Name: cultivating a three-dimensional reconstructed human epidermis at a large scale
Uploaded: 2021-05-28T13:30:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale at JoVE.com

EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 under Marie Skłodowska-Curie Grant med tilskuddsavtalen 765602 nr. Alle forfattere anerkjenner støtten fra Adolphe Merkle Foundation og University of Ferrara og anerkjenner takknemlig Dow Silicones Belgia. Dr. Miguel Spuch-Calvar er anerkjent for å forberede de grafiske bildene av RhE dyrkingsprosessen. Forfatterne takker Dr. Barbara Drasler, Dr. Franco Cervellati og Dr. Agnès Tessier for deres tekniske støtte og diskusjoner.

Gjennomgå og følg nasjonale og internasjonale etiske hensyn og forhold knyttet til bruk av humant vev eller celler før du planlegger og utfører forskningsaktivitet som involverer denne protokollen. MERK: Alle trinnene i denne protokollen må utføres under aseptiske forhold. Biosikkerhet nivå 2 praksis er minimumskravet for dyrking av RhEs. Alle nødvendige sikkerhetsforanstaltninger må tas ved håndtering av kjemikaliene/reagensene som er beskrevet i denne protokollen.
1. Utarbeidelse av cellekulturmedier
MERK: Det finnes tre forskjellige typer serumfrie kulturmedier som brukes til dyrking av RhEs (tabell 1): (i) basalmediet med lavt kalsiumnivå (60 μM Ca2+) som brukes til 2D-kulturen til NHEKs; (ii) det nedsenkede mediet med høyt kalsiumnivå (1,5 mM Ca2+) som brukes til såing av NHEKer i cellekulturinnsatssystemet; og (iii) luftvæskegrensesnittet (ALI) medium med høyt kalsiumnivå (1,5 mM Ca2+), askorbinsyre og keratinocytt vekstfaktor (KGF).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Middels</td>
			<td>Middels informasjon</td>
			<td>Nødvendig antall</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Basal medium</td>
			<td>Keratinocytt vekstmedium</td>
			<td rowspan="3">36 ml/24 brønner</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] HKGS</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] 100x antibiotika-antimykotisk</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Nedsenket medium</td>
			<td>Keratinocytt vekstmedium</td>
			<td rowspan="4">36 ml/24 brønner</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] HKGS</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] 100x antibiotika-antimykotisk</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1,5 mM Ca2+
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">Luft-væske grensesnitt medium</td>
			<td>Keratinocytt vekstmedium</td>
			<td rowspan="6">216 ml/24 brønner</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] HKGS</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] 100x antibiotika-antimykotisk</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1,5 mM Ca2+
</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 50 μg/ml askorbinsyre</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 10 ng/ml keratinocytt vekstfaktor</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1. Sammendragstabell over de ulike kulturmediene som brukes til å dyrke RhEs. Liste over ulike kulturmedier med kosttilskudd.
<ol><li>Forbered basalmediet.<ol>
<li>Suppler flasken med 500 ml keratinocytt vekstmedium (Materialliste) med 5 ml humane keratinocyttveksttilskudd (HKGS) for å nå endelige konsentrasjoner på 0,2% [v / v] bovint grop ekstrakt (BPE), 0,2 ng/ml human rekombinant epidermal vekstfaktor (EGF), 0,18 μg/ml hydrokortison, 5 μg/ml bovint transferrin, og 0,01 μg/ml rekombinant humaninsulinlignende vekstfaktor-I (IGF-I).</li>
		<li>Tilsett 5 ml 100x antibiotisk-antimykotisk oppløsning som inneholder 10 000 enheter/ml penicillin, 10 000 μg/ml streptomycin og 25 μg/ml amfotericin B.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forbered det nedsenkede mediet.<ol>
<li>Suppler flasken med 500 ml keratinocyttvekstmedium (Materialliste) med 5 ml HKGS for å oppnå endelige konsentrasjoner på 0,2 % [v/v] BPE, 0,2 ng/ml human rekombinant EGF, 0,18 μg/ml hydrokortison, 5 μg/ml bovint transferrin og 0,01 μg/ml human rekombinant IGF-I.</li>
		<li>Tilsett 5 ml 100x antibiotika-antimykotisk løsning.</li>
		<li>Tilsett 5 ml av en 0,144 M CaCl2 (kalsiumklorid) lagerløsning for å nå en endelig konsentrasjon på 1,5 mM Ca2+. MERK: Kalsiumkonsentrasjonen er allerede økt i den nedsenkede fasen for å stimulere differensiering av keratinocyttene og starte stratifiseringsprosessen49.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forbered luftvæskegrensesnittet (ALI) medium.<ol>
<li>Suppler en flaske med 500 ml keratinocyttvekstmedium (Materialliste) med 5 ml HKGS for å oppnå endelige konsentrasjoner på 0,2 % [v/v] BPE, 0,2 ng/ml human rekombinant EGF, 0,18 μg/ml hydrokortison, 5 μg/ml bovint transferrin og 0,01 μg/ml human rekombinant IGF-I.</li>
		<li>Tilsett 5 ml 100x antibiotika-antimykotisk løsning.</li>
		<li>Tilsett 5 ml av en 0,144 M CaCl2 lagerløsning for å nå en endelig konsentrasjon på 1,5 mM Ca2+.</li>
		<li>Tilsett 1 ml av en 25 mg/ml askorbinsyrebestandsløsning for å oppnå en endelig konsentrasjon på 50 μg/ml askorbinsyre.</li>
		<li>Tilsett 50 μL av en KGF på 100 μg/ml i 1 % [m/v] bovint serumalbumin i fosfatbufret saltvannsoppløsning (PBS) for å oppnå en endelig konsentrasjon på 10 ng/ml KGF. MERK: Siden askorbinsyre er følsom for oksidasjon, anbefales det å bruke en stabil askorbinsyrederivat, for eksempel magnesium l-ascorbyl-2-fosfat59 eller L-askorbinsyre 2-fosfat sesquimagnesium60. Hvis askorbinsyre brukes, anbefales det å supplere ALI-mediet med askorbinsyre før hver oppdatering.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Nheks kultur
MERK: Siden primære menneskelige keratinocytter forblir proliferative på deres fjerde eller femte passasje61, NHEKs i deres tredje passasje brukes til dyrking av RhEs. Primære keratinocytter bør håndteres svært nøye på grunn av deres høye følsomhet. Forsiktig og langsom pipettering av cellesuspensjoner når som helst er svært viktig, for ikke å forstyrre tilstanden til cellene.
<ol><li>Tine et hetteglass med 1 x10 6 kryopreserverte NHEKer i et vannbad ved 37 °C, ved å senke deler av hetteglasset ned i vannet. Inkuber hetteglasset i 1-2 minutter i vannbadet, til bare en liten isbit er synlig. FORSIKTIG: Ikke senk hele hetteglasset ned i vannbadet for å unngå forurensninger. Ikke tin cellene lenger enn 2 minutter; Dette kan redusere cellens levedyktighet. Tørk av hetteglasset med en 70% etanoloppløsning før du overfører røret til laminær hetten.</li>
	<li>Resuspend cellene veldig nøye, ved pipettering opp og ned 2-3 ganger. Overfør celleopphenget i to T75-kolber som inneholder totalt 15 ml forvarmet tiningsmedium, noe som resulterer i en såddtetthet på 6,7 x 104 celler / cm2. MERK: For de to første passasjene og opptining av kryopreserverte NHEK-er brukes cellekulturmedie i henhold til leverandørens anbefalinger.</li>
	<li>Plasser kolbeene i cellekulturinkubatoren (37 °C, 5 % CO2og 95 % relativ fuktighet (RH)).</li>
	<li>Etter ca. 24 timer, erstatt opptiningsmediet med basalmediet for å fjerne dimetylsulfoksid (DMSO) fra keratinocyttfrysingsløsningen.</li>
	<li>Oppdater basalmediet annenhver dag.</li>
	<li>Etter 4-6 dager med dyrking, bør cellene være rundt 80% konfluensa og klare til såing i innsatser for dyrking av RhEs. MERK: Keratinocytter bør dyrkes til maksimalt 80% samløp for å bevare sin proliferative kapasitet62. Antall celler som skal tines må ta hensyn til flere parametere, for eksempel cellepassasjenummeret, cellens levedyktighet ved opptining, såingseffektivitet samt doblingstid.</li>
</ol>3. Såing av NHEK-er
MERK: Denne protokollen er konstruert for bruk i et 24-brønns bæreplateformat. Hvis andre plateformater kreves (f.eks. 12-brønns eller 6-brønns format), bør optimaliseringer i såddtetthet og middels volum vurderes. Figur 1 oppsummerer en foreslått tidslinje for RhE dyrking og viser dyrkingsforholdene.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig1v4.jpg"> Figur 1: Skjematisk tidslinje for rekonstitueringsprotokollen. Presentasjon av RhE-modellens forberedelse, dyrkingsprosess og anvendelse (eksponering for kjemisk substans). Oppsettet inneholder de riktige medietypene for cellekultur for hvert trinn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig1v4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<ol><li>Pre-fyll 24-brønns plater med 1,5 ml nedsenket medium, ideelt ved hjelp av en dispenserpipette.</li>
	<li>Fjern basalmediet fra T75-kolber som brukes til NHEKs kultur.</li>
	<li>Skyll cellene ved å tilsette 5 ml forvarmet PBS til hver T75-kolbe.</li>
	<li>Fjern PBS fra kolber. MERK: Dette trinnet er avgjørende, siden mediet inneholder proteiner og kalsium som vil hemme trypsinaktiviteten.</li>
	<li>Tilsett 2-3 ml forvarmet 0,05% [v/v] trypsin/etylendiamin tetra eddiksyre (EDTA) i hver T75-kolbe. Pass på at trypsinløsningen er like fordelt på cellekulturområdet i kolben. FORSIKTIG: 2 ml-volumet er basert på 80 % samløp som er nevnt ovenfor. Bruk 3 ml for kolber med høyere samløp.</li>
	<li>Plasser kolbeene i 4 minutter i cellekulturinkubatoren (37 °C, 5 % CO2og 95 % RELATIV). Kontroller om cellene løsner ved hjelp av mikroskopet ved en 10x forstørrelse. Rap kolben mot håndflaten for å hjelpe cellene med å frigjøre seg fra overflaten av kolben. Frittliggende celler kan observeres som avrundede celler som flyter i trypsinoppløsningen. FORSIKTIG: Ikke inkuber cellene i trypsin i mer enn 6 minutter. Over-trypsinisering kan skade cellene og redusereoverholdelsen 63.</li>
	<li>Når alle cellene er løsnet, legg til et likt volum (dvs. 2-3 ml) forvarmet trypsinhemmer til hver T75-kolbe.</li>
	<li>Overfør cellefjæringen fra kolber til et sentrifugerør.</li>
	<li>Skyll kolbeene med 5 ml forvarmet PBS og overfør den til sentrifugerøret som inneholder cellefjæringen. MERK: Pass på at de fleste cellene samles inn ved å kontrollere antall restceller i kolbe under mikroskopet. Overflaten på kolben skal være 95% tom. Hvis dette ikke er tilfelle, er det mulig å gjenta trypsiniseringstrinnet (3,3-3,9). Vær imidlertid oppmerksom på at re-trypsinization bør unngås.</li>
	<li>Sentrifuger de høstede cellene på 400 x g i 5 min.</li>
	<li>Kast forsiktig det meste av supernatanten, og la ca. 100-200 μL stå i røret. FORSIKTIG: Pelletsen må ikke aspireres under denne prosedyren. </li>
	<li>Resuspend forsiktig pellet av celler i et lavt volum nedsenket medium, pipette opp og ned 5-10 ganger for å sikre en jevn celle suspensjon. Start med lavt volum (dvs. 500 μL) for å unngå dannelse av cellemengder og tilsett opptil 1 ml nedsenket medium totalt per første T75 kolbe. MERK: Sveip forsiktig røret med fingrene for å forsiktig oppløse en del av cellepelleten i supernatanten.</li>
	<li>Tell cellene i suspensjonen ved hjelp av trypan blå ekskluderingsmetode.<ol>
<li>Fortynn 0,4% [v/ v] trypan blå flekk og celleopphenget i et 1: 1-forhold, ved å legge til 10 μL 0,4% [v / v] trypan blå flekk til 10 μL celleoppheng. Tilsett 10 μL av løsningen i et tellesklie. Mål celleantallet umiddelbart etter blanding av celleopphenget med trypanblå, siden trypanblå begynner å redusere celle levedyktigheten etter eksponering lenger enn 1 min65. FORSIKTIG: Trypanblå ble vist å være en potensiell mutagen, kreftfremkallende og teratogen64. Håndter fargestoffet med forsiktighet og kast avfallet trygt i henhold til lokale laboratorieforskrifter. MERK: En alternativ tilnærming til bruk av trypan blå er det ikke-farlige fargestoffet Erythrosin B66.</li>
	</ol></li>
	<li>Fortynn celleopphenget med ekstra nedsenket medium for å nå en konsentrasjon på 3,525 x 105 celler / ml i nedsenket medium ved å legge til volum V2 som vist i ligning 1: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61802/61802eq01.jpg"> C1 = telt cellekonsentrasjon i cellesuspensjonen oppnådd i 3,12 (celler/ml) V1 = volum som brukes til å resuspendere pellets av celler i 3,12 (ml) C2 = målrettet cellekonsentrasjon i suspensjonen (dvs. 3,525 x 105 celler/ml) V2 = volum som skal tilsetts for å nå den målrettede cellekonsentrasjonen (ml) MERK: Overflatearealet til den anbefalte kulturinnsatsen er 0,47 cm2; Derfor er den tilsvarende såddtettheten 3,75 x 105 celler / cm2.</li>
	<li>Utfør et nytt celleantall (C3) av den fortynnede løsningen oppnådd i trinn 3.14. Bruk formel 2 til å beregne celleopphengsvolumet (V4) som skal sås inn i kulturinnlegget: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61802/61902eq02.jpg"> C3 = målrettet cellekonsentrasjon i suspensjonen (dvs. 3,525 x 105 celler/ml) V3 = målrettet volum av cellefjæringen som skal sås i kulturinnsatsen (dvs. 0,5 ml) C4 = telt cellekonsentrasjon i den fortynnede suspensjonen oppnådd i 3,14 (celler/ml) V4 = faktisk volum av cellefjæringen som skal sås i kulturinnsatsen (ml)</li>
	<li>Heng de 24 cellekulturinnleggene i den høyeste posisjonen til den anbefalte bæreplaten og overfør bæreplaten til 24-brønnsplaten ferdigfylt med nedsenket medium (jf. 3.1). FORSIKTIG: Når du overfører bæreplaten til multibrønnplaten, må du påse at ingen luftbobler er fanget mellom innsatsmembranen og det nedsenkede mediet fra basalrommet, da dette vil påvirke fôringen av cellene og til slutt kompromittere RhE-levedyktigheten og morfologien.</li>
	<li>Legg til det bestemte volumet V4 (fra ligning 2) av celleopphenget i hver innsats. MERK: Det anbefales å bruke omvendt pipetteringsteknikk for å dispensere cellefjæringen nøyaktig til kulturinnleggene. FORSIKTIG: Pass på at du ikke skader membranen når du deler ut cellefjæringen i kulturinnlegget. En forholdsregel er å dispensere cellefjæringen langs veggen av innsatssystemet uten å berøre overflaten av membranen.</li>
	<li>Etter sådd inkuberer du 24-brønnsplatene i 10-15 min ved romtemperatur, for å overvinne en kanteffekt (dvs. ikke-jevn temperaturfordeling mellom alle brønner67). Ikke flytt platene i løpet av denne tiden.</li>
	<li>Overfør platene til cellekulturinkubatoren (37 °C, 5 % CO2og 95 % RELATIV). Cellene opprettholdes under nedsenkede forhold i tre dager. MERK: For å unngå vevsvariabilitet må platene ikke stables i inkubatoren etter sådd for å sikre at hver innsats får samme mengde varme. Etter tre dager (dvs. under ALI dyrking) er stabling av plater mulig.</li>
</ol>4. Dyrking ved luft-væske grensesnitt
<ol><li>Etter en tre-dagers inkubasjon i cellekulturinkubatoren (37 °C, 5 % CO2og 95 % RELATIV), eksponer cellene som har festet seg til membranoverflaten til ALI ved å fjerne det nedsenkede mediet fra det apikale rommet, helst ved hjelp av et aspirasjonssystem og en pasteurpipette i glass. MERK: Alternativt kan det nedsenkede mediet fra det apikale rommet fjernes med en manuell mikropipette.</li>
	<li>Fyll nye 24-brønnsplater med 1,5 ml ferskt forvarmet ALI-medium og overfør bæreplatene med kulturinnleggene til de nye multibrønnplatene.</li>
	<li>Overfør multibrønnplatene tilbake til cellekulturinkubatoren (37 °C, 5 % CO2og 95 % RELATIV).</li>
	<li>Oppdater ALI-mediet hver 2-3 dager i 14 dager.</li>
	<li>Utfør oppdateringen i to trinn: 1) lag en ny plate som inneholder 1,5 ml/brønn med ferskt forhåndsvarmet ALI-medium og 2) overfør bæreplaten til den nye platen. FORSIKTIG: Under hele rekonstitueringsprosedyren er det best å ikke fjerne lokket som dekker bæreplaten for å beskytte RH-ene mot potensiell forurensning. MERK: ALI-trinnet er avgjørende for utviklingen av en stratifisert epidermal modell, da det tillater terminal differensiering av keratinocyttene68. Etter å ha gått til ALI, er det nødvendig med en visuell kontroll av innsatsene, for å sjekke om det er "lekke vev": mellomstore dråper på vevsoverflaten som kommer fra basolateralrommet. Hvis lekkasjen skjer på ALI dag 3, fjern forsiktig mediet fra kulturinnsatsen uten å berøre overflaten av vevet. Hvis lekkasjen vedvarer, anbefales det å kaste lekkende vev, da det er en indikasjon på at det ikke er riktig barrieredannelse i RhE-modellen.</li>
	<li>På slutten av rekonstitueringsprosessen kan vevet bli utsatt for ulike stressfaktorer for å indusere for eksempel oksidativt stress eller betennelse. Parallelt kan de behandles med kjemiske forbindelser eller kosmetiske ingredienser. MERK: Under eksponeringen/behandlingen opprettholdes vev vanligvis i nedsenket medium fra ALI D14. Når vev forventes å bli eksponert /behandlet i lang tid (dvs. 48-72 timer), anbefales det (i) å starte eksponering / behandling tidligere i ALI dyrkingsprosessen, for eksempel D7-D9, for å unngå tynning av levedyktige lag og fortykning av SC, og (ii) å inkubere vevet i ALI-medium, for å holde stimulerende celleproliferasjon.</li>
	<li>For RhE-høsting samler du vev og cellekulturmedium på interessepunktet for histologisk analyse, levedyktighetsanalyser, protein/RNA-ekstraksjon og enzymbundne immunosorbente analyser (ELISAer).</li>
</ol>

Marc Eeman og Benedetta Petracca er ansatte i Dow Silicones Belgia. Alle andre forfattere har ingenting å avsløre.

RhEs er mye brukt som screening verktøy i farmasøytiske og dermato-kosmetiske felt36,75,76,77,78. Selv om flere selskaper har gjort slike RH-er kommersielt tilgjengelige, forblir de kostbare og begrenser muligheten til å variere dyrkingsparametere etter behov for å ta opp nye forskningsspørsmål. Dette dokumentet beskriver produksjonsprosedyren til interne RH-er på en robust og pålitelig måte og gir en detaljert karakterisering av det oppnådde vevet for å bekrefte relevansen av modellen som en alternativ tilnærming til dyreforsøk.
Noen av trinnene i protokollen er avgjørende for å sikre riktig keratinocyttdifferensiering og RhE-reproduserbarhet. Dette kan utføres ved å bruke optimale celler, middels type(er) og dyrkingsforhold. I den foreslåtte RhE-modellen ble neonatal NHEKs valgt ut for mangel på antigen eksponering, sammenlignet med voksne NHEK-er. Videre var keratinocytter begrenset til kaukasisk etnisitet for å unngå variasjon mellom arter. Primære keratinocytter brukes vanligvis for deres evne til å differensiere og stratifisere79. De kan fås kommersielt eller ved intern isolasjon fra voksen hud80. Dyrking av en cellelinje (dvs. HaCaT) på en polykarbonatmembran, har vist seg å mislykkes differensiering og vist svekket kapasitet til å syntetisere lipider som er nødvendige for barrieredannelse.81. Imidlertid resulterte inkluderingen av forskjellige kulturmatriser, som hydrogeler, kollagen, fibrin og sfæroider kulturer, i vellykket utvikling av 3D-hudmodeller.78,82,83,84,85,86. De udødelige cellelinjene, N/TERT, har vist seg å være egnet for utvikling av RhEs35. Primære keratinocytter forblir proliferative på deres fjerde eller femte passasje61, derfor inkluderer den nåværende protokollen bruk av keratinocytter i sin tredje passasje. De Vuyst et al. har vist at cellefrøtettheten er av betydning og må være tilstrekkelig (dvs. ≥ 2,5x105 celler/cm2) for å sikre at mediet fra basolateralrommet ikke sprer seg til det apikale rommet. Utilstrekkelig såddtetthet (dvs. < 2.5x105 celler/cm2) kan resultere i manglende evne til å danne en riktig barriere, som indikeres av diffusjon av medium fra basolateral til det apikale rommet, noe som resulterer i nedsenket i stedet for ALI kulturforhold62. Serumfritt keratinocyttvekstmedium (se Tabell over materialer) ble foretrukket for reproduserbarhetsformål, siden det gir fordelen av å jobbe med et kjemisk definert medium og reduserer risikoen for forurensning. Dette mediet har en lavere kalsiumkonsentrasjon (dvs. 60 μM) og stimulerer derfor spredningen av keratinocytter87. Øke kalsiumkonsentrasjonen (dvs. 1,5 mM) fra det første trinnet i RhE-dyrkingen, favoriserer keratinocyttdifferensiering og hudbarrieredannelse og homeostase49. I tillegg er ALI-mediet supplert med askorbinsyre, som har vist seg å være avgjørende for dannelsen av SC-lipider og for å fremme differensiering.52,53,54. ALI-mediet inneholder også KGF, som er en vekstfaktor utskilt av fibroblaster som kan binde seg til keratinocytttransmembrane reseptorer og ved aktivering har en dobbel rolle i differensiering og sårreparasjon55,88. Det er viktig å oppdatere ALI-mediet ved bestemte tidsintervaller, for å gi en konstant tilførsel av friske næringsstoffer til RH-ene. Bruk av bæreplatesystem er avgjørende for RhE dyrking i større skala (dvs. 24 innsatser/plate). Det gir fordelen av å spare tid, redusere risikoen for forurensning, og gir mindre rom for innføring av menneskelige feil. Det gir også muligheten til å dyrke RhEs i et høyt volum av medier (dvs. 1,5 ml), noe som reduserer det nødvendige antallet ALI-middels oppdateringer. I tillegg gir det muligheten til å overføre en full plate med innsatser til en plate med friskt medium, unngå kontakt med innsatsene individuelt eller avdekke platelokket.
Det er flere begrensninger i RhE-modellen som bør noteres. I innfødt menneskelig hud er det en likevekt mellom spredning av keratinocytter i basallaget og løsrivelse av corneocytter i SC (dvs. desquamation)89. In vitro, desquamation finner imidlertid ikke sted. Derfor forblir hornhinnen festet til RhE og danner en tykk SC som er mindre fysiologisk relevant. Derfor er det en begrenset dyrkingstid av RhEs. Videre er denne RhE-modellen enkel og grei, siden den består av en entall celletype, det vil si keratinocytten, som er den mest tallrike celletypen av epidermis. Imidlertid er det andre celletyper bosatt i epidermis, for eksempel melanocytter, dendrittiske celler (dvs. Langerhans-celler), T-celler (f.eks.+ celler) og Merkel-celler13. For å forbedre hudmodellens fysiologiske relevans har forskere gjort hudmodeller mer komplekse ved å legge til melanocytter.38 , immunceller39eller pasientavledede celler90. Man bør huske på at barriereegenskapene til menneskelige hudmodeller er forskjellige sammenlignet med innfødt menneskelig hud, på grunn av spesielt en annen SC lipidsammensetning og en høyere barrieregjennomtrengelighet. 91,92,93,94,95. Imidlertid har flere studier rapportert endringer i barriereegenskaper til menneskelige hudmodeller ved dyrking under hypoksi.96 eller redusert relativ fuktighet97, modulering av dermal matrise med chitosan98, og endring i frie fettsyrer i kulturmediet99. Videre, i både enkle og mer komplekse RhEs, kan kulturforholdene og middels sammensetning moduleres for å etterligne patologiske egenskaper. Ved å utfordre modellen med cytokiner, en unormal morfologi100 og endringer i gen- og proteinuttrykksnivåer kan fastslås som vanligvis observeres ved vanlige hudsykdommer, som atopisk dermatitt og psoriasis35,101,102,103,104,105. Silencing spesifikke gener i keratinocytter før du starter rekonstitueringsprosessen av 3D-modellen er en annen tilnærming som brukes til å etterligne egenskaper av hudsykdommer og undersøke nye terapeutiske løsninger106,107. I tillegg til å modellere et epidermalt lag, kan et dermalt rom inkluderes i modellen (dvs. navngitte menneskelige hudekvivalenter eller modeller med full tykkelse) ved å legge inn fibroblaster i en kollagenmatrise før RhE-rekonstituering, noe som gjør den mer fysiologisk relevant og egnet for aldring og sårhelingsrelaterte studier.108,109,110. I tillegg har tumorsfæroider blitt tilsatt til tilsvarende menneskers hud for å studere melanomprogresjon111,112. De siste fremskrittene innen hudmodeller er biotrykk og hud-på-en-chip. Flere forskningsgrupper har nylig lyktes i utviklingen av (parfymerbare) biotrykte hudekvivalenter45,113,114. Den foreslåtte protokollen drar nytte av et 24-brønns format og en bæreplate, og unngår innsatser som skal håndteres individuelt. Studieskalaen er imidlertid fortsatt ganske begrenset og mangler automatisering. Ved å implementere bruk av biotrykk eller hud-på-en-chip, kan mindre hudmodeller brukes med mer automatiserte prosesser og i større skala.
RhE beskrevet i denne protokollen har flere likheter med de allerede utviklede og godt karakteriserte kommersielle epidermale modellene. Den morfologiske analysen har vist at selv om antall levedyktige lag i den foreslåtte RhE-modellen er lavere sammenlignet med for innfødt menneskelig hud (dvs. 6-7 sammenlignet med 7-14), er det sammenlignbart med EpiDerm RhE-modellen (dvs. 8-12)70. På samme måte som EpiDerm-, EpiSkin- og SkinEthic-modellene, viser det øvre RhE-laget et kurvvevd mønster av tettpakkede corneocyte lag28. Videre viste TEM-analyse at antall SC-lag i den foreslåtte RhE-modellen (dvs. 15-25) kan sammenlignes med EpiDerm (dvs. 16-25)70. Samlet sett viser den foreslåtte RhE-modellen en lignende struktur som for andre kommersialiserte epidermale modeller, som etterligner den innfødte menneskelige epidermis. Vevsintegriteten målt ved TEER er i området med kommersielle RhE-modeller (dvs. mellom 3000-5600 Ω,cm2)71,72,73 og andre interne RhEs (dvs. ca. 5000 Ω,cm2)74,115. Den foreslåtte RhE-modellen viser seg å være godt differensiert, som indikert ved tilstedeværelse og riktig lokalisering av differensierings- og vevsadhesjonsmarkører. Videre viser den foreslåtte RhE-modellen å være lydhør overfor proinflammatoriske stimuli (dvs. LPS og TNF-α).
For å konkludere viser dagens protokoll hvordan man produserer RH-er på en pålitelig måte og i relativt stor skala for å møte forskernes behov i både akademiske og private institusjoner. Den foreslåtte RhE-modellen viser at den har lignende morfologi, epidermal differensiering og biologisk respons på andre eksisterende kommersielle modeller. Det gir et alternativt verktøy for både farmasøytisk og dermato-kosmetisk felt når tilgang til en relevant hudmodell er nødvendig.

Epidermis er det ytterste laget av huden, i direkte grensesnitt mellom menneskekroppen og det ytre miljø. Hovedfunksjonene er å gi beskyttelse og hydrering1. Epidermis fungerer som en effektiv fysisk barriere mot eksterne midler og forhindrer overdreven vanntap fra kroppen. Disse hudfunksjonene avhenger hovedsakelig av det cellulære arrangementet i de ytterste lagene av huden, sammensetningen og organiseringen av intercellulære lipider2. Epidermis består hovedsakelig av keratinocytter som migrerer oppover til ytre siden av vevet og gjennomgår differensiering. Det er 4-5 epidermale lag som er preget av deres differensieringsstadium. Fra innsiden til utsiden starter de epidermale lagene fra levedyktig epidermis, det vil si stratum basale (SB), stratum spinosum (SS) og stratum granulosum (SG), til det ikke-levedyktige øverste laget, det vil si stratum corneum (SC)3. Basallaget består hovedsakelig av prolifererende keratinberikede keratinocytter, som migrerer gjennom SS ved differensiering4. Under keratinocyttmodning oppstår ulike endringer i proteinuttrykk og struktur. Keratinocytter holder seg gjennom dannelsen av desmosomale veikryss5. I SG initieres genereringen av lamelllegemer. De består av lipidforløpere og enzymer som er avgjørende for dannelsen av hudbarrierefunksjonen6. SG er også preget av tilstedeværelsen av keratohyalingranuler i cytoplasma av keratinocyttene. Ved grensesnittet med SC ekstruderes innholdet i lamellarlegemene inn i de intercellulære områdene og de ikke-polare lipidene som ceramides, kolesterol og frie fettsyrer organiseres i stablede lamellar lipidbilayers for å danne den ekstracellulære lipidmatrisen7. I SC mister celler alle cellulære organeller, inkludert kjernen, på grunn av enzymatisk nedbrytningsprosesser og vedtar en flatt morfologi. De er omgitt av en cornified konvolutt laget av krysskoblede proteinlag, og kalles corneocytes8,9. Desmosomale komponenter er kryssbundet til den cornified konvolutten for å danne corneodesmosomes og binde corneocytes sammen. Det resulterende epitelet fornyes kontinuerlig fra stamceller, med en omsetningstid på ca. 5-6 uker10. Differensieringsprosessen til keratinocyttene, som resulterer i en fullt stratifisert epidermis, er avgjørende for dannelsen av barrierefunksjonen til huden11.
Under sår og betennelse induserer keratinocytter endringer i adhesjonsmolekyler og overflatereseptorer og utløser proinflammatoriske responser via sekresjon av cytokiner, kjemokiner og antimikrobielle peptider12. Huden er ikke bare en fysisk barriere mot eksogene stoffer; Det fungerer også som en immunsensor ved eksponering for patogener. I tillegg regulerer det diffusjonen av flere stoffer på tvers av lagene, for eksempel vanninnhold for å beskytte menneskekroppen mot dehydrering. Huden er også involvert i syntesen av vitamin D og har forskjellige andre metabolske funksjoner3,13,14.
For å vurdere bivirkningene av eksogene stoffer har toksikologer i flere tiår stolt på dyreforsøk, men i dag er det ikke den foretrukne tilnærmingen. Foruten å ha begrenset prediktiv kapasitet for menneskelig toksisitet, involverer dyremodeller mange etiske problemer. Forbudet mot dyreforsøk i kosmetikkindustrien og anbefalingen om å følge 3R-prinsippet (dvs. erstatning, reduksjon og raffinement) i forskning har ført til utvikling av alternative testmetoder basert på in vitro tilnærminger15. De første in vitro hudcellemodellene er allerede beskrevet på 90-tallet, og en imponerende utvikling fra enkle menneskelige keratinocyttmonokulturer til fullt differensierte epidermis- og fulltykkelsesmodeller er oppnådd16. I dag har hudvevsteknikk fått betydning i både farmasøytiske og dermato-kosmetiske felt. I løpet av de siste to tiårene har flere selskaper kommersialisert tredimensjonale (3D) rekonstruerte humane epidermis (RhE) som representerer standardiserte og reproduserbare verktøy for hudrelaterte studier. Flere kommersielle RhE-modeller aksepteres for in vitro hudtesting av kjemikalier i henhold til OECDs retningslinjer for testing av hudirritasjon17,18 (dvs. testretningslinje 43919) og hudkorrosjon20 (dvs. testretningslinje 43121). In vitro-testen for hudsensibilisering22 (dvs. SENS-IS-analyse) er for tiden i godkjenningssporet og under fagfellevurdering23. Det er også mange andre analyser utviklet som bruker kommersielle RhE-modeller, for å evaluere fototoksisitet24, for å teste legemiddelformuleringer25, kosmetiske formuleringer og aktive ingredienser26, for å studere hudbarrierefunksjonen27 og for å teste den biologiske responsen på miljøstressorer28,29,30,31.
I tillegg til kommersielt tilgjengelige 3D-hudmodeller har flere forskningsgrupper utviklet sine egne RhEs32,33,34,35,36,37. Interne RH-er gir fordelen for å kontrollere kulturforholdene i henhold til formålet med studien. Spesielt kan forskere velge typen og kilden til keratinocyttene som skal brukes til rekonstituering av deres 3D-epidermale modell (dvs. primær vs. udødeliggjort, neonatal vs. alderen, enkelt vs. samlet tilfeldige givere, kjønn, etnisitet, individuelle levevaner som røyking, etc.). De har muligheten til å variere sammensetningen av kulturmediet og innlemme vekstfaktorer, vitaminer eller andre forbindelser som kan modulere uttrykket av målproteiner eller lipider. Med interne RhEs kan forskere også undersøke biologiske responser og biomekaniske egenskaper som en funksjon av differensieringstilstanden til 3D-modellen. I tillegg til de intuitive parametrene, er det kontinuerlig innsats for å øke kompleksiteten til 3D-hudmodeller og gjøre dem mer fysiologisk relevante, for eksempel ved å legge til andre epidermale celletyper (f.eks. melanocytter og immunceller)38,39, ved å dyrke keratinocyttene oppå en fibroblastfylt kollagenmatrise40,41,42og ved å inkludere komponenter i det vaskulære nettverket43,44,45.
Selv om det er mulig å justere kulturforholdene etter spesifikke behov, er det parametere som må respekteres for å garantere både kvaliteten og relevansen til en RhE. For å dyrke RhE-vev, blir normale humane epidermale keratinocytter (NHEKs) sådd inn i spesifikke gjennomtrengelige kulturinnlegg hvis porøse syntetiske membran skiller brønnene i to rom, det vil si det apikale og basolaterale rommet. Porøsiteten til membranen (dvs. en porestørrelse på 0,4 μm) er slik at den tillater dannelsen av et cellemonolayer i det apikale rommet uten migrasjon av celler til basal innsatssiden, og fôring av keratinocytter med essensielle næringsstoffer fra kulturmediet som finnes i basolateralrommet. I begynnelsen av rekonstitueringsprosessen dyrkes NHEK-er under nedsenkede forhold i noen dager for å tillate vedheft på membranen. Kalsiumnivået i begge rom økes sammenlignet med kalsiumkonsentrasjonen som brukes til 2D-kulturen til NHEK-er for å bremse spredningen av celler og fremme i stedet differensiering46. En epidermal kalsiumgradient er viktig for å regulere barriereformasjonen og homeostase47,48. Høye kalsiumnivåer (dvs. opptil 1,5 mM) fremmer dannelsen av intercellulære veikryss og modulerer dannelsen av den cornified konvolutten under terminal differensiering49. Når keratinocytter danner en kontinuerlig og tett tilhenger monolayer på støttemembranen, fjernes mediet fra det apikale rommet og kulturprosessen fortsetter ved luftvæskegrensesnittet (ALI) for å stimulere stratifisering og etablere en epidermal barriere50,51. Spesifikke kulturforhold er avgjørende for å oppnå et fullt stratifisert epitel36. Under rekonstitueringsprosessen ved ALI suppleres mediet i basolateralrommet med keratinocyttvekstfaktor (KGF), insulin, kalsium og askorbinsyre. Askorbinsyre spiller en viktig rolle i dannelsen av en passende SC lipidbarriere, som ligner på den innfødte menneskelige huden52. Keratinocytter dyrket i askorbinsyre-supplert medium demonstrerer en differenotype, med et forbedret antall keratohyalingranulater, samt organisert intercellulær lipidlamell i interstices av corneocytes52. Slike tilskudd er avgjørende for å forbedre epidermal barrierefunksjon ved å øke cornified konvoluttinnhold og unngå uttømming av hydrofile antioksidantlagre53,54. KGF, en viktig paracrine mediator av epidermal spredning og differensiering, brukes til å stimulere NHEKs55.
De viktigste ulempene med interne RH-er inkluderer tap av standardisering mellom forskningsinstitusjoner og økt arbeidsintensitet og tidsforbruk (opptil 3 uker sammenlignet med de bruksklare kommersielle modellene). Målet med dagens papir er å adressere disse ulempene, og sette grunnlaget for produksjonen i større skala. I tillegg til de ovennevnte fordelene med interne RH-er, tar den nåværende protokollen sikte på å redusere intra- og intervariabiliteten blant vev, for å redusere forurensningsrisiko og for å effektivisere dyrkingsprosessen.
Den nåværende protokollen beskriver en reproduserbar og robust metode for å dyrke RhEs ved hjelp av neonatal NHEKs. Videre viser det representative resultater av karakteriseringen av RhEs morfologi, barriereintegritet og uttrykk for proteiner som er spesifikke for epidermal differensiering. RhEs morfologiske struktur ble undersøkt ved hjelp av hematoksylin og eosin (H&E) farging og overføringselektronmikroskopi (TEM). For å evaluere barriereintegriteten ble den transepidermale elektriske motstanden (TEER) og eksponeringstiden til Triton X-100 for å redusere 50% av vevs levedyktigheten (ET50) målt. Dannelsen av desmosomale veikryss (dvs. desmoglein 1) ble analysert av immunfluorescens (IF) for å evaluere keratinocyttadhesjon. Dannelsen av epidermale strukturelle proteiner (dvs. involucrin, loricrin og filaggrin) ble evaluert og påvist med IF. Disse proteinene er involvert i dannelsen av den svært krysskoblede proteinkonvolutten som omgir SC corneocytter og som et resultat er viktige markører for senfase epidermal differensiering56,57. I tillegg ble IF brukt til å analysere keratin 10, et protein indusert i tidlige differensierte celler i SS58 og funnet inne i alle differensierte lag. Til slutt ble RhEs respons på proinflammatoriske stimuli (dvs. lipopolysakkarid og tumornekrosefaktor alfa) undersøkt. Nivåene av interleukin 1 alfa (IL-1α) og interleukin 8 (IL-8) ble målt i cellekulturmediet ved hjelp av enzymbundne immunosorbente analyser (ELISA).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Acetic acid</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >A6283</td>
			<td >Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibiotic-antimycotic (100x)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aqueous Eosin Y solution</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >HT110280</td>
			<td >Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td >Sigma Aldrich or Merck</td>
			<td>C8106 or 1.02378.0500</td>
			<td >Prepare a stock solution of 0.144 M, filter sterilize and store aliquots at -20 &#176;C.&#160; It is recommended to prepare new aliquots every 6 months.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>Prepare a stock at 100 &#956;g/mL and store aliquots at -20 &#176;C. Working conditon is 1 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Entellan mounting medium</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.07960.0500</td>
			<td>Mounting medium for H&#38;E staining.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EpiLife medium (referred to as keratinocyte growth medium)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>MEPI500CA</td>
			<td >Contains 0.06 mM of Ca2+.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol absolute</td>
			<td >Any supplier</td>
			<td >N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formalin 10%</td>
			<td >Leica Biosystems</td>
			<td >3800770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human keratinocytes growth supplement (HKGS) (100x)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>S0015</td>
			<td >To reach final concentrations of 0.2% [v/v] BPE, 0.2 ng/mL human recombinant EGF, 0.18 &#956;g/mL hydrocortisone,5 &#956;g/mL bovine transferrin, and 0.01 &#181;g/mL human recombinant insulin-like growth factor-I.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropanol</td>
			<td >Biosolve B.V.</td>
			<td >0016264102BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kaiser&#39;s glycerol gelatine, phenol-free</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.08635.0100</td>
			<td>Mounting medium for IF staining.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Keratinocyte growth factor (KGF)</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG-050</td>
			<td >Reconstitute KGF protein at 100 &#956;g/mL in sterile 0.1% [w/v] BSA in PBS. Prepare aliquots and store at -20&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lactate dehydrogenase (LDH) assay kit</td>
			<td >Roche</td>
			<td >4744926001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td >Prepare a stock solution of 25 mg/mL, filter sterilize and store aliquots at -20&#176;C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. Store in the dark.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lipopolysaccharide (LPS), E.coli strain O55:B5</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >L4524</td>
			<td >Prepare a stock of 1 mg/mL in sterile PBS and store aliquots at -20 &#176;C. Working concentration is 100 &#956;g/mL.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mayer&#8217;s Haematoxylin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >MHS80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs)</td>
			<td >Lonza</td>
			<td>00192906</td>
			<td >Human primary keratinocytes isolated from neonatal foreskin, pooled from at least three donors.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10010056 or 10010-015</td>
			<td >Reference numbers can vary between countries.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;)</td>
			<td >ImmunoTools</td>
			<td >11344483</td>
			<td>Prepare a stock of 100 &#956;g/mL in sterile ultrapure water. Working concentration is 40 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile ultrapure water</td>
			<td >Any supplier</td>
			<td >N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M5655</td>
			<td>Prepare a stock of 5 mg/mL MTT in sterile PBS. Working concentration is 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>93426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan blue (0.4% [v/v])</td>
			<td >Any supplier</td>
			<td >N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin inhibitor</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>R007100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA (0.05% [v/v])</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tween 20</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylene</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab150113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tri-sodium citrate dihydrate</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.06448.0500</td>
			<td>For antigen retrieval buffer for IF staining.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Dylight 488)</td>
			<td >Agrisera</td>
			<td>AS09 633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filaggrin Mouse antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP2-53243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Involucrin Rabbit antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP2-33742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Keratin 10 Mouse antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP2-32962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Desmoglein-1 Mouse antibody&#160;</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>MAB944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Loricrin Rabbit antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP1-33610</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivating a three-dimensional reconstructed human epidermis at a large scale

En tredimensjonal human epidermis modell rekonstruert fra neonatal primære keratinocytter presenteres. Heri er en protokoll for dyrkingsprosessen og karakteriseringen av modellen beskrevet. Neonatal primære keratinocytter dyrkes nedsenket på gjennomtrengelige polykarbonatinnlegg og løftes til luftvæskegrensesnittet tre dager etter sådd. Etter fjorten dager med stimulering med definerte vekstfaktorer og askorbinsyre i høyt kalsiumkulturmedium, er modellen fullt differensiert. Histologisk analyse avslørte en helt stratifisert epidermis, som etterligner morfologien til innfødt menneskelig hud. For å karakterisere modellen og dens barrierefunksjoner, proteinnivåer og lokalisering spesifikke for tidlig keratinocyttdifferensiering (dvs. keratin 10), senfasedifferensiering (dvs. involucrin, loricrin og filaggrin) og vevsadhesjon (dvs. desmoglein 1), ble vurdert av immunofluorescence. Vevsbarrierens integritet ble videre evaluert ved å måle transepithelial elektrisk motstand. Rekonstruert menneskelig epidermis var responsiv til proinflammatoriske stimuli (dvs. lipopolysakkarid og tumornekrose faktor alfa), noe som førte til økt cytokinfrigjøring (dvs. interleukin 1 alfa og interleukin 8). Denne protokollen representerer en enkel og reproduserbar in vitro-metode for å dyrke rekonstruert menneskelig epidermis som et verktøy for å vurdere miljøeffekter og et bredt spekter av hudrelaterte studier.

NHEKer som er dyrket i 2D, viser en tradisjonell morfologi med en konsekvent polygonal form (Figur 2A). Som beskrevet ovenfor blir NHEKs sådd inn i kulturinnlegg etter å ha nådd en sammenløp på ca. 80%. Morfologien til RhEs ble analysert ved hjelp av H&E farging og TEM. Etter 15 dager ved ALI oppnås et fullt stratifisert vev som angitt av de fire viktigste epidermale lagene: SB, SS, SG og SC (Figur 2B). I SB-laget har cellene en kolonnefigur. Fra det andre laget og mot de øvre lagene i RhE skiller NHEK-er seg som observert av endringene i cellemorfologien (fra en kolonneform i SB-laget, mot en spinøs form i SS-laget). I SG-laget har cellene en mer flatt form og viser keratohyalingranuler (KG) som er representert som lilla prikker i cytoplasma. Deres karakteristiske runde og fantastiske form er uthevet av hvite piler på H&E-bildet (Figur 2C). Cellene i SC, er terminalt differensiert og er helt flatt og mangler en cellekjerne. De stratifiserte rhes har en total tykkelse på 84,3 ± 2,4 μm og deres SC har en tykkelse på 19,6 ± 3,2 μm (Figur 2D). Disse verdiene er sammenlignbare med de som rapporteres for innfødt menneskelig hud, det vil si 60-120 μm og 10-20 μm, henholdsvis69. Antall levedyktige lag er 6-7, som er lavere sammenlignet med det av innfødt menneskelig hud, som er ca 7-1470. Ultrastrukturell analyse av rhes på forskjellige tidspunkter i rekonstitueringsprotokollen (dvs. 7, 10, 13 og 15 dager) avslører maisifiseringsprosessen til RH-ene med et økt antall corneocyte lag over tid (Figur 2E). Etter 15 dager ved ALI er SC i RhE-vevet laget av ca. 15-25 lag, som kan sammenlignes med verdien rapportert for innfødt menneskelig hud (dvs. 15-20 lag)69.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig2v2.jpg"> Figur 2: Primær keratinocytter og rekonstruert menneskelig epidermis. (A) Fasekontrastmikroskopibilde av primære keratinocytter før såing på innsatser. Skalalinjen er 50 μm. (B-C) H&E lysfeltmikroskopibilde av RhE. Skalalinjen er 50 μm (B) og 25 μm (C). (D) Kvantifisering av tykkelsen på RhE og SC (gjennomsnittlig ± SEM, n=3). (E) Transmisjonselektronmikroskopibilder av RhE-tverrsnitt etter 7, 10, 13 og 15 dager hos ALI. Skalalinjen er 4 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig2v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
I følge deres differensieringsstadium viser NHEKs som vokser i 3D forskjellige proteinuttrykkprofiler i henhold til deres differensieringsstadium. Uttrykket av proteiner som er spesifikke for tidlig keratinocyttdifferensiering (dvs. keratin 10), senfase keratinocyttdifferensiering (dvs. involucrin, loricrin og filaggrin), og keratinocyttadhesjon (dvs. desmoglein 1) i RhEs ble bestemt ved hjelp av IF-farging. Involucrin-uttrykket vises mer overveiende plassert i SG-laget siden uttrykket startes tidligere under differensieringsprosessen (Figur 3D), mens filaggrin og loricrin uttrykkes i de øvre lagene (Figur 3B-C). Keratin 10-uttrykket ble funnet i alle levedyktige lag, bortsett fra SB-laget (figur 3E). RhEs viser funksjonelle desmosomale veikryss, som angitt av uttrykket av desmoglein 1 i det intercellulære rommet til de levedyktige epidermale lagene (Figur 3F). For å konkludere, uttrykkes alle fem markørene og ligger i de aktuelle epidermale lagene og oversettes til en sunn epidermal differensieringsprosess.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig03.jpg"> Figur 3: Epidermal differensiering, vevsadhesjon og vevsintegritet for rekonstruert menneskelig epidermis. (A) H&E lysfeltmikroskopibilde av RhE. Confocal fluorescence mikroskopi bilder av (B) filaggrin (FLG), (C) loricrin (LOR), (D) involucrin (INV), (E) keratin 10 (K10), og (F) desmoglein 1 (DSG-1) representert i magenta. Nukleifarging (DAPI) er representert i blått. Skalalinjen er 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Barriereegenskapene til RhE-modellen ble undersøkt ved å vurdere både vevs levedyktighet og integritet. Vevsintegriteten ble bestemt etter 15 dager ved å måle TEER ved hjelp av et voltohmmeter. Verdiene på 2567 ± 415 Ω,cm2 som er registrert for RhEs, oversetter dannelsen av en kontinuerlig barriere (figur 4A). Disse verdiene er innen rekkevidde med verdiene som er rapportert for RhE-modellene71,72,73,74. I tillegg ble den nødvendige eksponeringstiden for et cytotoksisk referansekjemikalium (dvs. Triton X-100) for å redusere vevets levedyktighet med 50% (ET50) bestemt med en tiazolylblå tetrazoliumbromid (MTT) analyse. ET50-verdien målt for RhE var 2,1 timer. Denne verdien faller innenfor akseptområdet for andre 3D-epidermale modeller som er kvalifisert for pålitelig prediksjon av irritasjonsklassifisering (OECDs retningslinje 439)19.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig4v3.jpg"> Figur 4: Barriereegenskaper for rekonstruert human epidermis. (A) Vevsintegritet målt med transepithelial elektrisk motstand (gjennomsnittlig ± SEM, n =6). (B) ET50 bestemmes ved å måle vevs levedyktighet (dvs. MTT-analyse) ved aktuell eksponering for 78,3 μL av 1% Triton X-100 (gjennomsnittlig ± SEM, n = 3).
Responsivitet av RhEs ble undersøkt ved kjente proinflammatoriske stimuli. RhEs ble behandlet systemisk, det vil si tilsetning av stimuli i mediet av basolateralrommet, ved hjelp av 100 μg /ml Escherichia coli lipopolysakkarid (LPS) og 40 ng/ml tumornekrosefaktor alfa (TNF-α). Etter 24 timer med stimuli ble cellekulturmediet samlet inn. Cytotoksisiteten ble målt ved hjelp av en laktatdehydrogenase (LDH)-analyse og sammenlignet med verdier av en kjent membranforstyrrer, Triton X-100 vaskemiddel (figur 5). En betydelig økning (p < 0,05, enveis ANOVA, Dunnetts multisammenligningstest) ble vist i LDH-aktivitet i RhEs behandlet med Triton X-100. Både LPS og TNF-α behandlinger viste at de ikke var cytotoksiske.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig5v3.jpg"> Figur 5: Cytotoksisiteten målt via laktatdehydrogenase (LDH) analyse. Data presenteres som relative verdier for kontroll, ubehandlet vev (CTRL); gjennomsnittlig ± SEM, n=9 (Triton X-100), n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). Betydning ble testet med enveis ANOVA, Dunnetts multisammenligningstest. Stjernen angir statistisk signifikant forskjell sammenlignet med CTRL, ****p < 0,0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig5v3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Utgivelsen av interleukin 1 alfa (IL-1α) og interleukin 8 (IL-8) i RhE-mediet ble kvantifisert ved hjelp av ELISAer. Figur 6 viser både den kvantifiserte og relative IL-1α- og IL-8-utgivelsen av RH-ene etter utfordring med LPS og TNF-α. LPS-behandling resulterte i en statistisk signifikant (p < 0,05, uparret Student T-test) indusert frigjøring av IL-8 (9,6 ± 1,0 ganger økning) og IL-1α (2,7 ± 1,3 ganger økning). TNF-α induserte ikke IL-8-utslipp betydelig, selv om det ble observert en tendens til økte IL-8-nivåer (2,3 ± økning på 0,8 ganger). TNF-α gjorde imidlertid betydelig (p < 0,05, uparret Student's T-test) utløser IL-1α-utgivelse (1,8 ± økning på 0,5 ganger).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig6v3.jpg"> Figur 6: Proinflammatoriske responser i den rekonstruerte menneskelige epidermis. Konsentrasjoner av IL-8 utgivelse av RhE på en 24-timers utfordring med LPS (A) og TNF-α (B). Data representeres som gjennomsnittlig ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (C) Data representeres som gjennomsnittet av relativ verdi sammenlignet med kontroll, ubehandlet vev (CTRL) ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). Konsentrasjonen av IL-1α-utgivelsen av RhE etter en 24-timers utfordring med LPS (D) og TNF-α (E). Data representeres som gjennomsnittlig ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (F) Data representeres som gjennomsnittet av relativ verdi sammenlignet med CTRL ± SEM, n=4 (LPS), n=3 (TNF-α). Betydning ble testet av en ubetalt student T-test. Stjernen angir statistisk signifikante forskjeller sammenlignet med CTRL, *p < 0,05, ****p < 0,0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig6v3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale at JoVE.com

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

Denne protokollen beskriver en enkel metode for å dyrke tredimensjonale rekonstituerte menneskelige epidermis på en reproduserbar og robust måte. I tillegg karakteriserer den strukturfunksjonsforholdet til den epidermale barrieremodellen. De biologiske responsene til den rekonstituerte menneskelige epidermis ved proinflammatoriske stimuli presenteres også.

Dyrking av en tredimensjonal rekonstruert menneskelig epidermis i stor skala

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

In vitro eller konstruert menneskelig epidermis modell ble først utviklet på nittitallet med et primært mål om å utvikle alternative testmetoder til dyreforsøk. Disse 3D epidermale modellene brukes nå ofte til å teste både sikkerhet og effekt av kosmetiske ingredienser. Mens det kan kjøpes fra flere vevsleverandører, gir det mer fleksibilitet til sluttpunktet å kunne rekonstituere en 3D-modell i et laboratorium.Det er flere forskningsartikler som kort beskriver rekonstitueringsprotokollen til en 3D-epidermal modell, men det var til dags dato ingen video tilgjengelig som viser de kritiske trinnene i rekonstitueringsprosessen. Dette er årsaken til publiseringen av denne videoavisen. Utarbeidelsen av intern rekonstruert menneskelig epidermis gir mye frihet i dyrkingsprosessen, for eksempel endringer i kulturmediesammensetningen, proinflammatoriske eller oksidative stressutløsere, silencing av gener av interesse og hemming eller stimulering av visse biologiske prosesser.Til å begynne med, tine et hetteglass med 1 million kryo-bevarte normale humane epidermale keratinocytter, eller NHEKs, i et vannbad ved 37 grader Celsius ved å nedsenke en del av hetteglasset i vann. Inkuber hetteglasset i ett til to minutter i vannbadet, til bare en liten isbit er synlig. Resuspend cellene svært nøye ved pipettering opp og ned to til tre ganger.Overfør cellefjæringen til to T75-kolber som inneholder totalt 15 milliliter forhåndsvarslet tiningsmedium, noe som resulterer i en såddtetthet på 6,7 ganger 10 til de fjerde cellene per centimeter kvadrert. Fyll 24 brønnplater med 1,5 milliliter nedsenket medium, ideelt ved hjelp av en dispenserpipette. Etter å ha dyrket cellene til 80% samløp, er de klare for såing i innsatser for dyrking av rekonstruert menneskelig epidermis, eller RHE.Fjern basalmediet fra T75-kolbeene med NHEK-ene. Skyll cellene ved å tilsette fem milliliter forvarmet PBS til hver T75-kolbe, og fjern deretter PBS fra kolbe. Tilsett to til tre milliliter forvarmet 0,05% Trypsin-EDTA til hver kolbe, og sørg for at trypsinløsningen er like fordelt på cellekulturområdet i kolben.Plasser kolber i cellekulturinkubatoren i fire minutter, og kontroller deretter om cellene løsner ved hjelp av mikroskopet ved en 10 X forstørrelse. Rap kolben for å hjelpe cellene frigjøre fra overflaten av kolben. Når alle cellene er løsnet, legg til et likt volum av forvarmet trypsinhemmer til hver T75-kolbe, og overfør cellefjæringen fra kolber til et sentrifugerør.Skyll kolbeene med fem milliliter forvarmet PBS og overfør den til sentrifugerøret som inneholder cellefjæringen. Sentrifuger de høstede cellene ved 400 ganger G i fem minutter. Kast forsiktig de fleste supernatantene som etterlater omtrent 100 til 200 mikroliter i røret.Vi sveip forsiktig røret med fingrene for å løsne pelletsen forsiktig. Resuspend forsiktig pellet av celler i et lavt volum nedsenket medium, pipettering opp og ned 5 til 10 ganger for å sikre en jevn celle suspensjon. Start med et lavt volum for å unngå dannelse av cellemengder, og legg til opptil en milliliter nedsenket medium per første T75-kolbe.Tell cellene i suspensjonen ved hjelp av trypan blå ekskluderingsmetode. Fortynn cellefjæringen med ekstra nedsenket medium for å nå en konsentrasjon på 3,525 ganger 10 til de femte cellene per milliliter, ved hjelp av den første ligningen som er gitt i tekstmanuskriptet. Utfør et nytt celleantall av den fortynnede løsningen og bruk den andre ligningen i tekstmanuskriptet til å beregne celleopphengsvolumet som skal frøs inn i kulturinnlegget.Heng de 24 brønnkulturinnleggene i den høyeste posisjonen til bæreplaten, og overfør bæreplaten til den 24 brønnplaten som er ferdigfylt med nedsenket medium. Legg til det bestemte volumet av celleopphenget til hver innsats, pass på at du ikke berører innsatsen. Etter sådd, inkuber de 24 brønnplatene i 10 til 15 minutter ved romtemperatur for å overvinne en kanteffekt.Ikke flytt platene i løpet av denne tiden. Overfør platene til cellekulturinkubatoren, og la dem være i nedsenkede forhold i tre dager. Etter en tre-dagers inkubasjon i cellekulturinkubatoren, eksponer cellene som har festet seg til membranoverflaten til luftvæskegrensesnittet, eller ALI, ved å fjerne det nedsenkede mediet fra det apikale rommet med et aspirasjonssystem og en glass Pasteur pipette.Fyll nye 24 brønnplater med 1,5 milliliter ferskt forvarmet ALI-medium, og overfør bæreplatene med kulturinnleggene til de nye multibrønnplatene. Overfør multi-brønnplatene tilbake til cellekulturinkubatoren. Oppdater ALI-mediet annenhver til tre dager, i 14 dager.Keratinocytter i 2D-kultur viser en tradisjonell morfologi med en konsistent polygonal form. Etter 15 dager ved ALI danner den rekonstruerte menneskelige epidermis et fullt stratifisert vev, som er indikert av de fire viktigste epidermale lagene. Ultrastrukturell analyse av rekonstruert menneskelig epidermis på forskjellige tidspunkter i rekonstitueringsprotokollen avslører maisifiseringsprosessen, med et økt antall hornhinnelag over tid.Keratinocytter i epidermis viser forskjellige proteinuttrykksprofiler i henhold til deres differensieringsstadium. Involucrin-uttrykket vises mer overveiende i SG-laget, mens uttrykket av filaggrin og loricrin ligger i de øvre lagene. Keratin-10-uttrykket ble funnet i alle levedyktige lag bortsett fra SB-laget.Den rekonstruerte menneskelige epidermis viser funksjonelle desmosomale veikryss, som angitt av uttrykket av Desmoglein-1 i intercellulære rommet til de levedyktige epidermale lagene. Barriereegenskapene til den rekonstruerte epidermis-modellen ble undersøkt ved å vurdere vevs levedyktigheten ved aktuell behandling med en kjent barriereforstyrrer, og ved å vurdere vevsintegriteten. Vevsintegriteten ble bestemt etter 15 dager ved å måle TEER med et voltmeter.Respons på epidermis til Lipopolysakkarid og Tumor Necrosis Factor alfa ble undersøkt. Både LPS- og TNF-alfabehandlinger var giftfrie. i forhold til Triton X-100-kontrollen.Utgivelsen av Interleukin-1 alfa og Interleukin-8 i RHE-mediet ble kvantifisert ved hjelp av IL lysis. LPS-behandling resulterte i en statistisk signifikant oppregulering ved frigjøring av Interleukin-1 alfa og Interleukin-8. TNF alfa behandling resulterte i en statistisk signifikant up-regulering i bare utgivelsen av Interleukin-1 alfa.Imidlertid ble det også observert en klar tendens til økte Interleukin-8 nivåer ved stimulering med TNF alfa. Etter denne protokollen kan TEER måles som en verdi for barriereintegritet. Levedyktigheten eller cytotoksisiteten kan for eksempel måles ved en MTT- eller LDH-analyse.Supernatanten kan brukes til å måle sekresjonen av cytokiner eller andre proteiner. Videre kan vevet brukes til å studere uttrykket av proteiner eller gener av interesse.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Bioengineering

Unit 1

The Integumentary System

SCIENTISTS IN ACTION

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Planar og tredimensjonale Trykking av Conductive blekk

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Menneskelig bruskvev Fabrication Bruke Tredimensjonal Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analyse av celle migrasjon innenfor en tre-dimensjonal Kollagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Kloning og storskala produksjon av høykapasitets adenovirusvektorer Basert på Human adenovirus type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

Tredimensjonal Biomimetic Technology: Novel Biorubber Oppretter Defined mikro- og makroskala arkitektur i Kollagen Hydrogeler

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Utarbeidelse og analyse av<em&gt; In Vitro</em&gt; Tredimensjonal brystkreft Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Utvikling av en Flercellede Tredimensjonal organotypiske Model of Human tarmslimhinnen Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Lab-on-a-CD plattform for generering flercellede tredimensjonal Spheroids

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...