Name: cultivating a three-dimensional reconstructed human epidermis at a large scale
Uploaded: 2021-05-28T13:30:00
Duration: 8 min 49 s
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보조금 협정 제1호와 함께 마리 스크와도우스카-퀴리 그랜트(Marie Skłodowska-Curie Grant)의 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램은 765602 이 사업에 자금을 지원했습니다. 모든 저자는 아돌프 머클 재단과 페라라 대학의 지원을 인식하고 감사 다우 실리콘 벨기에 인정. 미겔 스푸흐 칼바르 박사는 RhE 재배 과정의 그래픽 이미지를 준비한 것으로 인정됩니다. 저자들은 바바라 드래슬러 박사, 프랑코 세르벨라티 박사, 아그네스 테시에 박사의 기술 적 지원과 토론에 감사드립니다.

이 프로토콜과 관련된 연구 활동을 계획하고 실행하기 전에 인간 조직 이나 세포의 사용과 관련된 국내 및 국제 윤리적 고려 사항 및 조건을 검토하고 준수하십시오. 참고: 이 프로토콜의 모든 단계는 무균 조건에서 수행해야 합니다. 생물 안전 수준 2 관행은 RhEs 의 재배를위한 최소 요구 사항입니다. 이 프로토콜에 설명된 화학 물질/시약을 처리할 때 필요한 모든 안전 예방 조치를 취해야 합니다.
1. 세포 배양 매체의 준비
참고: RhEs(표 1)의 재배에 사용되는 세럼이 없는 배양 배지의 세 가지 종류가 있습니다: (i) NHEKs의 2D 배양에 사용되는 낮은 칼슘 수준(60 μM Ca2+)을가진 기저 배지; (ii) 세포 배양 삽입 시스템으로 NHEKs의 시드를 위해 사용되는 높은 칼슘 수준(1.5mM Ca2+)을가진 침수 된 배지; (iii) 높은 칼슘 수준(1.5mM Ca2+),아스코르브산 및 각질 세포 성장 인자(KGF)를 가진 공기-액체 인터페이스(ALI) 배지.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>보통</td>
			<td>중간 정보</td>
			<td>필요한 수량</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">기저 매질</td>
			<td>각질 세포 성장 매체</td>
			<td rowspan="3">36 mL/24 우물</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v / v] HKGS</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v /v] 100x 항생제 항진균제</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">잠긴 매체</td>
			<td>각질 세포 성장 매체</td>
			<td rowspan="4">36 mL/24 우물</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v / v] HKGS</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v /v] 100x 항생제 항진균제</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1.5 mM Ca2 +
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">공기 액체 인터페이스 매체</td>
			<td>각질 세포 성장 매체</td>
			<td rowspan="6">216 mL/24 우물</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v / v] HKGS</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v /v] 100x 항생제 항진균제</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1.5 mM Ca2 +
</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 50 μg/mL 아스코르브 산</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 10 ng/mL 각질 세포 성장 인자</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1. RhEs를 육성하는 데 사용되는 다양한 문화 매체의 요약 표. 보충 교재와 다른 문화 미디어의 목록.
<ol><li>기저 배지를 준비합니다.<ol>
<li>0.2%의 최종 농도에 도달하기 위해 인간 각질 세포 성장매체(재료표)의500mL병을 보충하여 0.2% [v/v] 소 뇌하수체 추출물(BPE), 0.2 ng/mL 인간 재조합 피종 성장 인자(EGFL/ML), mGFL 08 5 μg/mL 소 소 전달자, 및 0.01 μg/mL의 재조합 인간 인슐린 같은 성장 인자-I(IGF-I).</li>
		<li>페니실린 10,000 단위/mL, 연쇄상 구균의 10,000 μg/mL, amphotericin B의 25 μg/mL을 포함하는 100x 항생제 항진용액의 5mL를 추가합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>잠긴 매체를 준비합니다.<ol>
<li>0.2% [v/v] BPE의 최종 농도에 도달하기 위해 HKGS의 5mL와 함께 500mL의 각질 세포 성장매체(재료 표)의병을 보충하고, 0.2 ng/mL 인간 재조합 EGF, 0.18 μg/mL 하이드로코르티손, 5 μg/mL 소 이송린, 인간 재조합 IGF-I의 0.01 μg/mL.</li>
		<li>100x 항생제 항진균용액 5mL를 추가합니다.</li>
		<li>0.144 M CaCl2 (염화 칼슘) 스톡 용액의 5mL을 추가하여 최종 농도1.5mMCa2+를도달하십시오. 참고: 칼슘 농도는 이미 각질 세포의 분화를 자극하고 계층화 과정을 개시하기 위해 침수 된 단계 동안증가된다(49)</li>
	</ol>
</li>
	<li>공기-액체 인터페이스(ALI) 매체를 준비합니다.<ol>
<li>0.2% [v/v] BPE의 최종 농도에 도달하기 위해 HKGS5mL의 500mL 의 각질 세포 성장매체(재료 표)1병을 보충하고, 0.2 ng/mL 인간 재조합 EGF, 0.18 μg/mL 하이드로코르티손, 5 μg/mL 소 이송린, 인간 재조합 IGF-I의 0.01 μg/mL.</li>
		<li>100x 항생제 항진균용액 5mL를 추가합니다.</li>
		<li>0.144 M CaCl2 스톡 솔루션의 5mL를 추가하여 최종 농도인 1.5mMM Ca2+를 도달합니다.</li>
		<li>25 mg / mL 아스코르브 산 재고 용액의 1 mL을 추가하여 50 μg / mL 아스코르브 산의 최종 농도에 도달하십시오.</li>
		<li>인산염 완충식식염수(PBS) 스톡 용액에 100 μg/mL KGF의 50 μL을 10ng/mL KGF의 최종 농도에 도달합니다. 참고: 아스코르브산은 산화에 민감하기 때문에 마그네슘 l-아스코르비-2-인산염59 또는 L-아스코르브산 2인산 세스키마그네슘(60)과 같은 안정적인 아스코르빅 산유도체를 사용하는 것이 좋습니다. 아스코르브산을 사용하는 경우, 새로 고침 하기 전에 아스코르브 산으로 ALI 매체를 보충 하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NHEK의 문화
참고: 1차 인간 각질세포는4·5항 61절에증식상태로 남아 있기 때문에, 세 번째 구절의 NHEK는 RhEs의 재배에 사용된다. 기본 각질 세포는 높은 감도 로 인해 매우 신중하게 처리해야합니다. 언제든지 셀 서스펜션의 신중하고 느린 파이프팅은 세포의 상태를 방해하지 않는 것이 매우 중요합니다.
<ol><li>물 속에서 유리병의 일부를 침수하여 37°C의 수조에 1 x 106 극저온 NHEKs로 병병을 해동하십시오. 작은 얼음 조각만 보일 때까지 수조에서 1-2 분 동안 유리병을 배양하십시오. 주의: 오염을 피하기 위해 수조에 전체 유리병을 담그지 마십시오. 세포를 2분 이상 해동하지 마십시오. 이렇게 하면 셀 생존가능성을 줄일 수 있습니다. 튜브를 라미나르 후드로 옮기기 전에 70% 에탄올 용액으로 바이알을 닦습니다.</li>
	<li>2-3회 위아래로 파이프를 통해 세포를 매우 신중하게 재연합니다. 셀 서스펜션을 총 15mL의 사전 온온 해동 배지를 함유한 2개의 T75 플라스크로 전달하여 6.7 x 104 세포/cm2의파종 밀도를 초래한다. 참고: 처음 두 구절및 냉동 보존 NHEKs의 해동에 대 한, 세포 배양 매체 는 공급자의 권고에 따라 사용 됩니다.</li>
	<li>플라스크를 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO2및 95% 상대 습도(RH)에 넣습니다.</li>
	<li>약 24시간 후, 해동 배지를 기저배지로 교체하여 각질제거제 동결용액으로부터 디메틸 설옥산화물(DMSO)을 제거한다.</li>
	<li>2일마다 기초 매체를 새로 고칩니다.</li>
	<li>4-6일 의 재배 후, 세포는 약 80% 컨실레가 되어야 하며 RhEs 의 재배를 위한 인서치에 파종할 준비가 되어 있어야 합니다. 참고: 각질 세포는 증식 용량62를보존하기 위해 최대 80%의 합류로 성장해야 합니다. 해동되는 셀의 수는 세포 통로 수, 해동 시 세포 생존가능성, 파종 효율 및 두 배로 되는 시간과 같은 여러 매개 변수를 고려해야 합니다.</li>
</ol>3. NHEK의 시드
참고: 이 프로토콜은 24웰 캐리어 플레이트 형식 내에서 사용하도록 설계되었습니다. 다른 플레이트 형식(예: 12웰 또는 6웰 형식)이 필요한 경우 종자 밀도 및 중간 부피의 최적화를 고려해야 합니다. 도 1은 RhE 재배에 대한 제안된 타임라인을 요약하고 재배 조건을 나타낸다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig1v4.jpg"> 그림 1: 재구성 프로토콜의 회로도 타임라인입니다. RhE 모델 제제, 재배 공정 및 응용(화학 물질에 대한 노출)의 프리젠테이션. 이 계획에는 각 단계에 대한 적절한 세포 배양 미디어 유형이 포함됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig1v4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol><li>디스펜서 파이펫을 사용하여 1.5mL의 침수 된 매체로 24 웰 플레이트를 미리 채웁니다.</li>
	<li>NHEK의 배양에 사용되는 T75 플라스크에서 기저 배지를 제거합니다.</li>
	<li>각 T75 플라스크에 미리 따뜻워진 PBS5mL을 추가하여 세포를 헹구세요.</li>
	<li>플라스크에서 PBS를 제거합니다. 참고: 이 단계는 배지에 트립신 활동을 억제하는 단백질과 칼슘을 함유하고 있기 때문에 매우 중요합니다.</li>
	<li>각 T75 플라스크에 사전 따뜻하게 0.05% [v/v] 트립신/에틸렌 디아민 테트라 아세트산(EDTA)을 2-3mL를 추가합니다. 트립신 용액이 플라스크의 세포 배양 영역에 동등하게 분포되어 있는지 확인하십시오. 주의: 2mL 부피는 위에서 언급한 80%의 합류를 기반으로 합니다. 더 높은 응력으로 플라스크에 3 mL을 사용합니다.</li>
	<li>플라스크를 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO2및 95% RH)에 4분간 배치합니다. 세포가 10배율에서 현미경을 사용하여 분리되는지 확인합니다. 플라스크 표면에서 세포가 방출되는 것을 돕기 위해 손바닥에 플라스크를 랩합니다. 분리된 세포는 트립신 용액에 떠 있는 둥근 세포로 관찰될 수 있다. 주의: 트립신에서 세포를 6분 이상 배양하지 마십시오. 과다 트립시화는 세포를 손상시키고 그들의준수63을감소시킬 수 있습니다.</li>
	<li>모든 세포가 분리되면 각 T75 플라스크에 미리 따뜻해지는 트립신 억제제의 동일한 부피(즉, 2-3mL)를 추가합니다.</li>
	<li>플라스크에서 원심분리기 튜브로 셀 서스펜션을 전달합니다.</li>
	<li>미리 데워진 PBS의 5mL로 플라스크를 헹구고 세포 현탁액을 포함하는 원심분리기 튜브로 옮김합니다. 참고: 대부분의 세포가 현미경의 밑에 플라스크에 있는 잔류 세포의 수를 확인해서 집합되는지 확인하십시오. 플라스크의 표면은 95% 비어 있어야 합니다. 그렇지 않은 경우 트립시니화 단계(3.3-3.9)를 반복할 수 있다. 그러나 재트립시화는 피해야 합니다.</li>
	<li>수확된 세포를 400 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>조심스럽게 튜브에 약 100-200 μL을 떠나, 상체의 대부분을 폐기. 주의: 이 절차 중에 펠릿을 흡인시키지마십시오. </li>
	<li>균일한 셀 현탁액을 보장하기 위해 침수 된 매체의 낮은 부피, 파이펫 위아래로 5-10 번 셀의 펠릿을 부드럽게 재중단합니다. 낮은 부피(즉, 500 μL)로 시작하여 셀 응집체의 형성을 피하고 초기 T75 플라스크당 총 1mL의 침수 된 배지를 추가하십시오. 참고 : 조심스럽게 상체에 세포 펠릿의 일부를 용해손가락으로 튜브를 가볍게.</li>
	<li>트라이판 블루 제외 방법을 사용하여 서스펜션의 셀을 계산합니다.<ol>
<li>0.4% [v/v] 트라이판 블루 얼룩과 셀 현탁액을 1:1 비율로 희석하고, 10 μL의 0.4% [v/v] 트라이판 블루 얼룩을 세포 현탁액의 10μL에 첨가하였다. 카운팅 슬라이드에 솔루션의 10 μL을 추가합니다. 트라이팬 블루와 셀 서스펜션을 혼합한 직후 셀 수를 측정한 후, 트라이팬 블루는 1분65보다더 오래 노출된 후 세포 생존가능성을 감소시키기 시작한다. 주의: 트라이판 블루는 잠재적인 돌연변이원, 발암물질 및테라토겐(64)으로나타났다. 현지 실험실 규정에 따라 염료를 조심스럽게 처리하고 폐기물을 안전하게 폐기하십시오. 참고 : 트라이판 블루의 사용에 대한 다른 접근 방식은 비 유해 염료 에리스로신 B66입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>추가 침수 배지로 셀 서스펜션을 희석시켜 방정식 1에 도시된 바와 같이 부피 V2를 추가하여 침수 된 매체에서3.525 x 10 5 셀/mL의 농도에 도달합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61802/61802eq01.jpg"> C1 = 3.12 (세포/mL)에서 얻은 세포 현탁액에서 셀 농도 계산 3.12 (mL)에서 세포의 펠릿을 재일시 중단하는 데 사용되는 V 1 = 부피 C2 = 현탁액의 표적 세포 농도(즉, 3.525 x 105 세포/mL) 표적 세포 농도(mL)에 도달하기 위해 첨가되는 V2 = 부피 참고: 권장 배양 인서의 표면적은 0.47cm2; 따라서, 해당 파종 밀도는 3.75 x 105 셀/cm2이다.</li>
	<li>3.14 단계에서 얻어진 희석용액의 제2 세포 수(C3)를수행한다. 방정식 2를 사용하여 배양 삽입체에 시드되는 셀 서스펜션 볼륨(V4)을계산합니다. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61802/61902eq02.jpg"> C3 = 현탁액의 표적 세포 농도(즉, 3.525 x 105 세포/mL) V3 = 배양 삽입체에서 시드되는 셀 서스펜션의 표적 부피(즉, 0.5mL) C4 = 3.14(세포/mL)에서 얻어진 희석현탁액에서 셀 농도 계산 V4 = 배양 삽입(mL)에서 시드되는 셀 현탁액의 실제 부피</li>
	<li>24개의 세포 배양물 인서트를 권장 캐리어 플레이트의 가장 높은 위치에 적어 담그고 담수 배지로 미리 채워진 24웰 플레이트로 캐리어 플레이트를 옮겼다(cf. 3.1). 주의: 캐리어 플레이트를 다중 웰 플레이트로 옮길 때, 기저구에서 삽입 막과 침수 된 매체 사이에 기포가 갇히지 않도록하는 것은 세포의 공급에 영향을 미치고 궁극적으로 RhE 생존력과 형태학을 손상시킵니다.</li>
	<li>각 삽입에 셀 서스펜션의 결정된 볼륨 V4(방정식 2에서)를 추가합니다. 참고: 역피 팅 기술을 사용하여 세포 현탁액을 배양 삽입에 정확하게 분배하는 것이 좋습니다. 주의: 세포 현탁액을 배양 삽입에 분배할 때 멤브레인을 손상시키지 않도록 하십시오. 예방 조치는 멤브레인의 표면을 만지지 않고 인서트 시스템의 벽을 따라 세포 현탁액을 분배하는 것입니다.</li>
	<li>시드 후, 실온에서 10-15분 동안 24웰 플레이트를 배양하여 에지 효과(즉, 모든 우물67사이의 균일하지 않은 온도 분포)를 극복한다. 이 시간 동안 플레이트를 이동하지 마십시오.</li>
	<li>플레이트를 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO2및 95% RH)로 이송한다. 세포는 3일 동안 침수된 조건에서 유지됩니다. 참고: 조직 가변성을 방지하려면 시드 후 인큐베이터에 플레이트를 적층하지 말고 각 인서트가 동일한 양의 열을 받는지 확인하십시오. 3일 후(즉, ALI 재배 중) 플레이트의 스태킹이 가능합니다.</li>
</ol>4. 공기-액체 인터페이스에서 재배
<ol><li>세포 배양인큐베이터(37°C, 5%CO2및 95% RH)에서 3일간의 인큐베이션 후, 포부 시스템과 유리 파스퇴피를 이용하여 에피컬 구획으로부터 침수된 배지를 제거함으로써 막 표면에 부착된 세포를 ALI에 노출시키는 것이 바람직하다. 참고: 또는, 정량 구획에서 잠긴 매체는 수동 마이크로피펫으로 제거할 수 있다.</li>
	<li>새로운 24웰 플레이트를 1.5mL의 신선한 미리 데운 ALI 배지로 채우고 배양 물자와 캐리어 플레이트를 새로운 멀티 웰 플레이트로 옮길 수 있습니다.</li>
	<li>다중 웰 플레이트를 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO2및 95% RH)로 다시 전송합니다.</li>
	<li>14일 동안 2-3일마다 ALI 배지를 새로 고칩니다.</li>
	<li>두 단계로 새로 고침을 수행: 1) 신선한 사전 따뜻하게 된 ALI 매체의 1.5 mL / 웰을 포함하는 새로운 플레이트를 준비하고 2) 캐리어 플레이트를 새로운 플레이트로 전송한다. 주의: 전체 재구성 절차 동안 잠재적인 오염으로부터 RhEs를 보호하기 위해 캐리어 플레이트를 덮는 뚜껑을 제거하지 않는 것이 가장 좋습니다. 참고: ALI 단계는 각질세포(68)의말단 분화를 허용하기 때문에 계층화된 표피 모델의 개발에 매우 중요합니다. ALI에 간 후, 삽입물의 시각적 제어가 필요합니다, '새는 조직'이 있는지 여부를 확인하기 위해: 혈관 측구에서 오는 조직 표면에 중간 물방울. ALI 3일째에 누설이 발생하면 조직의 표면을 건드리지 않고 배양 삽입물에서 배지를 부드럽게 제거합니다. 누출이 지속되는 경우, RhE 모델에 올바른 장벽 형성이 없다는 표시이기 때문에 누출 된 조직을 폐기하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>재구성 과정의 끝에서, 조직은 예를 들어 산화 스트레스 또는 염증을 유도하기 위해 다양한 스트레스에 노출 될 수있다. 병렬로, 그들은 화학 화합물 또는 화장품 재료로 처리 될 수 있습니다. 참고: 노출/치료 중 조직은 일반적으로 ALI D14부터 시작하여 침수된 배지에서 유지됩니다. 조직이 장기간(즉, 48-72시간) 노출/처리될 것으로 예상되는 경우(i) D7-D9와 같은 ALI 재배 과정에서 초기에 노출/치료를 시작하여 SC의 절단 및 SC의 농축을 방지하고, (ii) 중증조직을 유지하여 조직을 유지하여 조직을 유지하도록 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>RhE 수확을 위해 조직 분석, 생존 가능성 분석, 단백질/RNA 추출 및 효소 연계 면역소벤트 분석(ELISA)에 대한 관심 시점에서 조직 및 세포 배양 배지를 수집합니다.</li>
</ol>

마크 이만과 베네데타 페트라카는 다우 실리콘 벨기에의 직원입니다. 다른 모든 저자는 공개 할 것이 없습니다.

RhEs는 제약 및 피부막 화장품분야(36,75,76,77, 77)및78에서스크리닝 도구로 널리 사용된다. 여러 회사가 이러한 RH를 시판적으로 사용할 수 있도록 했지만, 비용이 많이 들고 새로운 연구 문제를 해결하는 데 필요한 재배 매개 변수를 변경할 가능성을 제한합니다. 이 논문은 사내 RhEs의 생산 절차를 강력하고 신뢰할 수 있는 방식으로 설명하고 동물 실험에 대한 대체 접근법으로서 모델의 관련성을 확인하기 위해 획득한 조직의 상세한 특성을 제공합니다.
프로토콜의 일부 단계는 적절한 각질 세포 분화 및 RhE 재현성을 보장하는 데 중요합니다. 이는 최적의 세포, 중간 형( 들) 및 재배 조건을 활용하여 수행될 수 있다. 제안된 RhE 모형에서, 신생아 NHEKs는 성숙한 NHEKs에 비교된 항원성 노출의 그들의 부족을 위해 선택되었습니다. 더욱이, 각질 세포는 종 간 가변성을 피하기 위하여 백인 민족으로 제한되었습니다. 기본 각질 세포는 일반적으로 차별화하고 계층화하는 능력에 사용됩니다.79. 상업적으로 또는 성인 피부로부터 사내 격리를 통해 얻을 수 있습니다.80. 폴리카보네이트 멤브레인에 세포주(즉, HaCaT)의 재배는 분화를 실패하고 장벽 형성에 필요한 지질을 합성하는 장애인 능력을 입증했습니다.81. 그러나 하이드로겔, 콜라겐, 피브린 및 스페로이드 배양과 같은 다양한 배양 행렬이 포함되면서 3D 피부 모델이 성공적으로 발달했습니다.78,82,83,84,85,86. 불멸의 세포주, N/TERT는 RhEs의 발달에 적합한 것으로 나타났습니다.35. 기본 각질 세포는 그들의 네 번째 또는 다섯 번째 통로에 증식 남아61따라서 현재 프로토콜에는 제 3 통로에서 각질 세포의 사용이 포함됩니다. De Vuyst 외. 세포 종자 밀도가 중요하고 충분해야 한다는 것을 입증했습니다 (즉, ≥ 2.5x105 셀/cm2)바소포탈 구획에서 배지가 어포형 구획으로 확산되지 않도록 한다. 불충분한 시드 밀도(예: < 2.5x105 셀/cm2)은 바소포탈에서 어포메이션 구획으로 배지의 확산으로 표시되는 적절한 장벽을 형성할 수 없게 되어 ALI 배양 조건 대신 침수될 수 있습니다.62. 세럼이 없는 각질 세포 성장 매체(참조) 재료 테이블)는 화학적으로 정의된 매체로 작업하는 이점을 제공하고 오염 위험을 감소시키기 때문에 재현성 목적으로 선호되었다. 이 매체는 칼슘 농도(즉, 60 μM)를 가지므로 각질 세포의 증식을 자극합니다.87. RhE 재배의 첫 번째 단계에서 칼슘 농도(즉, 1.5 mM)를 증가시키고 각질 세포 분화 및 피부 장벽 형성 및 항상성을 선호합니다.49. 또한, ALI 배지는 SC 지질의 형성과 차별화를 촉진하는 데 중요한 것으로 나타난 아스코르빅 산으로 보충됩니다.52,53,54. ALI 배지는 또한 KGF를 포함, 이는 각질 세포 간 막 수용체에 결합 할 수있는 섬유 아세포에 의해 분비 성장 인자이며 활성화시 분화 및 상처 수리에 이중 역할을55,88. 특정 시간 간격으로 ALI 배지를 새로 고치고 RhEs에 신선한 영양소를 지속적으로 공급하는 것이 중요합니다. 캐리어 플레이트 시스템의 사용은 더 큰 규모(즉, 24인서식/플레이트)에서 RhE 재배에 매우 중요합니다. 그것은 시간을 절약, 오염의 위험을 감소의 장점을 제공하고, 인간의 오류의 도입을위한 적은 공간을 떠난다. 또한 많은 양의 미디어(즉, 1.5mL)에서 RH를 배양하여 필요한 ALI 중간 리프레시 수를 줄일 수 있는 가능성을 제공합니다. 또한, 삽입의 전체 플레이트를 신선한 매체로 플레이트에 전달하여 개별적으로 인서트와의 접촉을 피하거나 플레이트 뚜껑을 발견할 수 있습니다.
주목해야 하는 RhE 모델에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 네이티브 인간의 피부에는 기저 층에서 각질 세포의 증식과 SC의 코르네오사이클 분리 (즉, 탈화) 사이의 평형이 있습니다.89. 그러나, 시험관 내에서, 담수는 일어나지 않습니다. 따라서, 코르네오사이클은 RhE에 부착된 채로 남아 있으며 생리학적으로 관련성이 떨어지는 두꺼운 SC를 형성한다. 따라서, RhEs의 제한된 재배 기간이있다. 더욱이, 이 RhE 모델은 단수 세포 유형, 즉 표피의 가장 풍부한 세포 유형인 각질 세포세포로 구성되어 있기 때문에 간단하고 간단하다. 그러나 멜라닌세포, 수지상 세포(즉, 랑게란스 세포), T 세포(예를 들어, CD8)와 같은 표피에 상주하는 다른 세포 유형이 있습니다.+ 셀), 및 메르켈 세포13. 피부 모델의 생리적 관련성을 향상시키기 위해 연구자들은 멜라닌세포를 추가하여 피부 모델을 더욱 복잡하게 만들었습니다.38 , 면역 세포39또는 환자 유래 세포90. 특히 다른 SC 지질 조성및 더 높은 장벽 투과성으로 인해 인간의 피부 모델의 장벽 특성이 토착 인간의 피부에 비해 다르다는 것을 명심해야 합니다. 91,92,93,94,95. 그러나, 몇몇 연구 결과는 저산소증의 밑에 재배에 의하여 인간 피부 모형의 장벽 속성에 있는 변경을 보고했습니다96 상대 습도 감소97, 키토산과 진피 매트릭스의 변조98배양 배지에서 자유지방산의 변화99. 더욱이, 간단하고 복잡한 RH에서, 배양 조건 및 중간 조성은 병리학적 특징을 모방하도록 변조될 수 있다. 사이토카인으로 모델에 도전함으로써 비정상적인 형태100 및 유전자 및 단백질 발현 수준에 있는 변경은 아토피성 피부염 및 건선과 같은 일반적인 피부 무질서에서 전형적으로 관찰되는 설치될 수 있습니다35,101,102,103,104,105. 3D 모델의 재구성 과정을 시작하기 전에 각질 세포에 특정 유전자를 침묵시키는 것은 피부 질환의 특징을 모방하고 새로운 치료 솔루션을 조사하는 데 사용되는 또 다른 접근 방식입니다.106,107. 표피 층을 모델링하는 것 외에도, 진피 구획은 RhE 재구성 전에 콜라겐 매트릭스에 섬유아아를 포함시킴으로써 모델(즉, 인간 피부 등가물 또는 풀 두께 모델)에 포함될 수 있어 생리학적으로 관련성이 높으며 노화 및 상처 치유 관련 연구에 적합합니다.108,109,110. 추가적으로, 종양 스페로이드는 흑색종 진행을 공부하기 위하여 인간 적인 피부 등가에 추가되었습니다111,112. 피부 모델 분야의 최신 발전은 바이오 프린팅과 스킨 온 어 칩입니다. 여러 연구 그룹은 최근 (과두구) 바이오 인쇄 피부 등가물의 개발에 성공했다45,113,114. 제안된 프로토콜은 24웰 형식과 캐리어 플레이트를 활용하여 개별적으로 처리되는 인서트를 방지합니다. 그러나, 연구 규모는 여전히 매우 제한 하 고 자동화 부족. 바이오 프린팅 또는 스킨 온-어칩의 사용을 구현함으로써 더 작은 피부 모델을 보다 자동화된 공정과 더 큰 규모로 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜에 설명된 RhE는 이미 개발된 것과 잘 특징인 상용 표피 모델과 여러 가지 유사점이 있습니다. 형태학적 분석은 제안된 RhE 모델에서 실행 가능한 층의 수가 토착 인간 피부(즉, 7-14에 비해 6-7)에 비해 낮지만, EpiDerm RhE 모델(즉, 8-12)의 것과 비교할 수 있음을 입증하였다. EpiDerm, EpiSkin 및 SkinEthic 모델과 마찬가지로, 상부 RhE 층은 조밀하게 포장된 코르네오사이클층(28)의바구니 직조 패턴을 나타낸다. 더욱이, TEM 분석은 제안된 RhE 모델(즉, 15-25)에서 SC 층의 수가 EpiDerm(즉, 16-25)70의것과 비교된다는 것을 밝혔다. 전반적으로 제안된 RhE 모델은 네이티브 인간 표피를 모방한 다른 상용화된 표피 모델과 유사한 구조를 보여줍니다. TEER에 의해 측정된 조직 무결성은 상용 RhE 모델(즉, 3000-5600 Ω.cm2)71,72,73 및 기타 사내 RhEs(즉, 약 5000 Ω.cm2)74,115와범위에 있다. 제안된 RhE 모델은 분화 및 조직 접착 마커의 존재 및 올바른 국소화에 의해 표시된 바와 같이 잘 분화되는 것을 보여준다. 더욱이, 제안된 RhE 모델은 선동적인 자극(즉, LPS 및 TNF-α)에 반응할 것을 보여줍니다.
결론을 내리기 위해, 현재 의정서는 학술 및 민간 기관 모두에서 연구원의 요구를 충족시키기 위해 신뢰할 수있는 방식으로 상대적으로 큰 규모로 RhEs를 생산하는 방법을 보여줍니다. 제안된 RhE 모델은 다른 기존 상용 모델에 유사한 형태, 표피 분화 및 생물학적 반응성을 갖는 것을 보여줍니다. 관련 피부 모델에 대한 접근이 필요할 때 제약 및 피부 막장 전모두에 대한 대체 도구를 제공합니다.

표피는 인체와 외부 환경 사이의 직접적인 인터페이스에서 피부의 가장 바깥쪽 층입니다. 주요 기능은 보호 및 수분1을제공하는 것입니다. 표피는 외부 에이전트에 대한 효과적인 물리적 장벽 역할을하고 몸에서 과도한 물 손실을 방지할 수 있습니다. 이러한 피부 기능은 주로 피부의 가장 바깥층의 세포 배열에 의존하며, 세포간 지질2의조성물 및 조직에 의존한다. 표피는 주로 조직의 바깥쪽으로 위로 이동하고 분화를 겪는 각질 세포로 구성됩니다. 분화의 그들의 단계를 특징으로 하는 4-5 표피 층이 있습니다. 내부에서 외부까지, 표피 층은 실행 가능한 표피, 즉, 층 배세 (SB), 지층 스모넘 (SS), 및 지층 과립 (SG), 비 실행 가능한 상부 층, 즉, 지층 각막 (SC)3에서시작한다. 기저층은 주로 각질이 풍부한 각질 세포로 구성되며, 이는 분화4시에SS를 통해 마이그레이션된다. 각질 세포 성숙 동안, 단백질 발현 및 구조의 다양한 변화가 발생합니다. 각질 세포는 탈모소말접합부 5의형성을 통해 부착한다. SG에서는 라멜라 바디의 생성이 시작됩니다. 그(것)들은 피부 장벽 기능 6의 대형에 중요한 지질 전구체 및 효소로 이루어져 있습니다6. SG는 또한 각질 세포의 세포질에 각질 화과립의 존재를 특징으로한다. SC와의 인터페이스에서, 라멜라 바디의 함량은 세포간 공간과 세라마이드, 콜레스테롤 및 자유 지방산과 같은 비극성 지질으로 압출되어 세포외 지질 매트릭스7을형성하기 위해 적층 된 라멜라 지질 양층으로 구성된다. SC에서 세포는 효소 저하 과정으로 인해 핵을 포함한 모든 세포 세포기관을 잃고 평평한 형태를 채택합니다. 그들은 교차 연결된 단백질 층으로 만든 옥수수 봉투에 둘러싸여 있으며, 코르네오사이클8,9라고합니다. Desmosomal 성분은 코르네오데스모좀을 형성하고 코네오사이클을 함께 묶기 위해 옥수수 봉투에 교차 연결됩니다. 결과 상피는 줄기 세포에서 지속적으로 갱신되며, 회전율은 약 5-6주10입니다. 완전히 계층화된 표피의 결과각질 세포의 분화 과정은피부(11)의장벽 기능 형성에 매우 중요합니다.
상처와 염증 동안, 각질 세포는 접착 분자및 표면 수용체의 변화를 유도하고 사이토카인, 케모킨 및 항균 펩타이드12의분비를 통해 염증 반응을 유발한다. 피부는 외인성 물질에 대한 물리적 장벽뿐만 아니라; 그것은 또한 병원 체에 노출 시 면역 센서 역할을. 또한, 탈수로부터 인체를 보호하기 위해 수분 함량과 같은 여러 물질의 확산을 조절합니다. 피부는 또한 비타민 D의 합성에 관여하고 다양한다른 대사 기능을 갖는다3,13,14.
외인 성 물질의 부작용을 평가하기 위해 독성 학자는 동물 실험에 수십 년 동안 의존해 왔지만 요즘은 바람직한 접근 방식이 아닙니다. 인간의 독성에 대한 제한된 예측 능력을 갖는 것 외에도 동물 모델은 수많은 윤리적 문제를 수반합니다. 화장품 산업에서 동물 실험 금지 및 연구에서 3R 원칙 (즉, 교체, 감소 및 정제)을 따르도록 권고하면 체외 접근법15에기초한 대체 시험 방법의 개발로 이어졌습니다. 첫 번째 체외 피부 세포 모델은 이미 90 년대에 설명되었으며, 간단한 인간 각질 세포 모노 배양에서 완전히 차별화 된 표피 및 풀 두께 모델에 이르기까지 인상적인 개발이16을 달성했습니다. 요즘, 피부 조직 공학은 제약 및 피부 막장 분야에서 모두 중요성을 얻고있다. 지난 2년 동안 여러 회사에서 피부 관련 연구를 위한 표준화되고 재현 가능한 도구를 나타내는 3차원(3D) 재구성된 인간 표피(RhE)를 상용화했습니다. 여러 상용 RhE 모델은 피부 자극17,18 (즉, 테스트 지침 43919)및 피부 부식20 (즉, 테스트 가이드 라인 43121)의시험을 위한 OECD 지침에 따라 화학 물질의 체외 피부 테스트를 허용합니다. 피부감작(22)에 대한 체외 시험(예: SENS-IS 분석)은 현재 승인 트랙에 있으며 피어리뷰(23)에있다. 또한 상용 RhE 모델을 활용하여 광독성(24)을 평가하고,약물제형(25,화장품 제형 및 활성성분(26)을시험하고, 피부 장벽기능(27)을 연구하고 환경 스트레스에 대한 생물학적 반응을 시험하기 위해 개발된 수많은 다른 연구가있다.
시판되는 3D 스킨 모델 외에도 여러 연구 그룹은 자체 RHEs32,33,34,35,36,37을 개발했다. 사내 RhEs는 연구의 목적에 따라 문화 조건을 제어하는 이점을 제공합니다. 구체적으로, 연구원은 3D 표피 모델의 재구성에 사용되는 각질 세포의 유형과 소스를 선택할 수 있습니다 (즉, 기본 대 불멸, 신생아 대 숙성, 단일 대 풀랜덤 기증자, 성별, 민족, 흡연과 같은 개별 생활 습관 등). 그(것)들은 배양 매체의 조성을 변화시키고 표적 단백질 또는 지질의 발현을 조절할 수 있는 성장 인자, 비타민, 또는 그밖 화합물을 통합할 가능성이 있습니다. 사내 RhEs를 통해 연구자들은 3D 모델의 분화 상태의 기능으로 생물학적 반응및 생체 역학적 특성을 조사할 수 있습니다. 이러한 직관적인 매개 변수 외에도 3D 피부 모델의 복잡성을 증가시키고 생리적으로 더 관련성을 높이기 위한 지속적인 노력이 있으며, 예를 들어 다른 표피 세포 유형(예: 멜라닌세포 및 면역 세포)을첨가하여 38,39,섬유아세포 가포성 콜라겐 매트릭스40,41,42,및 혈관망의구성요소를 포함하였습니다.
특정 요구에 따라 문화 조건을 조정할 수 있지만 RhE의 품질과 관련성을 보장하기 위해 존중해야 하는 매개 변수가 있습니다. RhE 조직을 육성하기 위해 정상적인 인간 표피 각질 세포(NHEKs)는 다공성 합성 멤브레인이 우물을 두 개의 구획, 즉 정약 및 바식탈 구획으로 분리하는 특정 투과성 배양 인서트로 시드됩니다. 멤브레인의 다공성(즉, 0.4 μm의 공공 크기)은 세포가 기저 삽입 측으로 이동하지 않고 압정 구획에서 세포 단층의 형성을 허용하고, 배꼽 구획에 포함된 배양 배지로부터 필수 영양소를 가진 각질 세포의 공급이 허용된다. 재구성 과정의 시작 부분에서 NHEK는 멤브레인에 접착을 허용하기 위해 며칠 동안 침수 된 조건에서 배양됩니다. 두 구획의 칼슘 수준은 세포의 증식을 늦추고 대신분화(46)를촉진하기 위해 NHEKs의 2D 배양에 사용되는 칼슘 농도에 비해 증가한다. 표피 칼슘 그라데이션은 장벽 형성 및 항상성을 조절하는 데필수적이다(47,48). 높은 칼슘 수준(즉, 최대 1.5mMM)은 세포간 접합의 형성을 촉진하고 말단분화(49)동안 옥수수화된 봉투의 형성을 조절한다. 각질세포가 지지막상에 연속적이고 단단히 부착된 단층층을 형성하면, 어포형 구획으로부터의 배지가 제거되고 배양 공정이 공기-액체 인터페이스(ALI)에서 계속되어 계층화를 촉진하고 표피장벽(50,51)을확립한다. 특정 문화 조건은 완전히 계층화 된 상피(36)를얻기 위해 매우 중요합니다. ALI에서 의 재구성 과정에서, 바소포탈 구획의 배지는 각질 세포 성장 인자(KGF), 인슐린, 칼슘 및 아스코르브산으로 보충됩니다. 아스코르브산은 적절한 SC 지질 장벽의 형성에 중요한 역할을 하며, 이는 토착 인간피부(52)와밀접한 관련이 있다. 아스코르브 산 보충 배지에서 자란 각질 세포는코로세포(52)의중식에서 조직된 세포간 지질 라멜라엘라뿐만 아니라 케라토히알린 과립의 향상된 수와 함께 차별화된 표현형을 입증한다. 이러한 보충제는 옥수수 봉투 함량을 증가시키고 친수성 항산화 저장소53,54의고갈을 피함으로써 표피 장벽 기능을 개선하는 데 필수적이다. 표피 증식 및 분화의 중요한 파라크리인 KGF는NHEKs(55)를자극하는 데 사용된다.
사내 RhEs의 주요 단점은 연구 기관 간의 표준화 손실과 노동 강도 및 시간 소비 증가(즉시 사용 되는 상용 모델에 비해 최대 3 주)를 포함합니다. 본 논문의 목적은 이러한 단점을 해결하고 생산의 기초를 더 큰 규모로 설정하는 것입니다. 상기 사내 RhEs의 장점 외에도, 현재 의정서는 조직 간의 내및 간 가변성을 줄이고, 오염 위험을 줄이고, 재배 과정을 간소화하는 것을 목표로 합니다.
현재 프로토콜은 신생아 NHEKs를 사용하여 RH를 육성하는 재현 가능하고 강력한 방법을 설명합니다. 더욱이, 표피 분화를 위해 특정한 단백질의 RhEs 형태, 장벽 무결성 및 발현의 특성화의 대표적인 결과를 나타낸다. RhEs 형태학적 구조는 헤마톡시린 및 에오신(H&E) 염색 및 투과 전자 현미경 검사(TEM)를 사용하여 검사하였다. 장벽 무결성을 평가하기 위해, 트리톤 X-100에 대한 경피 전기 저항(TEER) 및 노출 시간을 측정하여 조직 생존가능성(ET50)의 50%를감소시키는 것으로 측정하였다. 탈모실 접합(즉, desmoglein 1)의 형성은 각질 세포 부착을 평가하기 위해 면역 형광(IF)에 의해 분석되었다. 표피 구조 단백질(즉, 인볼루크린, 로리크린 및 필래그린)의 형성은 IF로 평가및 검출되었다. 이러한 단백질은 SC 코르네오사이클을 둘러싸고 고도로 연결된 단백질 봉투의 형성에 관여하며 그 결과 후기 표피분화(56,57)에대한 중요한 마커가 된다. 또한, IF는 각질(10)을 분석하기 위해 사용되었고, SS58에서 초기 단계 분화 세포에서 유도된 단백질은 모든 분화층 내부에서 발견되었다. 마지막으로, 염증 자극에 대한 RhE의 반응(즉, 리포폴다산화물 및 종양 괴사 인자 알파)을 조사하였다. 인터류신 1알파(IL-1α) 및 인터류인 8(IL-8)의 수준은 효소-연결된 면역흡제 분석(ELISA)을 이용하여 세포 배양 배지에서 측정하였다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Acetic acid</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >A6283</td>
			<td >Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibiotic-antimycotic (100x)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aqueous Eosin Y solution</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >HT110280</td>
			<td >Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td >Sigma Aldrich or Merck</td>
			<td>C8106 or 1.02378.0500</td>
			<td >Prepare a stock solution of 0.144 M, filter sterilize and store aliquots at -20 &#176;C.&#160; It is recommended to prepare new aliquots every 6 months.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>Prepare a stock at 100 &#956;g/mL and store aliquots at -20 &#176;C. Working conditon is 1 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Entellan mounting medium</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.07960.0500</td>
			<td>Mounting medium for H&#38;E staining.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EpiLife medium (referred to as keratinocyte growth medium)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>MEPI500CA</td>
			<td >Contains 0.06 mM of Ca2+.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol absolute</td>
			<td >Any supplier</td>
			<td >N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formalin 10%</td>
			<td >Leica Biosystems</td>
			<td >3800770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human keratinocytes growth supplement (HKGS) (100x)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>S0015</td>
			<td >To reach final concentrations of 0.2% [v/v] BPE, 0.2 ng/mL human recombinant EGF, 0.18 &#956;g/mL hydrocortisone,5 &#956;g/mL bovine transferrin, and 0.01 &#181;g/mL human recombinant insulin-like growth factor-I.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropanol</td>
			<td >Biosolve B.V.</td>
			<td >0016264102BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kaiser&#39;s glycerol gelatine, phenol-free</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.08635.0100</td>
			<td>Mounting medium for IF staining.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Keratinocyte growth factor (KGF)</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG-050</td>
			<td >Reconstitute KGF protein at 100 &#956;g/mL in sterile 0.1% [w/v] BSA in PBS. Prepare aliquots and store at -20&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lactate dehydrogenase (LDH) assay kit</td>
			<td >Roche</td>
			<td >4744926001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td >Prepare a stock solution of 25 mg/mL, filter sterilize and store aliquots at -20&#176;C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. Store in the dark.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lipopolysaccharide (LPS), E.coli strain O55:B5</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >L4524</td>
			<td >Prepare a stock of 1 mg/mL in sterile PBS and store aliquots at -20 &#176;C. Working concentration is 100 &#956;g/mL.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mayer&#8217;s Haematoxylin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >MHS80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs)</td>
			<td >Lonza</td>
			<td>00192906</td>
			<td >Human primary keratinocytes isolated from neonatal foreskin, pooled from at least three donors.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10010056 or 10010-015</td>
			<td >Reference numbers can vary between countries.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;)</td>
			<td >ImmunoTools</td>
			<td >11344483</td>
			<td>Prepare a stock of 100 &#956;g/mL in sterile ultrapure water. Working concentration is 40 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile ultrapure water</td>
			<td >Any supplier</td>
			<td >N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M5655</td>
			<td>Prepare a stock of 5 mg/mL MTT in sterile PBS. Working concentration is 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>93426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan blue (0.4% [v/v])</td>
			<td >Any supplier</td>
			<td >N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin inhibitor</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>R007100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA (0.05% [v/v])</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tween 20</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylene</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab150113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tri-sodium citrate dihydrate</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.06448.0500</td>
			<td>For antigen retrieval buffer for IF staining.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Dylight 488)</td>
			<td >Agrisera</td>
			<td>AS09 633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filaggrin Mouse antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP2-53243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Involucrin Rabbit antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP2-33742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Keratin 10 Mouse antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP2-32962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Desmoglein-1 Mouse antibody&#160;</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>MAB944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Loricrin Rabbit antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP1-33610</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivating a three-dimensional reconstructed human epidermis at a large scale

신생아 1차 각질 세포로부터 재구성된 3차원 인간 표피 모델이 제시된다. 본명, 모델의 재배 과정 및 특성화를 위한 프로토콜이 기재된다. 신생아 1차 각질세포는 투과성 폴리카보네이트 인서트에 침수되어 파종 후 3일 후에 공기-액체 인터페이스로 들어올수 있습니다. 높은 칼슘 배양 배지에서 정의된 성장 인자 및 아스코르브산을 가진 14일간의 자극 후, 이 모델은 완전히 분화된다. 조직학적 분석은 토착 인간의 피부의 형태를 모방한 완전히 계층화된 표피를 밝혀냈습니다. 모델및 장벽 기능, 단백질 수준 및 초기 단계 각질 분화(즉, 케라틴 10), 후기 분화(즉, 인볼루크린, 로리크린 및 필라그린) 및 조직 접착(즉, desmoglein)에 대한 특이적 특성화를 특징으로 하기 위해 면역제1을 평가하였다. 조직 장벽 무결성은 환피성 전기 저항을 측정하여 더욱 평가되었다. Re복합 인간 표피는 선동성 자극(즉, 리포폴다산차라이드 및 종양 괴사 인자 알파)에 반응하여 세포카인 방출(즉, 인터류킨 1 알파 및 인터류킨 8)을 증가시키는 것으로 나타났다. 이 프로토콜은 환경 효과와 광범위한 피부 관련 연구를 평가하는 도구로 재구성된 인간 표피를 육성하는 간단하고 재현 가능한 시험관 내 방법을 나타냅니다.

2D로 배양된 NHEKs는 일관된 다각형 형상을 가진 전통적인형태(도 2A)를표시한다. 위에서 설명한 바와 같이, NHEKs는 약 80%의 합류에 도달한 후 배양 삽입체로 시드된다. RhEs의 형태는 H&E 염색 및 TEM을 사용하여 분석되었습니다. ALI에서 15일 후에, 완전히 계층화된 조직은 SB, SS, SG 및 SC(도2B)의네 가지 주요 표피 층으로 표시된 바와 같이 얻어진다. SB 층에서 셀에는 컬럼 모양이 있습니다. RhE의 상부 층을 향해 두 번째 층에서, NHEKs는 세포 형태 (SB 층의 기둥 모양에서, SS 층에서 가시 모양으로)의 변화에 의해 관찰된 바와 구별한다. SG 층에서, 세포는 세포질에서 보라색 점으로 표현되는 더 평평한 모양과 표시 각질 (KG)을 갖는다. 그들의 특징적인 둥근 별 모양은 H&E이미지(그림 2C)의흰색 화살표로 강조표시됩니다. SC내의 세포는 말단분화되어 완전히 평평해지고 세포 핵이 부족합니다. 계층화된 RhEs의 전체 두께는 84.3 ± 2.4 μm이며 SC의 두께는 19.6 ± 3.2 μm(그림2D)입니다. 이러한 값은 토착 인간 피부, 즉 60-120 μm 및 10-20 μm, 각각69에대해 보고된 값과 비교됩니다. 실행 가능한 층의 수는 6-7이며, 이는 토착 인간의 피부에 비해 더 낮으며 약 7-1470입니다. 재구성 프로토콜(즉, 7, 10, 13 및 15일)의 상이한 시점에서 RH의 초구조적 분석은 시간이 지남에 따라 코네오사이클층의 수가 증가하는 RH의 옥수수 화 과정을나타낸다(도 2E). ALI에서 15일 후, RhE 조직의 SC는 약 15-25층으로 만들어지며, 이는 토착 인간 피부(즉, 15-20층)69에대해 보고된 값과 비교할 수 있다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig2v2.jpg"> 그림 2: 기본 각질 세포 및 재구성 된 인간 표피. (A)삽입에 시드하기 전에 1 차 각질 세포의 위상 대비 현미경 이미지. 스케일 바는 50 μm.(B-C)RhE의 H&E 밝은 필드 현미경 이미지입니다. 스케일 바는 50 μm(B)및 25 μm(C)입니다. (D)RhE 및 SC의 두께 의 정량화 (평균 ± SEM, n =3). (E)ALI에서 7일, 10일, 13일, 15일 후 RhE 단면의 전송 전자 현미경 이미지. 스케일 바는 4 μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
그들의 차별화 단계에 따르면, 3D에서 성장하는 NHEKs는 그들의 차별화 단계에 따라 다른 단백질 발현 프로파일을 보여줍니다. 초기 단계 각질 세포 분화 (즉, 케라틴 10), 후기 단계 각질 세포 분화 (즉, 인볼루크린, 로리크린 및 필래그린) 및 각질 세포 부착 (즉, desmoglein 1)을 사용하여 염색체 분화 (즉, 케라틴 10)에 특정 단백질의 발현을 결정하였다. 인볼루크린 발현은 분화과정(도 3D)동안 발식이 일찍 시작되기 때문에 SG 층에 더 많이 위치하는 반면, 필라그린과 로리크린은 상층(도3B-C)으로표현된다. 케라틴(10)은 SB 층을 제외한 모든 실행 가능한 층에서발견되었다(도 3E). RH는 실행 가능한 표피 층의 세포간 공간에서 desmoglein 1의 발현에 의해 표시된 기능성 desmosomal 접합부(도3F)를나타낸다. 결론적으로, 5개의 마커는 모두 표현되고 적당한 표피 층에 위치하고 건강한 표피 분화 과정으로 변환합니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig03.jpg"> 그림 3: 대장피 분화, 조직 접착 및 재구성된 인간 표피의 조직 무결성.(A)RhE의 H&E 밝은 필드 현미경 이미지. 공초점 형광 현미경 이미지는(B)필라그린 (FLG),(C)로리크린 (LOR),(D)인볼루크린 (INV),(E)케라틴 10 (K10), 및 (F) desmoglein 1 (DSG-1) 마젠타로 표현된다. 핵 염색(DAPI)은 파란색으로 표현된다. 스케일 바는 25 μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
RhE 모델의 장벽 특성은 조직의 생존력과 무결성을 모두 평가하여 조사되었습니다. 조직 무결성은 15일 후에 발토름계를 사용하여 TEER를 측정하여 결정하였다. 2567 ± 415 Ω.cm2 값은 연속 장벽의 형성을 변환(도 4A). 이러한 값은 RhE 모델71,72,73,74에대해 보고된 값과 범위에 있습니다. 또한, 세포독성 기준 화학물질(즉, 트리톤 X-100)에 필요한 노출 시간은 조직 생존가능성을 50%(ET50)로감소시킴으로써 티아졸리블루 테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석으로 결정하였다. RHE에 대해 측정된 ET50 값은 2.1시간이었습니다. 이 값은 자극 분류(OECD Guideline 439)19의신뢰할 수 있는 예측을 위한 자격을 갖춘 다른 3D 표피 모델의 수용 범위 내에 속한다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig4v3.jpg"> 그림 4: 재구성된 인간 표피의 장벽 특성. (A)경피성 전기 저항으로 측정된 조직 무결성(평균 ± SEM, n=6). (B)ET 50은 1% 트리톤 X-100(평균 ± SEM, n=3)의 78.3 μL에 국소 노출시 조직 생존가능성(즉, MTT 분석)을 측정하여 결정하였다.
RhEs의 반응성은 알려진 선동자극에 따라 조사되었다. RhEs는 100 μg/mL 대장균 리포폴리사카라이드(LPS) 및 40 ng/mL 종양 괴사 인자 알파(TNF-α)를 사용하여, 바소포탈 구획의 배지에 자극을 첨가하여 체계적으로 처리하였다. 24시간 자극 후, 세포 배양 배지가 수집되었다. 세포독성은 락테이트 탈수소효소(LDH) 분석기를 이용하여 측정하고 알려진 멤브레인 파괴기의 값에 비해 트리톤 X-100세제(도 5)를측정하였다. 상당한 증가 (p < 0.05, 단방향 ANOVA, 던넷의 다중 비교 테스트) 트리톤 X-100으로 처리 되는 RH에서 LDH 활동에 표시 되었다. LPS 및 TNF-α 처리는 둘 다 세포독성이 아닌 것으로 나타났습니다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig5v3.jpg"> 그림 5: 젖산 탈수소효소(LDH) 분석기를 통해 측정된 세포독성. 데이터는 제어할 상대값, 처리되지 않은 조직(CTRL)으로 표시됩니다. ± SEM, n=9(트리톤 X-100), n=8(LPS), n=3(TNF-α)을 의미합니다. 중요성은 던넷의 다중 비교 테스트인 단방향 ANOVA로 테스트되었습니다. 별표는 CTRL, ****p < 0.0001)에 비해 통계적으로 유의한 차이를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig5v3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
RhE 배지에서 인터류킨 1 알파(IL-1α) 및 인터류킨 8(IL-8)의 방출은 ELISA를 사용하여 정량화되었다. 도 6은 LPS 및 TNF-α 도전시 RH에 의한 정량화 및 상대적인 IL-1α 및 IL-8 방출을 모두 나타낸다. LPS 치료는 통계적으로 유의한 결과 (p < 0.05, 페어링되지 않은 학생의 T-테스트) IL-8의 유도 방출 (9.6 ± 1.0 배 증가) 및 IL-1α (2.7 ± 1.3 배 증가). TNF-α IL-8 수치가 증가하는 경향에도 불구하고 IL-8 방출을 크게 유도하지 는 않았다(2.3 ± 0.8배 증가). 그러나 TNF-α 크게(p < 0.05, 짝을 이루지 못한 학생의 T-테스트) 트리거 IL-1α 방출(1.8 ± 0.5배 증가).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig6v3.jpg"> 그림 6: 재구성된 인간 표피에서 의염증 반응. LPS(A)및 TNF-α(B)와 함께 24시간 도전에 따라 RHE에의한 IL-8 방출농도. 데이터는 SEM, n=8(LPS), n=3(TNF-α)± 평균으로 표시됩니다. (C)데이터는 대조군, 처리되지 않은 조직(CTRL) ± SEM, n=8(LPS), n=3(TNF-α)에 비해 상대적 값의 평균으로 표현된다. LPS(D)및 TNF-α(E)를 통해 24시간 도전시 RHE의 IL-1α 방출농도. 데이터는 SEM, n=8(LPS), n=3(TNF-α)± 평균으로 표시됩니다. (F)데이터는 CTRL ± SEM, n=4(LPS), n=3(TNF-α)에 비해 상대값의 평균으로 표현된다. 유의성은 짝을 이루지 못한 학생의 T-시험에 의해 시험되었습니다. 별표는 CTRL, *p < 0.05, ****p < 0.0001)에 비해 통계적으로 유의한 차이를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig6v3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

이 프로토콜은 재현 가능하고 견고한 방식으로 3차원 재구성된 인간 표피를 육성하는 간단한 방법을 설명합니다. 또한 표피 장벽 모델의 구조 기능 관계를 특성화합니다. 선동적인 자극에 재구성된 인간 표피의 생물학 반응은 또한 제시됩니다.

대규모로 3차원 재건 된 인간 표피 를 육성

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

체외 또는 생성된 인간 표피 모델은 동물 실험에 대한 대체 테스트 방법을 개발하는 주요 목표로 90년대에 처음 개발되었습니다. 이러한 3D 표피 모델은 이제 일반적으로 화장품 성분의 안전성과 효능을 테스트하는 데 사용됩니다. 여러 조직 공급 업체에서 구입할 수 있지만 실험실에서 3D 모델을 재구성 할 수 있다는 것은 관심의 끝점에 더 많은 유연성을 제공합니다.3D 표피 모델의 재구성 프로토콜을 간략하게 설명하는 여러 연구 논문이 있지만 현재까지 는 재구성 프로세스의 중요한 단계를 보여주는 비디오가 없었습니다. 이것이 이 비디오 용지를 출판한 이유입니다. 사내 재건된 인간 표피의 제조는 배양 배지 조성의 변화, 프로 염증 또는 산화 스트레스 트리거, 관심 유전자의 침묵, 특정 생물학적 과정의 억제 또는 자극과 같은 배양 과정에서 많은 자유를 허용합니다.우선, 유리병을 물에 잠급하여 섭씨 37도의 수조에서 100만 개의 극저온 보존 된 정상적인 인간 표피 각질 각질 세포 또는 NHEKs로 병병을 해동하십시오. 작은 얼음 조각만 보일 때까지 수조에서 1~2분 동안 바이알을 배양합니다. 2~3회 위아래로 파이프를 사용하여 셀을 매우 신중하게 재차 중단합니다.셀 서스펜션을 사전 경고된 해동 배지의 총 15밀리리터를 포함하는 2개의 T75 플라스크로 전송하여, 제4 세포에 6.7배 10의 파종 밀도를 생성한다. 디스펜서 파이펫을 사용하여 침수 된 매체의 1.5 밀리리터로 24 개의 웰 플레이트를 미리 채웁니다. 세포를 80%의 수렴성으로 배양한 후, 재구성된 인간 표피 또는 RHE의 재배를 위해 인서트에 파종할 준비가 되어 있습니다.NHEKs로 T75 플라스크에서 기저 매질을 제거합니다. 각 T75 플라스크에 미리 따뜻워진 PBS의 5밀리리터를 추가하여 세포를 헹구고 플라스크에서 PBS를 제거합니다. 각 플라스크에 사전 따뜻하게 된 0.05 %의 트립신-EDTA의 2 ~ 3 밀리리터를 추가하여 트립신 용액이 플라스크의 세포 배양 영역에 동등하게 분포되어 있는지 확인합니다.세포 배양 인큐베이터에 플라스크를 4분 동안 놓고, 세포가 현미경을 사용하여 10 X 배율로 분리되는지 확인합니다. 플라스크표면에서 세포가 방출되는 것을 돕기 위해 플라스크를 랩합니다. 모든 세포가 분리되면 각 T75 플라스크에 미리 따뜻해지는 트립신 억제제의 동일한 볼륨을 추가하고 플라스크에서 원심분리기 튜브로 세포 현탁액을 전달합니다.미리 따뜻워진 PBS의 5밀리리터로 플라스크를 헹구고 세포 현탁액을 포함하는 원심분리기 튜브로 옮김합니다. 수확된 세포를 5분 동안 400배 G로 원심분리합니다. 조심스럽게 튜브에 약 100 ~ 200 마이크로 리터를 떠나 상체의 대부분을 폐기.조심스럽게 펠릿을 느슨하게 손가락으로 튜브를 가볍게 쓸어. 침수 된 매체의 낮은 부피로 세포의 펠릿을 부드럽게 다시 중단하고 균일 한 셀 서스펜션을 보장하기 위해 5 ~ 10 번 위아래로 피펫을 합니다. 셀 응집체의 형성을 피하기 위해 낮은 부피로 시작하고 초기 T75 플라스크당 최대 1밀리리터의 침수 된 배지를 추가하십시오.트라이판 블루 제외 방법을 사용하여 서스펜션의 셀을 계산합니다. 텍스트 원고에 제공된 첫 번째 방정식을 사용하여 밀리리터당 5번째 세포에 3.525배의 농도에 도달하기 위해 추가 침수 배지로 세포 현탁액을 희석한다. 희석된 용액의 제2 셀 카운트를 수행하고 텍스트 원고의 두 번째 방정식을 사용하여 배양 삽입체로 시드되는 셀 서스펜션 볼륨을 계산합니다.24개의 웰 배양인기를 캐리어 플레이트의 가장 높은 위치에 걸고, 담수매로 미리 채워진 24개의 웰 플레이트로 캐리어 플레이트를 옮기한다. 각 삽입에 셀 서스펜션의 결정된 볼륨을 추가하여 삽입을 만지지 않도록 주의하십시오. 시드 후, 에지 효과를 극복하기 위해 실온에서 10~ 15분 동안 24개의 웰 플레이트를 배양합니다.이 시간 동안 플레이트를 이동하지 마십시오. 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 옮기고 3일 동안 침수된 상태로 둡니다. 세포 배양 인큐베이터에서 3일간의 인큐베이션 후, 흡인계또는 ALI에 멤브레인 표면에 부착된 세포를 흡혈구로부터 포부 시스템과 유리 파스퇴르 파이펫으로 제거하여 노출한다.새로운 24개의 웰 플레이트를 1.5밀리리터의 신선한 미리 데운 ALI 배지로 채우고, 배양 물자를 새로운 멀티웰 플레이트로 옮길 수 있습니다. 다중 웰 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 다시 이송합니다. ALI 배지를 2~3일마다 14일 동안 새로 고칩니다.2D 배양식각막세포는 일관된 다각형 모양을 가진 전통적인 형태를 표시합니다. ALI에서 15 일 후, 재건 된 인간 표피는 완전히 계층화 된 조직을 형성하며, 이는 네 가지 주요 표피 층으로 표시됩니다. 재구성 프로토콜의 다른 시점에서 재구성된 인간 표피의 초구조적 분석은 시간이 지남에 따라 각막 부위 층의 수가 증가함에 따라 옥수수 화 과정을 나타낸다.표피의 각질 세포는 그들의 분화 단계에 따라 다른 단백질 발현 프로파일을 보여줍니다. Involucrin 발현은 SG 계층에서 더 주로 나타나는 반면 필라그린과 로리크린의 발현은 상층층에 있습니다. 케라틴-10 식은 SB 층을 제외한 모든 실행 가능한 계층에서 발견되었다.재구성된 인간 표피는 실행 가능한 표피 층의 세포간 공간에서 Desmoglein-1의 발현에 의해 표시된 기능성 탈모소말 접합을 표시합니다. 재건된 표피 모델의 장벽 특성은 알려진 장벽 파괴자와 국소 치료에 대한 조직 생존가능성을 평가하고 조직 무결성을 평가하여 조사되었습니다. 조직 무결성은 15일 후에 볼트계로 TEER을 측정하여 결정하였다.리포폴리사카라이드 및 종양 괴사 인자 알파에 대한 표피의 반응성을 조사되었다. LPS와 TNF 알파 치료 모두 무독성이었다. 트리톤 X-100 컨트롤에 상대적입니다.RHE 배지에서 인터류킨-1 알파 및 인터류킨-8의 방출은 IL 용액을 사용하여 정량화되었다. LPS 치료는 인터류빈-1 알파 및 인터류빈-8의 방출에서 통계적으로 유의한 업-레페터의 결과를 낳았다. TNF 알파 치료는 인터류신-1 알파의 방출에서통계적으로 유의한 업-레퍼티레이션을 초래했다.그러나, 인터류빈-8 레벨증가의 명확한 경향은 또한 TNF 알파를 가진 자극시 관찰되었다. 이 프로토콜에 따라 TEER는 장벽 무결성을 위한 값으로 측정할 수 있습니다. 생존성 또는 세포 독성은 예를 들어 MTT 또는 LDH 분석에 의해 측정될 수 있다.상체는 사이토카인 또는 다른 단백질의 분비를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 더욱이, 조직은 단백질 또는 관심있는 유전자의 발현을 연구하기 위하여 이용될 수 있다.

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