Name: cultivating a three-dimensional reconstructed human epidermis at a large scale
Uploaded: 2021-05-28T13:30:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale at JoVE.com

O Programa de Pesquisa e Inovação Horizon 2020 da União Europeia no âmbito do Bolsa Marie Skłodowska-Curie com o acordo de subvenção nº 765602 financiado este trabalho. Todos os autores reconhecem o apoio da Fundação Adolphe Merkle e da Universidade de Ferrara e reconhecem com gratidão a Dow Silicones Bélgica. Dr. Miguel Spuch-Calvar é reconhecido por preparar as imagens gráficas do processo de cultivo de RhE. Os autores agradecem à Drasler, ao Dr. Franco Cervellati e ao Dr. Agnès Tessier pelo apoio técnico e às discussões.

Revise e adere às considerações éticas nacionais e internacionais e condições relacionadas ao uso de tecidos ou células humanas antes de planejar e executar qualquer atividade de pesquisa envolvendo este protocolo. NOTA: Todas as etapas deste protocolo devem ser realizadas em condições assépticas. As práticas de biossegurança nível 2 são o requisito mínimo para o cultivo de RhEs. Todas as precauções de segurança necessárias devem ser tomadas ao manusear os produtos químicos/reagentes descritos neste protocolo.
1. Preparação de mídia de cultura celular
NOTA: Existem três tipos diferentes de meios culturais livres de soro utilizados para o cultivo de RhEs (Tabela 1): (i) o meio basal com baixo nível de cálcio (60 μM Ca2+) utilizados para a cultura 2D de NHEKs; (ii) o meio submerso com alto nível de cálcio (1,5 mM Ca2+) utilizado para a semeadura de NHEKs no sistema de inserção de cultura celular; e (iii) o meio de interface ar-líquido (ALI) com alto nível de cálcio (1,5 mM Ca2+),ácido ascórbico e fator de crescimento de queratinócitos (KGF).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Média</td>
			<td>Informações médias</td>
			<td>Quantidade necessária</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Meio basal</td>
			<td>Meio de crescimento de queratinócito</td>
			<td rowspan="3">36 mL/24 poços</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] HKGS</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] 100x antibiótico-antimíctico</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Meio submerso</td>
			<td>Meio de crescimento de queratinócito</td>
			<td rowspan="4">36 mL/24 poços</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] HKGS</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] 100x antibiótico-antimíctico</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1,5 mM Ca2+
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">Meio de interface ar-líquido</td>
			<td>Meio de crescimento de queratinócito</td>
			<td rowspan="6">216 mL/24 poços</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] HKGS</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] 100x antibiótico-antimíctico</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1,5 mM Ca2+
</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 50 μg/mL ácido ascórbico</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 10 ng/mL fator de crescimento de queatinócito</td>
		</tr>
</tbody></table>Mesa 1. Tabela sumária dos diferentes meios de cultura usados para cultivar RhEs. Lista de diferentes meios de comunicação cultural com suplementos.
<ol><li>Prepare o meio basal.<ol>
<li>Suplemente a garrafa de 500 mL de meio de crescimento queratinócito(Tabela de Materiais) com 5 mL de suplementos de crescimento de queratinócitos humanos (HKGS) a fim de atingir concentrações finais de 0,2% [v/v] bovinos extrato pituitário (BPE), 0,2 ng/mL fator de crescimento epidermal recombinante humano (EGF), 0,18 μg/mL hidrocortisona, 5 μg/mL transferrina bovina, e 0,01 μg/mL de fator de crescimento humano recombinante semelhante à insulina-I (IGF-I).</li>
		<li>Adicione 5 mL de solução antimicótica antibiótico-antimicótica de 100x contendo 10.000 unidades/mL de penicilina, 10.000 μg/mL de estreptomicina e 25 μg/mL de anfoterina B.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare o meio submerso.<ol>
<li>Suplementar a garrafa de 500 mL de meio de crescimento queratinócito(Tabela de Materiais)com 5 mL de HKGS para atingir concentrações finais de 0,2% [v/v] BPE, 0,2 ng/mL recombinante humano EGF, 0,18 μg/mL hidrocortisona, 5 μg/mL transferrin bovino e 0,01 μg/mL de recombinante humano IGF-I.</li>
		<li>Adicione 5 mL de solução antimicomolética antibiótico-antimicocética de 100x.</li>
		<li>Adicione 5 mL de uma solução de estoque cacl 2 de0,144 M (cloreto de cálcio) para atingir uma concentração final de 1,5 mM Ca2+. NOTA: A concentração de cálcio já é aumentada durante a fase submersa para estimular a diferenciação dos queratinócitos e iniciar o processo de estratificação49.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare o meio de interface ar-líquido (ALI).<ol>
<li>Suplementar uma garrafa de 500 mL de meio de crescimento de queratinócitos(Tabela de Materiais)com 5 mL de HKGS para atingir concentrações finais de 0,2% [v/v] BPE, 0,2 ng/mL recombinante humano EGF, 0,18 μg/mL hidrocortisona, 5 μg/mL transferrin bovino e 0,01 μg/mL de recombinante humano IGF-I.</li>
		<li>Adicione 5 mL de solução antimicomolética antibiótico-antimicocética de 100x.</li>
		<li>Adicione 5 mL de uma solução de estoque CaCl2 de 0,144 M para atingir uma concentração final de 1,5 mM Ca2+.</li>
		<li>Adicione 1 mL de uma solução de estoque de ácido ascórbico de 25 mg/mL para atingir uma concentração final de ácido ascórbico de 50 μg/mL.</li>
		<li>Adicione 50 μL de uma solução de estoque de 100 μg/mL KGF em 1% [w/v] gêdeua bovina em solução de estoque de soro tamponado fosfato (PBS) para alcançar uma concentração final de 10 ng/mL KGF. NOTA: Uma vez que o ácido ascórbico é sensível à oxidação, recomenda-se o uso de um ácido ascórbico estável derivado, como magnésio l-ascorbyl-2-fosfato59 ou ácido L-ascórbico 2-fosfato sesquimagnesium60. Se o ácido ascórbico for usado, recomenda-se complementar recentemente o meio ALI com ácido ascórbico antes de cada atualização.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Cultura de NHEKs
NOTA: Uma vez que os queratinócitos humanos primários permanecem proliferativos após sua quarta ou quinta passagem61, NHEKs em sua terceira passagem são usados para o cultivo de RhEs. Os queratinócitos primários devem ser tratados com muito cuidado devido à sua alta sensibilidade. A tubulação cuidadosa e lenta das suspensões celulares a qualquer momento é muito importante, para não perturbar a condição das células.
<ol><li>Descongele um frasco com 1 x 106 NHEKs criopreservados em um banho de água a 37 °C, submergindo parte do frasco na água. Incubar o frasco por 1-2 minutos no banho de água, até que apenas uma pequena lasca de gelo seja visível. ATENÇÃO: Não submergir todo o frasco no banho de água para evitar contaminações. Não descongele as células por mais de 2 minutos; isso pode reduzir a viabilidade celular. Limpe o frasco com uma solução de 70% de etanol antes de transferir o tubo para o capô laminar.</li>
	<li>Resuspenda as células com muito cuidado, pipetando para cima e para baixo 2-3 vezes. Transfira a suspensão da célula em dois frascos T75 contendo um total de 15 mL de meio de descongelamento pré-aquecido, resultando em uma densidade de semeadura de 6,7 x 104 células/cm2. NOTA: Para as duas primeiras passagens e o descongelamento de NHEKs criopreservados, o meio de cultura celular é usado de acordo com as recomendações do fornecedor.</li>
	<li>Coloque os frascos na incubadora de cultura celular (37 °C, 5% DE CO2e 95% de umidade relativa (RH)).</li>
	<li>Após aproximadamente 24 horas, substitua o meio de descongelamento pelo meio basal para remover o sulfóxido de dimetila (DMSO) da solução de congelamento de queratinócitos.</li>
	<li>Refresque o meio basal a cada dois dias.</li>
	<li>Após 4-6 dias de cultivo, as células devem estar em torno de 80% confluentes e prontas para semeadura em pastilhas para o cultivo de RhEs. NOTA: Os queratinócitos devem ser cultivados ao máximo 80% de confluência para preservar sua capacidade proliferativa62. O número de células a serem descongeladas deve levar em consideração vários parâmetros, como o número de passagem celular, a viabilidade celular após o descongelamento, a eficiência de semeadura, bem como o tempo de duplicação.</li>
</ol>3. Semeadura de NHEKs
NOTA: Este protocolo foi projetado para uso dentro de um formato de placa portadora de 24 poços. Se forem necessários outros formatos de placa (por exemplo, formato de 12 ou 6 poços), devem ser consideradas otimizações na densidade de semeadura e volume médio. A Figura 1 resume um cronograma proposto para o cultivo de RhE e mostra as condições de cultivo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig1v4.jpg"> Figura 1: Cronograma esquemático do protocolo de reconstituição. Apresentação da preparação do modelo rhe, processo de cultivo e aplicação (exposição a substância química). O esquema inclui os tipos de mídia de cultura celular apropriados para cada etapa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig1v4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<ol><li>Pré-encha 24 placas de 24 poços com 1,5 mL de meio submerso, idealmente usando uma pipeta de distribuidor.</li>
	<li>Remova o meio basal dos frascos T75 usados para a cultura dos NHEKs.</li>
	<li>Enxágüe as células adicionando 5 mL de PBS pré-aquecido a cada frasco T75.</li>
	<li>Remova o PBS dos frascos. NOTA: Este passo é crucial, uma vez que o meio contém proteínas e cálcio que inibirão a atividade de trippsina.</li>
	<li>Adicione 2-3 mL de 0,05% [v/v] trippsin/diamina de etileno tetra ácido acético (EDTA) a cada frasco T75. Certifique-se de que a solução de trippsina seja igualmente distribuída na área de cultura celular do frasco. ATENÇÃO: O volume de 2 mL baseia-se na confluência de 80% mencionada acima. Use 3 mL para frascos com maior confluência.</li>
	<li>Coloque os frascos por 4 minutos na incubadora de cultura celular (37 °C, 5% CO2e 95% RH). Verifique se as células se desprendem usando o microscópio em uma ampliação de 10x. Adote o frasco contra a palma da mão para ajudar as células a se libertarem da superfície do frasco. Células isoladas podem ser observadas como células arredondadas flutuando na solução de trippsina. ATENÇÃO: Não incubar as células em trippsina por mais de 6 minutos. A super-trypsinização pode danificar as células e diminuir sua adesão63.</li>
	<li>Uma vez que todas as células estejam separadas, adicione um volume igual (ou seja, 2-3 mL) de inibidor de trippsina pré-aquecido a cada frasco T75.</li>
	<li>Transfira a suspensão celular dos frascos para um tubo de centrífuga.</li>
	<li>Enxágüe os frascos com 5 mL de PBS pré-aquecido e transfira-os para o tubo de centrífuga contendo a suspensão celular. NOTA: Certifique-se de que a maioria das células são coletadas verificando o número de células residuais nos frascos sob o microscópio. A superfície do frasco deve estar 95% vazia. Se não for esse o caso, é possível repetir a etapa de trippsinização (3.3-3.9). Note, no entanto, que a re-trypsinização deve ser evitada.</li>
	<li>Centrifugar as células colhidas a 400 x g por 5 min.</li>
	<li>Descarte cuidadosamente a maior parte do supernasal, deixando aproximadamente 100-200 μL no tubo. ATENÇÃO: Não aspire a pelota durante este procedimento. </li>
	<li>Levemente resuspenque a pelota das células em um baixo volume de meio submerso, pipeta para cima e para baixo 5-10 vezes para garantir uma suspensão uniforme da célula. Comece com um baixo volume (ou seja, 500 μL) para evitar a formação de agregados celulares e adicione até 1 mL de meio submerso no total por frasco T75 inicial. NOTA: Mova suavemente o tubo com os dedos para dissolver cuidadosamente uma parte da pelota celular no sobrenatante.</li>
	<li>Conte as células na suspensão usando o método de exclusão azul trypan.<ol>
<li>Diluir 0,4% [v/v] trypan mancha azul e a suspensão celular em uma proporção de 1:1, adicionando 10 μL de 0,4% [v/v] trypan mancha azul a 10 μL de suspensão celular. Adicione 10 μL da solução a um slide de contagem. Meça a contagem de células imediatamente após a mistura da suspensão celular com o azul trypan, uma vez que o azul trypan começa a diminuir a viabilidade celular após a exposição superior a 1 min65. ATENÇÃO: O azul trypan mostrou-se um potencial mutagênico, cancerígeno e teratogen64. Manuseie o corante com cuidado e descarte os resíduos com segurança de acordo com as normas locais de laboratório. NOTA: Uma abordagem alternativa ao uso do azul trypan é o corante não perigoso Erythrosin B66.</li>
	</ol></li>
	<li>Diluir a suspensão celular com meio submerso adicional para atingir uma concentração de 3.525 x 105 células/mL em meio submerso adicionais adicionais, adicionando o volume V2 como mostrado na equação 1: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61802/61802eq01.jpg"> C1 = concentração celular contada na suspensão celular obtida em 3,12 (células/mL) V1 = volume usado para resuspensar a pelota de células em 3,12 (mL) C2 = concentração celular direcionada na suspensão (ou seja, 3.525 x 105 células/mL) V2 = volume a ser adicionado para atingir a concentração celular alvo (mL) NOTA: A superfície da inserção de cultura recomendada é de 0,47 cm2; portanto, a densidade de semeadura correspondente é de 3,75 x 105 células/cm2.</li>
	<li>Realize uma segunda contagem de células (C3) da solução diluída obtida na etapa 3.14. Use a equação 2 para calcular o volume de suspensão celular (V4) a ser semeado na inserção de cultura: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61802/61902eq02.jpg"> C3 = concentração celular direcionada na suspensão (ou seja, 3.525 x 105 células/mL) V3 = volume direcionado da suspensão celular a ser semeada na inserção de cultura (ou seja, 0,5 mL) C4 = concentração celular contada na suspensão diluída obtida em 3,14 (células/mL) V4 = volume real da suspensão celular a ser semeada na inserção de cultura (mL)</li>
	<li>Pendure as 24 pastilhas de cultura celular na posição mais alta da placa de transporte recomendada e transfira a placa portadora para a placa de 24 poços pré-preenchida com meio submerso (cf. 3.1). ATENÇÃO: Ao transferir a placa portadora para a placa multi-poço, certifique-se de que não há bolhas de ar presas entre a membrana de inserção e o meio submerso do compartimento basal, pois isso afetará a alimentação das células e, em última instância, comprometerá a viabilidade e a morfologia do RhE.</li>
	<li>Adicione o volume determinado V4 (da equação 2) da suspensão celular a cada inserção. NOTA: Recomenda-se usar a técnica de tubulação reversa para dispensar com precisão a suspensão celular às pastilhas de cultura. ATENÇÃO: Certifique-se de não danificar a membrana ao dispensar a suspensão celular na inserção da cultura. Uma precaução é dispensar a suspensão celular ao longo da parede do sistema de pastilha sem tocar na superfície da membrana.</li>
	<li>Após a semeadura, incubar as placas de 24 poços por 10-15 min em temperatura ambiente, para superar um efeito de borda (ou seja, distribuição de temperatura não uniforme entre todos os poços67). Não mova as placas durante este tempo.</li>
	<li>Transfira as placas para a incubadora de cultura celular (37 °C, 5% CO2e 95% RH). As células são mantidas em condições submersas por três dias. NOTA: Para evitar a variabilidade do tecido, não empilhe as placas na incubadora após a semeadura para garantir que cada inserção receba a mesma quantidade de calor. Após três dias (ou seja, durante o cultivo de ALI), o empilhamento de placas é possível.</li>
</ol>4. Cultivo na Interface Ar-Líquido
<ol><li>Após uma incubação de três dias na incubadora de cultura celular (37 °C, 5% CO2e 95% RH), expõem as células que aderiram à superfície da membrana ao ALI removendo o meio submerso do compartimento apical preferencialmente usando um sistema de aspiração e uma pipeta Pasteur de vidro. NOTA: Alternativamente, o meio submerso do compartimento apical pode ser removido com uma micropipette manual.</li>
	<li>Encha novas placas de 24 poços com 1,5 mL de meio ALI pré-aquecido fresco e transfira as placas portadoras com as pastilhas de cultura para as novas placas multi-poço.</li>
	<li>Transfira as placas multi-poços de volta para a incubadora de cultura celular (37 °C, 5% CO2e 95% RH).</li>
	<li>Atualize o meio ALI a cada 2-3 dias durante 14 dias.</li>
	<li>Realizar a atualização em duas etapas: 1) preparar uma nova placa contendo 1,5 mL/poço de meio ALI pré-aquecido fresco e 2) transfira a placa portadora para a nova placa. ATENÇÃO: Durante todo o procedimento de reconstituição é melhor não remover a tampa que cobre a placa portadora para manter os RhEs protegidos contra uma contaminação potencial. NOTA: A etapa ALI é crucial para o desenvolvimento de um modelo epidérmico estratificado, pois permite a diferenciação terminal dos queratinócitos68. Depois de ir para ALI, é necessário um controle visual das pastilhas, para verificar se há "tecidos vazando": gotículas médias na superfície do tecido provenientes do compartimento basolateral. Se o vazamento acontecer no ali dia 3, remova suavemente o meio da inserção da cultura sem tocar na superfície do tecido. Se o vazamento persistir, recomenda-se descartar tecidos vazando, pois é uma indicação de que não há formação correta de barreira no modelo RhE.</li>
	<li>Ao final do processo de reconstituição, os tecidos podem ser expostos a vários estressores para induzir, por exemplo, estresse oxidativo ou inflamação. Em paralelo, podem ser tratados com compostos químicos ou ingredientes cosméticos. NOTA: Durante a exposição/tratamento, os tecidos geralmente são mantidos em meio submerso a partir de ALI D14. Quando se espera que os tecidos sejam expostos/tratados por um longo período de tempo (ou seja, 48-72 horas), recomenda-se (i) iniciar a exposição/tratamento mais cedo no processo de cultivo ali, como d7-D9, para evitar o afinamento das camadas viáveis e o espessamento da SC, e (ii) para incubar os tecidos em meio ALI, para continuar estimulando a proliferação celular.</li>
	<li>Para a colheita de RhE, colete os tecidos e o meio de cultura celular no ponto de tempo de interesse para análise histológica, ensaios de viabilidade, extração de proteína/RNA e ensaios imunosorbentes ligados à enzima (ELISAs).</li>
</ol>

Marc Eeman e Benedetta Petracca são funcionários da Dow Silicones Bélgica. Todos os outros autores não têm nada a revelar.

Os RhEs são amplamente utilizados como ferramentas de triagem nos campos farmacêutico e dermato-cosmético36,75,76,77,78. Embora várias empresas tenham disponibilizado esses RhEs comercialmente, elas permanecem caras e limitam a possibilidade de variar parâmetros de cultivo conforme necessário para abordar novas questões de pesquisa. Este artigo descreve o procedimento de produção de RhEs internos de forma robusta e confiável e fornece uma caracterização detalhada dos tecidos obtidos para confirmar a relevância do modelo como uma abordagem alternativa aos testes em animais.
Algumas das etapas do protocolo são cruciais para garantir a diferenciação adequada da queratinócito e a reprodutibilidade do RhE. Isso pode ser realizado utilizando as células ideais, tipos médios e condições de cultivo. No modelo RhE proposto, os NHEKs neonatais foram selecionados por sua falta de exposição antigênica, em comparação com os NHEKs adultos. Além disso, os queratinócitos limitavam-se à etnia caucasiana para evitar a variabilidade entre espécies. Queratinócitos primários são tipicamente usados para sua capacidade de diferenciar e estratificar79. Eles podem ser obtidos comercialmente ou por isolamento interno da pele adulta80. O cultivo de uma linha celular (ou seja, HaCaT) em uma membrana de policarbonato, mostrou falta de diferenciação e demonstrou uma capacidade prejudicada de sintetizar lipídios necessários para a formação de barreiras81. No entanto, a inclusão de diferentes matrizes culturais, como hidrogéis, colágeno, fibrina e culturas esferoides, resultou no desenvolvimento bem-sucedido de modelos de pele 3D78,82,83,84,85,86. As linhas celulares imortalizadas, N/TERT, mostraram-se adequadas para o desenvolvimento de RhEs35. Queratinócitos primários permanecem proliferativos em sua quarta ou quinta passagem61, portanto, o protocolo atual inclui o uso de queratinócitos em sua terceira passagem. De Vuyst et al. demonstraram que a densidade de semeadura celular é importante e precisa ser suficiente (ou seja, ≥ 2,5x105 células/cm2) para garantir que o meio do compartimento basolateral não se difunda ao compartimento apical. Uma densidade de semeadura insuficiente (ou seja, < 2.5x105 células/cm2) pode resultar em uma incapacidade de formar uma barreira adequada, que é indicada pela difusão do meio do basolateral para o compartimento apical, resultando em condições submersas em vez de cultura ALI62. Meio de crescimento de queratinócitos sem soro (ver Tabela de Materiais) foi preferido para fins de reprodutibilidade, pois oferece a vantagem de trabalhar com um meio quimicamente definido e reduz o risco de contaminação. Este meio tem menor concentração de cálcio (ou seja, 60 μM) e, portanto, estimula a proliferação de queratinócitos87. O aumento da concentração de cálcio (ou seja, 1,5 mM) a partir da primeira etapa do cultivo de RhE favorece a diferenciação de queratinócitos e a formação de barreiras cutâneas e homeostase49. Além disso, o meio ALI é suplementado com ácido ascórbico, que tem se mostrado crucial para a formação de lipídios de SC e para promover a diferenciação52,53,54. O meio ALI também contém KGF, que é um fator de crescimento secretado por fibroblastos que podem se ligar aos receptores transmembranos queratinócitos e após a ativação tem um papel duplo na diferenciação e reparação de feridas55,88. É importante atualizar o meio ALI em intervalos de tempo específicos, para fornecer um fornecimento constante de nutrientes frescos para os RhEs. O uso de um sistema de placas portadoras é crucial para o cultivo de RhE em uma escala maior (ou seja, 24 inserções/placa). Oferece a vantagem de economizar tempo, reduzir o risco de contaminação, e deixa menos espaço para a introdução de erros humanos. Ele também oferece a possibilidade de cultivar RhEs em um alto volume de mídia (ou seja, 1,5 mL), o que reduz o número necessário de atualizações médias ali. Além disso, oferece a possibilidade de transferir uma placa completa de pastilhas para uma placa com meio fresco, evitando contato com as pastilhas individualmente ou descobrindo a tampa da placa.
Existem várias limitações do modelo RhE que devem ser notadas. Na pele humana nativa há um equilíbrio entre a proliferação de queratinócitos na camada basal e o desprendimento de corneócitos na SC (ou seja, desquamation)89. No entanto, in vitro, a dessaquamação não ocorre. Portanto, os corneócitos permanecem ligados ao RhE e formam uma SC grossa que é menos fisiologicamente relevante. Portanto, há um tempo limitado de cultivo de RhEs. Além disso, este modelo de RhE é simples e simples, uma vez que consiste em um tipo de célula singular, ou seja, o queratinócito, que é o tipo celular mais abundante da epiderme. No entanto, existem outros tipos de células residentes na epiderme, como melanócitos, células dendríticas (ou seja, células Langerhans), células T (por exemplo, CD8+ células), e células Merkel13. Para aumentar a relevância fisiológica do modelo de pele, pesquisadores tornaram os modelos de pele mais complexos adicionando melanócitos38 , células imunes39, ou células derivadas do paciente90. Deve-se ter em mente que as propriedades de barreira dos modelos de pele humana são diferentes em comparação com a pele humana nativa, devido a uma composição lipídica diferente de SC e uma maior permeabilidade de barreira 91,92,93,94,95. No entanto, vários estudos relataram mudanças nas propriedades de barreira de modelos de pele humana pelo cultivo sob hipóxia96 ou diminuição da umidade relativa97, a modulação da matriz dérmica com chitosan98, e alteração nos ácidos graxos livres no meio da cultura99. Além disso, tanto em RhEs simples quanto mais complexos, as condições de cultura e a composição média podem ser moduladas para imitar características patológicas. Desafiando o modelo com citocinas, uma morfologia anormal100 e alterações nos níveis de expressão genética e proteica podem ser estabelecidas que são tipicamente observadas em distúrbios comuns da pele, como dermatite atópica e psoríase35,101,102,103,104,105. Silenciar genes específicos em queratinócitos antes de iniciar o processo de reconstituição do modelo 3D é outra abordagem usada para imitar características de distúrbios da pele e investigar novas soluções terapêuticas106,107. Além de modelar apenas uma camada epidérmica, um compartimento dérmico pode ser incluído no modelo (ou seja, chamados de equivalentes de pele humana ou modelos de espessura total) incorporando fibroblastos em uma matriz de colágeno antes da reconstituição do RhE, tornando-o mais fisiologicamente relevante e adequado para estudos relacionados ao envelhecimento e cicatrização de feridas108,109,110. Além disso, os esferoides tumorais foram adicionados aos equivalentes da pele humana para estudar a progressão do melanoma111,112. Os últimos avanços no campo dos modelos de pele são a bioimprimem e a pele em um chip. Vários grupos de pesquisa tiveram sucesso recentemente no desenvolvimento de equivalentes de pele biofusable (perfusíveis)45,113,114. O protocolo proposto aproveita um formato de 24 poços e uma placa portadora, evitando que as pastilhas sejam manuseadas individualmente. No entanto, a escala de estudo ainda é bastante limitada e carece de automação. Ao implementar o uso de bioimprimem ou pele em um chip, modelos de pele menores podem ser usados com processos mais automatizados e em maior escala.
O RhE descrito neste protocolo tem múltiplas semelhanças com os modelos epidérmicos comerciais já desenvolvidos e bem caracterizados. A análise morfológica demonstrou que, embora o número de camadas viáveis no modelo RhE proposto seja menor se comparado ao da pele humana nativa (ou seja, 6-7 em comparação com 7-14), é comparável ao do modelo EpiDerm RhE (ou seja, 8-12)70. Da mesma forma que os modelos EpiDerm, EpiSkin e SkinEthic, a camada rhe superior mostra um padrão de cesto de camadas de corneócito densamente embaladas28. Além disso, a análise do TEM revelou que o número de camadas de SC no modelo RhE proposto (ou seja, 15-25) é comparável ao do EpiDerm (ou seja, 16-25)70. No geral, o modelo RhE proposto demonstra uma estrutura semelhante à de outros modelos epidérmicos comercializados, imitando a epiderme humana nativa. A integridade tecidual medida pelo TEER está em faixa com modelos comerciais de RhE (ou seja, entre 3000-5600 Ω,cm2)71,72,73 e outros RhEs internos (ou seja, aproximadamente 5000 Ω,cm2)74,115. O modelo RhE proposto mostra-se bem diferenciado, como indicado pela presença e correta localização de marcadores de diferenciação e adesão tecidual. Além disso, o modelo RhE proposto mostra ser responsivo a estímulos proinflamatórios (ou seja, LPS e TNF-α).
Para concluir, o protocolo atual mostra como produzir RhEs de forma confiável e em escala relativamente grande para atender às necessidades dos pesquisadores em instituições acadêmicas e privadas. O modelo RhE proposto mostra ter morfologia semelhante, diferenciação epidérmica e responsividade biológica a outros modelos comerciais existentes. Fornece uma ferramenta alternativa para o campo farmacêutico e dermato-cosmético quando o acesso a um modelo de pele relevante é necessário.

A epiderme é a camada mais externa da pele, na interface direta entre o corpo humano e o ambiente externo. Suas principais funções são fornecer proteção e hidratação1. A epiderme atua como uma barreira física eficaz contra agentes externos e evita a perda excessiva de água do corpo. Essas funções de pele dependem principalmente do arranjo celular nas camadas mais externas da pele, da composição e organização dos lipídios intercelulares2. A epiderme é composta principalmente de queratinócitos que migram para cima para o lado externo do tecido e sofrem diferenciação. Existem 4-5 camadas epidérmicas que são caracterizadas pelo seu estágio de diferenciação. De dentro para fora, as camadas epidérmicas partem da epiderme viável, ou seja, do estrato basale (SB), do spinosum estrato (SS) e do estrato granuloso (SG), até a camada superior não viável, ou seja, o estrato corneum (SC)3. A camada basal é composta principalmente de queratinócitos enriquecidos com queratina, que migram através da SS após a diferenciação4. Durante a maturação do queratinócito, ocorrem várias mudanças na expressão e estrutura proteica. Os queratinócitos aderem através da formação de junções desmosômicas5. No SG, a geração de corpos lamelares é iniciada. Consistem em precursores lipídes e enzimas que são cruciais para a formação da função de barreira cutânea6. O SG também é caracterizado pela presença de grânulos de queatohyalina no citoplasma dos queratinócitos. Na interface com o SC, o conteúdo dos corpos lamelares é extrudado nos espaços intercelulares e os lipídios não polares, como ceramidas, colesterol e ácidos graxos livres se organizam em bicamadas lipídicas lamelares empilhadas para formar a matriz lipídica extracelular7. Na SC, as células perdem todas as organelas celulares, incluindo o núcleo, devido a processos de degradação enzimática e adotam uma morfologia achatada. Eles são cercados por um envelope cornificado feito de camadas proteicas cruzadas, e são chamados de corneócitos8,9. Os componentes desmosómicos estão ligados ao envelope cornificado para formar corneodesmosomosomos e unir os corneócitos. O epitélio resultante é continuamente renovado a partir de células-tronco, com um tempo de rotatividade de aproximadamente 5-6 semanas10. O processo de diferenciação dos queratinócitos, que resulta em epiderme totalmente estratificada, é crucial para a formação da função barreira da pele11.
Durante a ferida e inflamação, os queratinócitos induzem alterações em moléculas de adesão e receptores de superfície e desencadeiam respostas proinflamatórias por meio da secreção de citocinas, quimiocinas e peptídeos antimicrobianos12. A pele não é apenas uma barreira física contra substâncias exógenas; também age como um sensor imunológico após a exposição a patógenos. Além disso, regula a difusão de várias substâncias em suas camadas, como o teor de água para proteger o corpo humano da desidratação. A pele também está envolvida na síntese da vitamina D e possui várias outras funções metabólicas3,13,14.
Para avaliar os efeitos adversos das substâncias exógenas, os toxicologistas se baseiam há décadas em testes em animais, mas hoje em dia não é a abordagem preferida. Além de ter capacidade preditiva limitada para a toxicidade humana, os modelos animais envolvem inúmeras questões éticas. A proibição de testes em animais na indústria cosmética e a recomendação de seguir o princípio 3R (ou seja, Substituição, Redução e Refinamento) em pesquisa levaram ao desenvolvimento de métodos alternativos de teste baseados em abordagens in vitro15. Os primeiros modelos de células da pele in vitro já foram descritos na década de 90, e um desenvolvimento impressionante de simples monoculturas de queratinócitos humanos a modelos de epiderme totalmente diferenciados e de espessura total foi alcançado16. Atualmente, a engenharia de tecidos de pele ganhou importância tanto nos campos farmacêutico quanto dermato-cosméticos. Nas últimas duas décadas, várias empresas comercializaram epiderme humana reconstruída tridimensional (3D) que representam ferramentas padronizadas e reprodutíveis para estudos relacionados à pele. Vários modelos comerciais de RhE são aceitos para testes in vitro de pele de produtos químicos de acordo com as diretrizes da OCDE para o teste de irritação da pele17,18 (ou seja, diretriz de teste 43919) e corrosão da pele20 (ou seja, diretriz de teste 43121). O teste in vitro para sensibilização da pele22 (ou seja, ensaio SENS-IS) está atualmente na faixa de aprovação e sob revisão por pares23. Há também inúmeros outros ensaios desenvolvidos que utilizam modelos comerciais de RhE, para avaliar a fototoxicidade24, testar formulações de medicamentos25,formulações cosméticas e ingredientes ativos26,estudar a função da barreira cutânea27 e testar a resposta biológica aos estressores ambientais28,29,30,31.
Além dos modelos de pele 3D disponíveis comercialmente, vários grupos de pesquisa desenvolveram seus próprios RhEs32,33,34,35,36,37. Os RhEs internos oferecem a vantagem de controlar as condições culturais de acordo com o propósito do estudo. Especificamente, os pesquisadores podem selecionar o tipo e a fonte dos queratinócitos a serem usados para a reconstituição de seu modelo epidérmico 3D (ou seja, primário vs. imortalizado, neonatal versus idoso, doadores aleatórios solteiros vs. agrupados, sexo, etnia, hábitos de vida individuais como fumar, etc.). Eles têm a possibilidade de variar a composição do meio cultural e incorporar fatores de crescimento, vitaminas ou outros compostos que possam modular a expressão de proteínas-alvo ou lipídios. Com rhes internos, os pesquisadores também podem investigar respostas biológicas e propriedades biomecânicas em função do estado de diferenciação do modelo 3D. Além desses parâmetros intuitivos, há esforços contínuos para aumentar a complexidade dos modelos de pele 3D e torná-los mais fisiologicamente relevantes, por exemplo, adicionando outros tipos de células epidérmicas (por exemplo, melanócitos e células imunes)38,39, culminando os queratinócitos em cima de uma matriz de colágeno povoada por fibroblastos40,41,42, e incluindo componentes da rede vascular43,44,45.
Embora seja possível ajustar as condições de cultura de acordo com necessidades específicas, existem parâmetros que devem ser respeitados para garantir tanto a qualidade quanto a relevância de um RhE. Para cultivar tecidos RhE, os queratinócitos epidérmicos normais (NHEKs) são semeados em inserções específicas de cultura permeável cuja membrana sintética porosa separa os poços em dois compartimentos, ou seja, o compartimento apical e basolateral. A porosidade da membrana (ou seja, um tamanho de poroso de 0,4 μm) é tal que permite a formação de uma monocamada celular no compartimento apical sem migração de células para o lado da inserção basal, e a alimentação dos queratinócitos com nutrientes essenciais do meio de cultura contido no compartimento basolateral. No início do processo de reconstituição, os NHEKs são cultivados em condições submersas por alguns dias para permitir sua adesão à membrana. O nível de cálcio em ambos os compartimentos é aumentado em comparação com a concentração de cálcio usada para a cultura 2D de NHEKs para retardar a proliferação de células e promover sua diferenciação46. Um gradiente epidérmico de cálcio é essencial para regular a formação de barreiras e a homeostase47,48. Altos níveis de cálcio (ou seja, até 1,5 mM) promovem a formação de junções intercelulares e modulam a formação do envelope cornificado durante a diferenciação terminal49. Uma vez que os queratinócitos formam uma monocamadas contínua e firmemente aderente na membrana de suporte, o meio do compartimento apical é removido e o processo de cultura continua na interface ar-líquido (ALI) para estimular a estratificação e estabelecer uma barreira epidérmica50,51. Condições de cultura específicas são cruciais para obter um epitélio totalmente estratificado36. Durante o processo de reconstituição na ALI, o meio no compartimento basolateral é suplementado com fator de crescimento de queratinócitos (KGF), insulina, cálcio e ácido ascórbico. O ácido ascórbico desempenha um papel importante na formação de uma barreira lipídica de SC apropriada, assemelhando-se intimamente à da pele humana nativa52. Os querotinócitos cultivados em meio ascórbico suplementado por ácido demonstram um fenótipo diferenciado, com um número aprimorado de grânulos de ceratohyalina, bem como lamellae lipídica intercelular organizada nos interstícios dos corneócitos52. Tal suplementação é essencial para melhorar a função da barreira epidérmica, aumentando o teor de envelopes cornificados e evitando o esgotamento dos estoques de antioxidantes hidrofílicos53,54. O KGF, importante mediador paracrino de proliferação e diferenciação epidérmica, é usado para estimular os NHEKs55.
As principais desvantagens das RMS internas incluem a perda de padronização entre as instituições de pesquisa e o aumento da intensidade do trabalho e do consumo de tempo (até 3 semanas em comparação com os modelos comerciais prontos para uso). O objetivo do presente artigo é abordar essas desvantagens, estabelecendo a base de produção em maior escala. Além das vantagens acima mencionadas das RMS internas, o protocolo atual visa reduzir a intra e intervariabilidade entre os tecidos, reduzir os riscos de contaminação e agilizar o processo de cultivo.
O protocolo atual descreve um método reprodutível e robusto para cultivar RhEs usando NHEKs neonatais. Além disso, mostra resultados representativos da caracterização da morfologia dos RhEs, integridade da barreira e expressão de proteínas específicas para diferenciação epidérmica. A estrutura morfológica dos Roses foi examinada utilizando-se a coloração de hematoxilina e eosina (H&E) de coloração e microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Para avaliar a integridade da barreira, foram medidas a resistência elétrica transepidérmica (TEER) e o tempo de exposição ao Tritão X-100 para reduzir 50% da viabilidade tecidual (ET50). A formação de junções desmosômicas (ou seja, desmogleina 1) foi analisada por imunofluorescência (IF) para avaliar a adesão da queratinócito. A formação de proteínas estruturais epidérmicas (ou seja, involucrina, loricrin e filaggrin) foi avaliada e detectada com IF. Essas proteínas estão envolvidas na formação do envelope proteico altamente interligado que envolve corneócitos de SC e, como resultado, são marcadores importantes para a diferenciação epidérmica em estágio tardio56,57. Além disso, o IF foi utilizado para analisar a queratina 10, proteína induzida em células diferenciadas em estágio inicial na SS58 e encontrada dentro de todas as camadas diferenciadas. Finalmente, foi investigada a resposta do RhE a estímulos proinflammatórios (ou seja, lipopolisacarídeo e fator de necrose tumoral alfa). Os níveis de interleucina 1 alfa (IL-1α) e interleucina 8 (IL-8) foram medidos nos meios de cultura celular, utilizando ensaios imunosorbentes ligados à enzima (ELISA).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Acetic acid</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >A6283</td>
			<td >Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibiotic-antimycotic (100x)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aqueous Eosin Y solution</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >HT110280</td>
			<td >Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td >Sigma Aldrich or Merck</td>
			<td>C8106 or 1.02378.0500</td>
			<td >Prepare a stock solution of 0.144 M, filter sterilize and store aliquots at -20 &#176;C.&#160; It is recommended to prepare new aliquots every 6 months.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>Prepare a stock at 100 &#956;g/mL and store aliquots at -20 &#176;C. Working conditon is 1 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Entellan mounting medium</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.07960.0500</td>
			<td>Mounting medium for H&#38;E staining.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EpiLife medium (referred to as keratinocyte growth medium)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>MEPI500CA</td>
			<td >Contains 0.06 mM of Ca2+.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol absolute</td>
			<td >Any supplier</td>
			<td >N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formalin 10%</td>
			<td >Leica Biosystems</td>
			<td >3800770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human keratinocytes growth supplement (HKGS) (100x)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>S0015</td>
			<td >To reach final concentrations of 0.2% [v/v] BPE, 0.2 ng/mL human recombinant EGF, 0.18 &#956;g/mL hydrocortisone,5 &#956;g/mL bovine transferrin, and 0.01 &#181;g/mL human recombinant insulin-like growth factor-I.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropanol</td>
			<td >Biosolve B.V.</td>
			<td >0016264102BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kaiser&#39;s glycerol gelatine, phenol-free</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.08635.0100</td>
			<td>Mounting medium for IF staining.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Keratinocyte growth factor (KGF)</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG-050</td>
			<td >Reconstitute KGF protein at 100 &#956;g/mL in sterile 0.1% [w/v] BSA in PBS. Prepare aliquots and store at -20&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lactate dehydrogenase (LDH) assay kit</td>
			<td >Roche</td>
			<td >4744926001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td >Prepare a stock solution of 25 mg/mL, filter sterilize and store aliquots at -20&#176;C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. Store in the dark.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lipopolysaccharide (LPS), E.coli strain O55:B5</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >L4524</td>
			<td >Prepare a stock of 1 mg/mL in sterile PBS and store aliquots at -20 &#176;C. Working concentration is 100 &#956;g/mL.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mayer&#8217;s Haematoxylin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >MHS80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs)</td>
			<td >Lonza</td>
			<td>00192906</td>
			<td >Human primary keratinocytes isolated from neonatal foreskin, pooled from at least three donors.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10010056 or 10010-015</td>
			<td >Reference numbers can vary between countries.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;)</td>
			<td >ImmunoTools</td>
			<td >11344483</td>
			<td>Prepare a stock of 100 &#956;g/mL in sterile ultrapure water. Working concentration is 40 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile ultrapure water</td>
			<td >Any supplier</td>
			<td >N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M5655</td>
			<td>Prepare a stock of 5 mg/mL MTT in sterile PBS. Working concentration is 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>93426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan blue (0.4% [v/v])</td>
			<td >Any supplier</td>
			<td >N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin inhibitor</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>R007100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA (0.05% [v/v])</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tween 20</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylene</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab150113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tri-sodium citrate dihydrate</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.06448.0500</td>
			<td>For antigen retrieval buffer for IF staining.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Dylight 488)</td>
			<td >Agrisera</td>
			<td>AS09 633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filaggrin Mouse antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP2-53243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Involucrin Rabbit antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP2-33742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Keratin 10 Mouse antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP2-32962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Desmoglein-1 Mouse antibody&#160;</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>MAB944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Loricrin Rabbit antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP1-33610</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivating a three-dimensional reconstructed human epidermis at a large scale

Um modelo de epiderme humana tridimensional reconstruído a partir de queratinócitos primários neonatais é apresentado. Aqui, é descrito um protocolo para o processo de cultivo e a caracterização do modelo. Os queratinócitos primários neonatais são cultivados submersos em pastilhas de policarbonato permeáveis e elevados à interface ar-líquido três dias após a semeadura. Após quatorze dias de estimulação com fatores de crescimento definidos e ácido ascórbico em meio de cultura de cálcio elevado, o modelo é totalmente diferenciado. A análise histológica revelou uma epiderme completamente estratificada, imitando a morfologia da pele humana nativa. Para caracterizar o modelo e suas funções de barreira, foram avaliados os níveis de proteína e localização específicas para diferenciação de queratinócitos em estágio inicial (ou seja, queratina 10), diferenciação em estágio tardio (ou seja, involucrina, loricrina e filaggrina) e adesão tecidual (ou seja, desmoglein 1), por imunorreorescência. A integridade da barreira tecidual foi avaliada pela medição da resistência elétrica transepitelial. A epiderme humanaeconstruída r responsivo aos estímulos proinflamatórios (ou seja, lipopolisacarídeo e fator de necrose tumoral alfa), levando ao aumento da liberação de citocina (ou seja, interleucina 1 alfa e interleucina 8). Este protocolo representa um método in vitro simples e reprodutível para cultivar a epiderme humana reconstruída como uma ferramenta para avaliar os efeitos ambientais e uma ampla gama de estudos relacionados à pele.

NHEKs cultivados em 2D exibem uma morfologia tradicional com uma forma poligonal consistente(Figura 2A). Como descrito acima, os NHEKs são semeados em pastilhas de cultura depois de atingir uma confluência de aproximadamente 80%. A morfologia dos RhEs foi analisada utilizando-se a coloração de H&E e a TEM. Após 15 dias na ALI, um tecido totalmente estratificado é obtido conforme indicado por suas quatro principais camadas epidérmicas: a SB, a SS, a SG e a SC (Figura 2B). Na camada SB, as células têm uma forma de coluna. A partir da segunda camada em direção às camadas superiores do RhE, os NHEKs diferenciam-se como observado pelas mudanças na morfologia celular (a partir de uma forma colunar na camada SB, em direção a uma forma espinhosa na camada SS). Na camada SG, as células têm uma forma mais achatada e exibem grânulos de ceratohyalina (KG) que são representados como pontos roxos no citoplasma. Sua forma redonda e estelar característica é destacada por setas brancas na imagem H&E (Figura 2C). As células do SC são terminantemente diferenciadas e são completamente achatadas e carecem de núcleo celular. Os RhEs estratificados têm uma espessura global de 84,3 ± 2,4 μm e sua SC tem uma espessura de 19,6 ± 3,2 μm(Figura 2D). Esses valores são comparáveis aos relatados para pele humana nativa, ou seja, 60-120 μm e 10-20 μm,respectivamente 69. O número de camadas viáveis é de 6-7, que é menor em comparação com o da pele humana nativa, sendo aproximadamente 7-1470. A análise ultraestrutural dos RhEs em diferentes pontos de tempo no protocolo de reconstituição (ou seja, 7, 10, 13 e 15 dias) revela o processo de cornificação dos RhEs com um número aumentado de camadas de corneócito ao longo do tempo(Figura 2E). Após 15 dias no ALI, o SC do tecido RhE é feito de aproximadamente 15-25 camadas, o que é comparável ao valor relatado para a pele humana nativa (ou seja, 15-20 camadas)69.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig2v2.jpg"> Figura 2: Queratinócitos primários e epiderme humana reconstruída. (A) Imagem de microscopia de contraste de fase de queratinócitos primários antes de semeadura em pastilhas. A barra de escala é de 50 μm.(B-C) Imagem de microscopia de campo brilhante H&E de RhE. A barra de escala é de 50 μm(B)e 25 μm(C). (D) Quantificação da espessura de RhE e SC (média ± SEM, n=3). (E) Imagens de microscopia eletrônica de transmissão de seções transversais rhe após 7, 10, 13 e 15 dias em ALI. A barra de escala é de 4 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig2v2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
De acordo com seu estágio de diferenciação, os NHEKs que crescem em 3D apresentam diferentes perfis de expressão proteica de acordo com seu estágio de diferenciação. A expressão de proteínas específicas para diferenciação de queratinócitos em estágio inicial (ou seja, queratina 10), diferenciação de queratinócitos em estágio tardio (ou seja, involucrina, loricrin e filaggrina) e adesão de queratinócitos (ou seja, desmogleina 1) em RhEs foi determinada utilizando mancha if. A expressão involucrina aparece mais predominantemente localizada na camada SG, uma vez que sua expressão é iniciada mais cedo durante o processo de diferenciação (Figura 3D), enquanto filaggrin e loricrin são expressas nas camadas superiores(Figura 3B-C). A expressão queratina 10 foi encontrada em todas as camadas viáveis, exceto na camada SB (Figura 3E). Os RhEs exibem junções desmosômicas funcionais, conforme indicado pela expressão de desmoglein 1 no espaço intercelular das camadas epidérmicas viáveis(Figura 3F). Para concluir, todos os cinco marcadores são expressos e localizados nas camadas epidérmicas apropriadas e traduzem-se em um processo de diferenciação epidérmica saudável.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig03.jpg"> Figura 3: Diferenciação epidérmica, aderência tecidual e integridade tecidual de epiderme humana reconstruída. (A) Imagem de microscopia de campo brilhante H&E de RhE. Imagens de microscopia de fluorescência confocal de(B) filaggrin (FLG), (C) loricrin (LOR),(D) involucrin (INV), (E) queratina 10 (K10) e (F) desmoglein 1 (DSG-1) representada em magenta. A coloração dos núcleos (DAPI) é representada em azul. A barra de escala é de 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig03large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
As propriedades da barreira do modelo RhE foram investigadas pela avaliação da viabilidade e integridade do tecido. A integridade do tecido foi determinada após 15 dias medindo o TEER usando um voltohmômetro. Os valores de 2567 ± 415 Ω,cm2 registrados para os RhEs traduzem a formação de uma barreira contínua (Figura 4A). Esses valores estão em faixa com os relatados para os modelos RhE71,72,73,74. Além disso, o tempo de exposição necessário para um químico de referência citotóxica (ou seja, Triton X-100) para reduzir a viabilidade tecidual em 50% (ET50) foi determinado com um ensaio de brometo de tetrazolium azul thiazolyl (MTT). O valor ET50 medido para o RhE foi de 2,1 horas. Esse valor está dentro da faixa de aceitação de outros modelos epidérmicos 3D qualificados para uma previsão confiável de classificação de irritação (Diretriz da OCDE 439)19.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig4v3.jpg"> Figura 4: Propriedades de barreira da epiderme humana reconstruída. (A) Integridade tecidual medida com resistência elétrica transepitelial (média ± SEM, n=6). (B) ET50 determinado pela medição da viabilidade tecidual (ou seja, ensaio MTT) sobre exposição tópica a 78,3 μL de 1% Triton X-100 (média ± SEM, n=3).
A responsividade dos RhEs foi investigada sobre estímulos proinflamatórios conhecidos. As RM foram tratadas sistematicamente, ou seja, adição de estímulos no meio do compartimento basolateral, utilizando 100 μg/mL Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) e 40 ng/mL fator de necrose tumoral alfa (TNF-α). Após 24 horas de estímulos, o meio de cultura celular foi coletado. A citotoxicidade foi medida utilizando um ensaio de lactato desidrogenase (LDH) e comparada aos valores de um conhecido disruptor de membrana, o detergente Tritão X-100(Figura 5). Um aumento significativo (p < 0,05, ANOVA unidirecional, teste de comparação múltipla de Dunnett) foi mostrado na atividade LDH em RhEs tratada com Triton X-100. Os tratamentos de LPS e TNF-α ambos não mostraram ser citotóxicos.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig5v3.jpg"> Figura 5: A citotoxicidade medida através do ensaio lactato desidrogenase (LDH). Os dados são apresentados como valores relativos ao controle, tecidos não tratados (CTRL); média ± SEM, n=9 (Triton X-100), n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). A significância foi testada com a ANOVA unidirecional, o teste de comparação múltipla de Dunnett. O asterisco denota diferença estatisticamente significativa em relação ao CTRL, ****p < 0,0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig5v3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
A liberação de interleucina 1 alfa (IL-1α) e interleucina 8 (IL-8) no meio RhE foi quantificada utilizando ELISAs. A Figura 6 mostra tanto a versão quantificada e relativa de IL-1α e IL-8 pelos RhEs após desafio com LPS e TNF-α. O tratamento LPS resultou em uma liberação estatisticamente significante (p < 0,05, teste T do estudante não remunerado) induzida de IL-8 (aumento de 9,6 ± 1,0 vezes) e IL-1α (aumento de 2,7 ± 1,3 vezes). TNF-α não induziu significativamente a liberação de IL-8, embora tenha sido observada uma tendência de aumento dos níveis de IL-8 (aumento de 2,3 ± 0,8 vezes). No entanto, a TNF-α fez significativamente (p < 0,05, teste T do estudante não pago) acionar a versão IL-1α (aumento de 1,8 ± 0,5 vezes).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig6v3.jpg"> Figura 6: Respostas pró-inflamatórias na epiderme humana reconstruída. Concentrações de IL-8 liberadas pelo RhE em um desafio de 24 horas com LPS (A) e TNF-α(B). Os dados são representados como ± MÉDIOS SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (C) Os dados são representados como a média de valor relativo em relação ao controle, tecidos não tratados (CTRL) ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). A concentração do lançamento do IL-1α do RhE em um desafio de 24 horas com LPS(D) e TNF-α(E). Os dados são representados como ± MÉDIOS SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (F) Os dados são representados como a média de valor relativo em relação ao CTRL ± SEM, n=4 (LPS), n=3 (TNF-α). A significância foi testada pelo teste T de um aluno não testado. O asterisco denota diferenças estatisticamente significativas em relação ao CTRL, *p < 0,05, ****p < 0,0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig6v3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

Este protocolo descreve um método simples para cultivar epiderme humana reconstituída tridimensional de forma reprodutível e robusta. Além disso, caracteriza a relação estrutura-função do modelo de barreira epidérmica. Também são apresentadas as respostas biológicas da epiderme humana reconstituída sobre estímulos proinflamatórios.

Cultivando uma Epiderme Humana Reconstruída Tridimensional em grande escala

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

O modelo de epiderme humana in vitro ou construído foi desenvolvido pela primeira vez na década de noventa com o objetivo principal de desenvolver métodos alternativos de teste para experimentação animal. Esses modelos epidérmicos 3D são agora comumente usados para testar tanto a segurança quanto a eficácia dos ingredientes cosméticos. Considerando que pode ser comprado de vários fornecedores de tecidos, poder reconstituir um modelo 3D em laboratório dá mais flexibilidade ao ponto final de interesse.Existem vários artigos de pesquisa descrevendo brevemente o protocolo de reconstituição de um modelo epidérmico 3D, mas não havia, até o momento, nenhum vídeo disponível mostrando as etapas críticas do processo de reconstituição. Esta é a razão por trás da publicação deste vídeo. A preparação de epiderme humana reconstruída internamente permite muita liberdade no processo de cultivo, como alterações na composição média da cultura, gatilhos de estresse pró-inflamatório ou oxidativo, silenciamento de genes de interesse e inibição ou estimulação de certos processos biológicos.Para começar, descongele um frasco com 1 milhão de queratinócitos epidérmicos normais preservados por crio-preservados, ou NHEKs, em um banho de água a 37 graus Celsius submergindo parte do frasco na água. Incubar o frasco por um a dois minutos no banho de água, até que apenas uma pequena lasca de gelo seja visível. Resuspenda as células com muito cuidado, encanar para cima e para baixo duas a três vezes.Transfira a suspensão da célula em dois frascos T75 contendo um total de 15 mililitros de meio de descongelamento pré-avisado, resultando em uma densidade de semeadura de 6,7 vezes 10 para as quartas células por centímetro quadrado. Pré-encha 24 placas de poço com 1,5 mililitros de meio submerso, idealmente usando uma pipeta dispensadora. Após a cultura das células até 80%, elas estão prontas para semeadura em pastilhas para o cultivo de epiderme humana reconstruída, ou RHEs.Remova o meio basal dos frascos T75 com os NHEKs. Enxágüe as células adicionando cinco mililitros de PBS pré-aquecidos a cada frasco T75 e, em seguida, remova o PBS dos frascos. Adicione dois a três mililitros de 0,05% trypsin-EDTA pré-aquecidos a cada frasco, certificando-se de que a solução de trippsina seja igualmente distribuída na área de cultura celular do frasco.Coloque os frascos na incubadora de cultura celular por quatro minutos e verifique se as células se desprendem usando o microscópio em uma ampliação de 10 X. Rap o frasco para ajudar as células a se libertarem da superfície do frasco. Uma vez que todas as células são separadas, adicione um volume igual de inibidor de trippsina pré-aquecido a cada frasco T75, e transfira a suspensão celular dos frascos para um tubo de centrífuga.Enxágüe os frascos com cinco mililitros de PBS pré-aquecidos e transfira-os para o tubo de centrífuga contendo a suspensão celular. Centrifugar as células colhidas a 400 vezes G por cinco minutos. Descarte cuidadosamente a maioria dos supernasceres deixando aproximadamente 100 a 200 microliters no tubo.Gire suavemente o tubo com os dedos para soltar cuidadosamente a pelota. Levemente resuspenque a pelota das células em um baixo volume de meio submerso, pipetando para cima e para baixo 5 a 10 vezes para garantir uma suspensão uniforme da célula. Comece com um volume baixo para evitar a formação de agregados celulares, e adicione até um mililitro de meio submerso por frasco T75 inicial.Conte as células na suspensão usando o método de exclusão azul trypan. Diluir a suspensão celular com meio submerso adicional para atingir uma concentração de 3.525 vezes 10 para as quintas células por mililitro, usando a primeira equação fornecida no manuscrito do texto. Realize uma segunda contagem celular da solução diluída e use a segunda equação no manuscrito do texto para calcular o volume de suspensão celular a ser semeado na inserção de cultura.Pendure as 24 inserções de cultura de poço na posição mais alta da placa portadora, e transfira a placa portadora para a placa de 24 poços pré-preenchida com meio submerso. Adicione o volume determinado da suspensão da célula a cada inserção, tomando cuidado para não tocar na inserção. Após a semeadura, incubar as 24 placas do poço por 10 a 15 minutos à temperatura ambiente para superar um efeito de borda.Não mova as placas durante este tempo. Transfira as placas para a incubadora de cultura celular, e deixe-as em condições submersas por três dias. Após uma incubação de três dias na incubadora de cultura celular, exponha as células que aderiram à superfície da membrana à interface líquida do ar, ou ALI, removendo o meio submerso do compartimento apical com um sistema de aspiração e uma pipeta Pasteur de vidro.Encha novas 24 placas de poço com 1,5 mililitros de meio ALI pré-aquecido fresco, e transfira as placas portadoras com as pastilhas de cultura para as novas placas multi-poço. Transfira as placas multi-poços de volta para a incubadora de cultura celular. Atualize o meio ALI a cada dois ou três dias, durante 14 dias.Os queratinócitos na cultura 2D exibem uma morfologia tradicional com uma forma poligonal consistente. Após 15 dias na ALI, a epiderme humana reconstruída forma um tecido totalmente estratificado, que é indicado por suas quatro principais camadas epidérmicas. A análise ultraestrutural da epiderme humana reconstruída em diferentes pontos de tempo no protocolo de reconstituição revela o processo de cornificação, com um número aumentado de camadas de córneas ao longo do tempo.Os queratinócitos na epiderme apresentam diferentes perfis de expressão proteica de acordo com seu estágio de diferenciação. A expressão involucrina aparece mais predominantemente na camada SG, enquanto a expressão de filaggrin e loricrin está localizada nas camadas superiores. A expressão queratina-10 foi encontrada em todas as camadas viáveis, exceto na camada SB.A epiderme humana reconstruída exibe junções desmosômicas funcionais, como indicado pela expressão de Desmoglein-1 no espaço intercelular das camadas epidérmicas viáveis. As propriedades da barreira do modelo de epiderme reconstruída foram investigadas pela avaliação da viabilidade tecidual no tratamento tópico com um disruptor de barreira conhecido, e pela avaliação da integridade do tecido. A integridade do tecido foi determinada após 15 dias medindo o TEER com um voltímetro.A resposta da epiderme ao Lipopolisacarídeo e ao Fator de Necrose Tumoral alfa foi investigada. Ambos os tratamentos alfa lps e TNF não eram tóxicos. em relação ao controle Triton X-100.A liberação de Interleukin-1 alfa e Interleucina-8 no meio RHE foi quantificada por meio de il lysis. O tratamento lps resultou em um aumento estatisticamente significativo na liberação de Interleukin-1 alfa e Interleukin-8. O tratamento alfa TNF resultou em uma regulação estatisticamente significante na liberação de Interleukin-1 alfa.No entanto, uma clara tendência de aumento dos níveis de Interleucina-8 também foi observada após a estimulação com TNF alfa. Seguindo este protocolo, o TEER pode ser medido como um valor para a integridade da barreira. A viabilidade ou citotoxicidade pode ser medida por um ensaio MTT ou LDH, por exemplo.O supernante pode ser usado para medir a secreção de citocinas ou outras proteínas. Além disso, o tecido pode ser usado para estudar a expressão de proteínas ou genes de interesse.

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Bioengenharia

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