים לאחר הזריעה. לאחר ארבעה עשר ימים של גירוי עם גורמי גדילה מוגדרים וחומצה אסקורבית במדיום תרבית סידן גבוהה, המודל מובחן לחלוטין. ניתוח היסטולוגי חשף אפידרמיס מרובד לחלוטין, מחקה את המורפולוגיה של עור אנושי ילידי. כדי לאפיין את המודל ואת פונקציות המחסום שלו, רמות החלבון והלוקליזציה הספציפית לבידול קרטינוציט בשלב מוקדם (כלומר, קרטין 10), בידול בשלב מאוחר (כלומר, אינוולוקרין, לורירין ופילגרין) והדבקת רקמות (כלומר, desmoglein 1), הוערכו על ידי כשל חיסוני. שלמות מחסום הרקמה הוערכה עוד יותר על ידי מדידת התנגדות חשמלית טרנספיתליאלית. אפידרמיס אנושיeconstructed היה מגיב גירויים proinflammatory (כלומר, lipopolysaccharide ו גורם נמק הגידול אלפא), המוביל שחרור ציטוקינים מוגברת (כלומר, interleukin 1 אלפא ואינטרלוקין 8). פרוטוקול זה מייצג שיטת במבחנה פשוטה הניתנת לשחזור כדי לטפח אפידרמיס אנושי משוחזר ככלי להערכת השפעות סביבתיות ומגוון רחב של מחקרים הקשורים לעור.

NHEKs בתרבית דו-מימדית מציגים מורפולוגיה מסורתית עם צורת מצולע עקבית (איור 2A). כפי שתואר לעיל, NHEKs הם זרע לתוך מוסיף תרבות לאחר שהגיעו מפגש של כ 80%. המורפולוגיה של הרז נותחה באמצעות כתמי H&E ו- TEM. לאחר 15 ימים ב- ALI, רקמה מרובדת במלואה מתקבלת כפי שמציינים ארבע שכבות האפידרמיס העיקריות שלה: SB, SS, SG, ו SC (איור 2B). בשכבת SB, לתאים יש צורה טורית. מהשכבה השנייה לכיוון השכבות העליונות של RhE, NHEKs מבדילים כפי שנצפה על ידי השינויים במורפולוגיה של התא (מצורה טורית בשכבת SB, לעבר צורה מסתובבת בשכבת ה- SS). בשכבת SG, לתאים יש צורה שטוחה יותר והם מציגים גרגירי קרטוהיאלין (KG) המיוצגים כנקודות סגולות בציטופלסמה. צורתם העגולה והמכוכמת האופיינית מסומנת בחצים לבנים בתמונת H&E (איור 2C). התאים ב SC, הם מובחנים סופני והם שטוחים לחלוטין וחסר גרעין התא. לעובי הכולל של ה-RHEs המ מרובד של 84.3 ± 2.4 מיקרומטר ועובי ה-SC שלהם הוא 19.6 ± 3.2 מיקרומטר (איור 2D). ערכים אלה דומים לאלה שדווחו עבור עור אנושי ילידי, כלומר, 60-120 מיקרומטר ו 10-20 מיקרומטר, בהתאמה69. מספר שכבות קיימא הוא 6-7, אשר נמוך יותר בהשוואה לזה של העור האנושי המקומי, להיות כ 7-1470. ניתוח אולטרה-מבני של RhEs בנקודות זמן שונות בפרוטוקול ההשבה (כלומר, 7, 10, 13 ו-15 ימים) חושף את תהליך הקורניפיקציה של ה-RhEs עם מספר גדל של שכבות קורנוציטים לאורך זמן (איור 2E). לאחר 15 ימים ב ALI, SC של רקמת RhE עשוי כ 15-25 שכבות, אשר דומה לערך שדווח עבור עור אנושי ילידי (כלומר, 15-20 שכבות)69.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig2v2.jpg"> איור 2: קרטינוציטים ראשוניים ואפידרמיס אנושי משוחזר. (A) תמונת מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה של קרטינוציטים ראשוניים לפני הזריעה על מוסיף. סרגל קנה המידה הוא 50 מיקרומטר. (B-C) H&E מיקרוסקופיה שדה בהיר תמונה של RhE. סרגל קנה המידה הוא 50 מיקרומטר (B) ו 25 מיקרומטר(C). (D)כימות עובי של RhE ו- SC (ממוצע ± SEM, n = 3). (ה)העברת תמונות מיקרוסקופיה אלקטרונים של חתכים RhE לאחר 7, 10, 13, ו 15 ימים ב ALI. סרגל קנה המידה הוא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig2v2large.jpg" target="_blank"></a> 4 מיקרומטר.
על פי שלב הבידול שלהם, NHEKs הגדלים בתלת-ממד מראים פרופילי ביטוי חלבון שונים בהתאם לשלב הבידול שלהם. הביטוי של חלבונים ספציפיים לבידול קרטינוציט בשלב מוקדם (כלומר, קרטין 10), בידול קרטינוציט בשלב מאוחר (כלומר, אינבולוקרין, לורירין ופילגרין), והדבקה קרטינוצית (כלומר, desmoglein 1) ב Rhes נקבע באמצעות כתמי IF. ביטוי Involucrin מופיע בעיקר בשכבת SG מאז הביטוי שלו הוא יזם מוקדם יותר במהלך תהליך הבידול (איור 3D), ואילו filaggrin ו loricrin באים לידי ביטוי בשכבות העליונות (איור 3B-C). ביטוי קרטין 10 נמצא בכל השכבות המעשיות, למעט שכבת SB(איור 3E). RhEs מציגים צמתים desmosomal פונקציונלי, כפי שצוין על ידי הביטוי של desmoglein 1 במרחב הבין תאי של שכבות אפידרמיס קיימא (איור 3F). לסיכום, כל חמשת הסמנים באים לידי ביטוי וממוקמים בשכבות האפידרמיס המתאימות ומתורגמים לתהליך בידול אפידרמיס בריא.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig03.jpg"> איור 3: התמיינות אפידרמלית, הידבקות ברקמות ושלמות רקמות של אפידרמיס אנושי משוחזר. תמונות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות קונפוקאליות של (B) פילגרין (FLG), (C) לוריקרין (LOR), (D) involucrin (INV), (E) קרטין 10 (K10), ו (F) desmoglein 1 (DSG-1) המיוצג במגנטה. כתמי גרעינים (DAPI) מיוצגים בכחול. סרגל קנה המידה הוא 25 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig03large.jpg" target="_blank">מיקרומטר.</a>
תכונות המחסום של מודל RhE נחקרו על ידי הערכת הכדאיות והיושרה של הרקמה. שלמות הרקמה נקבעה לאחר 15 יום על ידי מדידת TEER באמצעות voltohmmeter. ערכי 2567 ± 415 Ω.cm2 שנרשמו עבור ה-RhEs מתרגמים היווצרות של מחסום רציף (איור 4A). ערכים אלה נמצאים בטווח עם אלה שדווחו עבור דגמי RhE71,72,73,74. בנוסף, זמן החשיפה הנדרש עבור חומר כימי התייחסות ציטוקסי (כלומר, טריטון X-100) כדי להפחית את הכדאיות של הרקמה על ידי 50% (ET50)נקבע עם thiazolyl כחול טטרזוליום ברומיד (MTT) בדיקה. ערך ET50 שנמדד עבור RhE היה 2.1 שעות. ערך זה נופל בטווח הקבלה של מודלים אפידרמיס 3D אחרים המוסמכים לחיזוי אמין של סיווג גירוי (ה-OECD הנחיות 439)19.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig4v3.jpg"> איור 4: מאפייני מחסום של אפידרמיס אנושי משוחזר. (A) שלמות רקמות נמדדה בהתנגדות חשמלית transepithelial (ממוצע ± SEM, n = 6). (B)ET50 נקבע על ידי מדידת הכדאיות של רקמות (כלומר, MTT assay) על חשיפה אקטואלית ל 78.3 μL של 1% טריטון X-100 (ממוצע ± SEM, n = 3).
היענות של ריס נחקרה על גירויים פרואינפלמטוריים ידועים. RhEs טופלו באופן מערכתי, כלומר, תוספת של גירויים במדיום של תא basolateral, באמצעות 100 מיקרוגרם / מ"ל Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) ו 40 ננוגרם / מ"ל גידול נמק גורם אלפא (TNF-α). לאחר 24 שעות של גירויים, מדיום תרבות התא נאסף. הציטוטוקסיות נמדדה באמצעות בדיקת דהידרוגנאז לקטט (LDH) ובהשוואה לערכים של משבש קרום ידוע, חומר הניקוי טריטון X-100 (איור 5). עלייה משמעותית (p < 0.05, ANOVA בכיוון אחד, מבחן ההשוואה המרובות של דאנט) הוצגה בפעילות LDH ב- RhEs שטופלה בטריטון X-100. טיפולי LPS ו-TNF-α הראו שניהם שאינם ציטוטוקסיים.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig5v3.jpg"> איור 5: הציטוטוקסיות נמדדה באמצעות בדיקת דהידרוגנאז לקטט (LDH). הנתונים מוצגים כערכים יחסיים לשליטה, רקמות שאינן מטופלות (CTRL); ממוצע ± SEM, n = 9 (טריטון X-100), n = 8 (LPS), n = 3 (TNF-α). משמעות נבדקה עם ANOVA חד כיווני, מבחן ההשוואה המרובים של דאנט. כוכבית מציינת הבדל מובהק סטטיסטית בהשוואה ל- CTRL, ****p < 0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig5v3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
שחרורו של אינטרלוקין 1 אלפא (IL-1α) ואינטרלוקין 8 (IL-8) במדיום RhE כומת באמצעות ELISAs. איור 6 מציג הן את מהדורת IL-1α היחסית והן את שחרור IL-8 על ידי ה-RhEs באתגר עם LPS ו-TNF-α. טיפול LPS הביא משמעותי סטטיסטית (p < 0.05, T-test של סטודנט unpaired) המושרה שחרור של IL-8 (9.6 ± 1.0 פי 1.0 עלייה) ו IL-1α (2.7 ± 1.3 פי עלייה). TNF-α לא לגרום באופן משמעותי את שחרור IL-8, למרות שנצפתה נטייה לעלייה ברמות IL-8 (עלייה של 2.3 ± פי 0.8). עם זאת, TNF-α עשה באופן משמעותי (p < 0.05, מבחן T של סטודנט unpaired) להפעיל IL-1α שחרור (1.8 ± 0.5 עלייה קיפול).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig6v3.jpg"> איור 6: תגובות פרוינפלמטוריות באפידרמיס האנושי המשוחזר. ריכוזים של IL-8 שחרור על ידי RhE על אתגר 24 שעות ביממה עם LPS (A) ו TNF-α (B). הנתונים מיוצגים כמשמעותיים ± SEM, n = 8 (LPS), n = 3 (TNF-α). (C) הנתונים מיוצגים כ ממוצע של ערך יחסי בהשוואה לפקד, רקמות לא מטופלות (CTRL) ± SEM, n = 8 (LPS), n = 3 (TNF-α). הריכוז של שחרור IL-1α של RhE על אתגר של 24 שעות עם LPS (D) ו TNF-α (E). הנתונים מיוצגים כמשמעותיים ± SEM, n = 8 (LPS), n = 3 (TNF-α). (F) הנתונים מיוצגים כ ממוצע של ערך יחסי בהשוואה ל- CTRL ± SEM, n = 4 (LPS), n = 3 (TNF-α). המשמעות נבדקה על ידי מבחן T של תלמיד לא משוי. כוכבית מציינת הבדלים מובהקים סטטיסטית בהשוואה ל- CTRL, *p < 0.05, ****p < 0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig6v3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale at JoVE.com

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לטיפוח אפידרמיס אנושי תלת מימדי מחדש באופן ניתן לשחזור וחזק. בנוסף, הוא מאפיין את הקשר המבני-פונקציה של מודל מחסום האפידרמיס. התגובות הביולוגיות של האפידרמיס האנושי המחודש על גירויים proinflammatory מוצגים גם.

טיפוח אפידרמיס אנושי תלת מימדי משוחזר בקנה מידה גדול

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

אין ויטרו או מודל אפידרמיס אנושי בנוי פותחו לראשונה בשנות התשעים במטרה העיקרית לפתח שיטות בדיקה חלופיות לניסויים בבעלי חיים. אלה מודלים אפידרמיס 3D משמשים כיום נפוץ כדי לבדוק הן את הבטיחות ואת היעילות של מרכיבים קוסמטיים. בעוד שניתן לרכוש אותו ממספר ספקי רקמות, היכולת לבנות מחדש דגם תלת מימד במעבדה מעניקה גמישות רבה יותר לנקודת העניין הסופית.ישנם מספר מאמרי מחקר המתארים בקצרה את פרוטוקול ההשבה מחדש של מודל אפידרמיס תלת מימדי, אך עד כה לא היה סרטון זמין המציג את השלבים הקריטיים של תהליך ההשבה מחדש. זו הסיבה מאחורי פרסום נייר וידאו זה. הכנת האפידרמיס האנושי המשוחזר מאפשרת חופש רב בתהליך הכת, כגון שינויים בהרכב המדיום התרבותי, גורמי לחץ פרו דלקתיים או חמצוניים, השתקת גנים מעניינים ועיכוב או גירוי של תהליכים ביולוגיים מסוימים.כדי להתחיל, להפשיר בקבוקון עם 1 מיליון קרטינוציטים אפידרמיס אנושיים שמורים קריו, או NHEKs, באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס על ידי שקוע חלק של הבקבוקון במים. דגירה את הבקבוקון במשך דקה עד שתי דקות באמבט המים, עד רק רסיס קטן של קרח גלוי. לשים מחדש את התאים בזהירות רבה על ידי pipeting למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש פעמים.להעביר את המתלה התא לתוך שני בקבוקים T75 המכילים סך של 15 מיליליטר של מדיום הפשרה הזהיר מראש, וכתוצאה מכך צפיפות זריעה של 6.7 פעמים 10 לתאים הרביעי סנטימטר בריבוע. ממלאים מראש 24 צלחות באר עם 1.5 מיליליטר של מדיום שקוע, באופן אידיאלי באמצעות פיפטה מתקן. לאחר culturing התאים ל 80%confluency, הם מוכנים זריעה מוסיף לטיפוח אפידרמיס אנושי משוחזר, או RHEs.הסר את המדיום הבזלי מהבקבוקים T75 עם NHEKs. לשטוף את התאים על ידי הוספת חמישה מיליליטר של PBS מחומם מראש לכל בקבוק T75, ולאחר מכן להסיר את PBS מן הבקבוקים. הוסף שניים עד שלושה מיליליטר של 0.05% טריפסין-EDTA מחומם מראש לכל בקבוקון, מוודא כי פתרון טריפסין מופץ באותה מידה על אזור תרבות התא של הבקבוק.מניחים את הבקבוקים באינקובטור תרבות התא במשך ארבע דקות, ולאחר מכן לבדוק אם התאים לנתק באמצעות המיקרוסקופ בהגדלה 10 X. ראפ הבקבוק כדי לעזור לתאים לשחרר מפני השטח של הבקבוק. לאחר שכל התאים מנותקים, להוסיף נפח שווה של מעכב טריפסין שחומם מראש לכל בקבוק T75, ולהעביר את השעיית התא מן הבקבוקים לצינור צנטריפוגה.שוטפים את הבקבוקים בחמישה מיליליטר של PBS שחומם מראש ומעבירים אותו לצינור הצנטריפוגה המכיל את השעיית התא. צנטריפוגה התאים שנקטפו ב 400 פעמים G במשך חמש דקות. בזהירות להשליך את רוב supernatant משאיר כ 100 כדי 200 microliters בצינור.בעדינות להעיף את הצינור עם האצבעות שלך כדי לשחרר בזהירות את גלולה. בעדינות resuspend גלולה של תאים בנפח נמוך של מדיום שקוע, pipeting למעלה ולמטה 5 עד 10 פעמים כדי להבטיח השעיית תא אחיד. התחל עם נפח נמוך כדי למנוע היווצרות של צבירות תאים, ולהוסיף עד מיליליטר אחד של מדיום שקוע לכל בקבוק T75 הראשונית.ספירת התאים בהשעיה באמצעות שיטת אי-הכללה כחולה trypan. לדלל את השעיית התא עם מדיום שקוע נוסף כדי להגיע לריכוז של 3.525 פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר, באמצעות המשוואה הראשונה המסופקת בכתב היד טקסט. בצע ספירת תאים שנייה של הפתרון המדולל והשתמש במשוואה השנייה בכתב היד של הטקסט כדי לחשב את נפח השעיית התא שיש לזרוע לתוך התוסף התרבותי.תלו את 24 תרביות הבאר במיקום הגבוה ביותר של לוחית הובלה, והעבירו את לוחית הנשא לצלחת 24 הבאר המלאה מראש במדיום שקוע. הוסף את אמצעי האחסון שנקבע של השעיית התא לכל הכנס, תוך דאגה לא לגעת בהכנס. לאחר הזריעה, דגירה את 24 לוחות באר במשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי להתגבר על אפקט קצה.אין להזיז את הצלחות במהלך תקופה זו. מעבירים את הצלחות לחממת תרבות התאים ומשאירים אותן בתנאים שקועים במשך שלושה ימים. לאחר דגירה של שלושה ימים באינקובטור תרבית התא, לחשוף את התאים שדבקו משטח הממברנה לממשק נוזל האוויר, או ALI, על ידי הסרת המדיום שקוע מן התא apical עם מערכת שאיפה פיפט פסטר זכוכית.מלאו 24 צלחות באר חדשות ב-1.5 מיליליטר של מדיום ALI טרי ומחומם מראש, והעבירו את לוחות המוביל עם תוספות התרבות ללוחות המולטי באר החדשים. מעבירים את הצלחות הרב-בארות בחזרה לחממה של תרבות התאים. רענן את מדיום ALI כל יומיים עד שלושה ימים, במשך 14 ימים.קרטינוציטים בתרבות דו-מימדית מציגים מורפולוגיה מסורתית עם צורה מצולעת עקבית. לאחר 15 ימים ב ALI, האפידרמיס האנושי המשוחזר יוצר רקמה מרובדת לחלוטין, אשר מסומן על ידי ארבע שכבות האפידרמיס העיקרי שלה. ניתוח אולטרה-מבני של האפידרמיס האנושי המשוחזר בנקודות זמן שונות בפרוטוקול השיקום חושף את תהליך הקרנית, עם מספר מוגבר של שכבות אתר קרנית לאורך זמן.קרטינוציטים באפידרמיס מראים פרופילי ביטוי חלבון שונים על פי שלב הבידול שלהם. ביטוי Involucrin מופיע בעיקר בשכבת SG, ואילו הביטוי של filaggrin ו loricrin ממוקם בשכבות העליונות. ביטוי קרטין-10 נמצא בכל השכבות המעשיות למעט שכבת SB.האפידרמיס האנושי המשוחזר מציג צמתים desmosomal פונקציונלי, כפי שצוין על ידי הביטוי של Desmoglein-1 במרחב הבין תאי של שכבות אפידרמיס קיימא. תכונות המכשול של מודל האפידרמיס המשוחזר נחקרו על ידי הערכת הכדאיות של הרקמה על טיפול מקומי עם משבש מחסום ידוע, ועל ידי הערכת שלמות הרקמה. שלמות הרקמה נקבעה לאחר 15 יום על ידי מדידת ה- TEER עם מד נפח.היענות של האפידרמיס Lipopolysaccharide ו גורם נמק הגידול אלפא נחקרה. גם טיפולי אלפא LPS וגם TNF לא היו רעילים. יחסית לבקרת טריטון אקס-100.שחרורו של אינטרלוקין-1 אלפא ואינטרלוקין-8 במדיום RHE כומת באמצעות תמוגה IL. טיפול LPS הביא לרגולציה משמעותית סטטיסטית בשחרור אלפא Interleukin-1 ואינטרלוקין-8. טיפול אלפא TNF הביא לרגולציה משמעותית סטטיסטית רק בשחרור של Interleukin-1 אלפא.עם זאת, נטייה ברורה של רמות אינטרלוקין-8 מוגברת נצפתה גם על גירוי עם אלפא TNF. בהתאם לפרוטוקול זה, ניתן למדוד את TEER כערך עבור תקינות המחסום. הכדאיות או הציטוטוקסיות ניתן למדוד על ידי MTT או LDH assay, למשל.Supernatant יכול לשמש כדי למדוד את הפרשת ציטוקינים או חלבונים אחרים. יתר על כן, הרקמה יכולה לשמש כדי ללמוד את הביטוי של חלבונים או גנים של עניין.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Bioengineering

Unit 1

The Integumentary System

SCIENTISTS IN ACTION

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

אלגינט הידרוג לתרבות תלת ממדי איברים של השחלות Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

עור תלת ממדי האדם לשחזר דגם: ככלי מחקר עור רגיל התקדמות מלנומה

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

הדפסה מישוריים תלת ממדי של דיו מוליך

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

ייצור רקמת סחוס אנושי באמצעות שלושה ממדי הזרקת דיו טכנולוגיית הדפסה

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

ניתוח של נדידת תאים בתוך קולגן מטריקס תלת ממדי

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

ייצור שיבוט וקנה מידה גדולה של וקטורי adenoviral בקיבולת גבוהה המבוססים על סוג Adenovirus האדם 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

תלת ממדי טכנולוגיה Biomimetic: רומן Biorubber יוצר מוגדרת מיקרו מאקרו בקנה מידה ארכיטקטורות ב הידרוג קולגן

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

הכנה וניתוח של<em&gt; במבחנה</em&gt; שלושה שד ממדי המחליפים קרצינומה

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

פיתוח תאיים תלת ממד Organotypic דגם של אדם המעיים הריריים Grown במיקרוגרבטיציה

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

פלטפורמת מעבדה-על-CD ליצירת רב-תאיים תלת מימדי

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...