Name: cultivating a three-dimensional reconstructed human epidermis at a large scale
Uploaded: 2021-05-28T13:30:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale at JoVE.com

Программа исследований и инноваций Европейского Союза «Горизонт 2020» в рамках гранта Марии Склодовской-Кюри с грантовым соглашением No 765602 финансировала эту работу. Все авторы признают поддержку Фонда Адольфа Меркла и Университета Феррары и с благодарностью отмечают Dow Silicones Belgium. Доктор Мигель Спух-Голвар признан за подготовку графических изображений процесса выращивания RhE. Авторы благодарят д-ра Барбару Драслер, д-ра Франко Червеллати и д-ра Аньес Тессье за их техническую поддержку и обсуждения.

Марк Иман и Бенедетта Петракка являются сотрудниками Dow Silicones Belgium. Всем остальным авторам нечего раскрывать.

RHes широко используются в качестве скрининговых инструментов в фармацевтической и дермато-косметической областях36,75,76,77,78. Хотя несколько компаний сделали такие RH коммерчески доступными, они остаются дорогостоящими и ограничивают возможность изменения параметров культивирования по мере необходимости для решения новых исследовательских вопросов. В данной работе описана процедура производства рудоизнервных руд на месте надежным и надежным способом и дана подробная характеристика полученных тканей для подтверждения актуальности модели в качестве альтернативного подхода к испытаниям на животных.
Некоторые из шагов в протоколе имеют решающее значение для обеспечения правильной дифференцировки кератиноцитов и воспроизводимости RhE. Это может быть выполнено путем использования оптимальных клеток, среднего типа (типов) и условий культивирования. В предложенной модели RhE неонатальные НЭК были выбраны из-за отсутствия антигенного воздействия по сравнению со взрослыми НЭК. Кроме того, кератиноциты были ограничены кавказской этнической принадлежностью, чтобы избежать межвидовой изменчивости. Первичные кератиноциты обычно используются из-за их способности дифференцировать и стратифицировать.79. Их можно получить коммерчески или путем самостоятельной изоляции от кожи взрослых особей.80. Культивирование клеточной линии (т.е. HaCaT) на поликарбонатной мембране показало, что она не дифференцировка и продемонстрировала нарушенную способность синтезировать липиды, необходимые для образования барьеров.81. Однако включение различных матриц культур, таких как гидрогели, коллаген, фибрин и сфероиды, привело к успешной разработке 3D-моделей кожи.78,82,83,84,85,86. Было показано, что увековеченные клеточные линии, N/TERT, подходят для развития RHEs.35. Первичные кератиноциты остаются пролиферативными при четвертом или пятом прохождении61, поэтому действующий протокол включает использование кератиноцитов в их третьем проходе. De Vuyst et al. продемонстрировали, что плотность посева клеток имеет важное значение и должна быть достаточной (т.е. ≥ 2,5x105 ячеек/см2) для обеспечения того, чтобы среда из базолатерального отсека не диффундирует в апикальный отсек. Недостаточная плотность посева (т.е. < 2.5x105 ячеек/см2) может привести к неспособности сформировать надлежащий барьер, о чем свидетельствует диффузия среды от базолатерального к апикальному отсеку, что приводит к затоплению вместо АЛИ условий культуры62. Безсывороточная среда роста кератиноцитов (см. Таблица материалов) был предпочтительным для целей воспроизводимости, поскольку он обеспечивает преимущество работы с химически определенной средой и снижает риск загрязнения. Эта среда имеет более низкую концентрацию кальция (т.е. 60 мкМ) и поэтому стимулирует пролиферацию кератиноцитов.87. Повышение концентрации кальция (т.е. 1,5 мМ) с первого этапа культивирования RHE способствует дифференцировке кератиноцитов и формированию кожного барьера и гомеостаза49. Кроме того, среда ALI дополняется аскорбиновой кислотой, которая, как было показано, имеет решающее значение для образования липидов SC и способствует дифференцировке.52,53,54. Среда ALI также содержит KGF, который является фактором роста, секретируемым фибробластами, которые могут связываться с трансмембранными рецепторами кератиноцитов и при активации играют двойную роль в дифференцировке и заживлению ран.55,88. Важно обновлять среду ALI через определенные промежутки времени, чтобы обеспечить постоянное поступление свежих питательных веществ к RHEs. Использование системы несущих пластин имеет решающее значение для выращивания RHE в более широком масштабе (т.е. 24 вставки/пластина). Это дает преимущество экономии времени, снижения риска загрязнения и оставляет меньше места для внедрения человеческих ошибок. Это также обеспечивает возможность культивировать RH в большом объеме среды (т.е. 1,5 мл), что уменьшает необходимое количество обновлений среды ALI. Кроме того, он предлагает возможность перенести полную пластину вставок на тарелку со свежим носителем, избегая контакта со вставками по отдельности или открывая крышку пластины.
Следует отметить несколько ограничений модели RhE. В нативной коже человека существует равновесие между пролиферовацией кератиноцитов в базальном слое и отслойкой корнеоцитов в СК (т.е. десквамация).89. Однако in vitro десквамация не происходит. Поэтому корнеоциты остаются прикрепленными к RHE и образуют толстый SC, который менее физиологически актуален. Следовательно, существует ограниченный промежуток времени культивирования RHEs. Более того, эта модель RhE проста и понятна, поскольку она состоит из единственного типа клеток, то есть кератиноцита, который является наиболее распространенным типом клеток эпидермиса. Однако существуют и другие типы клеток, обжитые в эпидермисе, такие как меланоциты, дендритные клетки (т.е. клетки Лангерганса), Т-клетки (например, CD8).+ клетки) и клетки Меркеля13. Чтобы повысить физиологическую значимость модели кожи, исследователи усложнили модели кожи, добавив меланоциты.38 , иммунные клетки39, или клетки, полученные от пациента90. Следует иметь в виду, что барьерные свойства моделей кожи человека отличаются по сравнению с нативной кожей человека, в частности, из-за другого липидного состава SC и более высокой барьерной проницаемости. 91,92,93,94,95. Тем не менее, в нескольких исследованиях сообщалось об изменениях барьерных свойств моделей кожи человека при культивировании в условиях гипоксии.96 или пониженная относительная влажность97, модуляция дермального матрикса хитозаном98, и изменение свободных жирных кислот в питательной среде99. Более того, как в простых, так и в более сложных RH условия культивирования и состав среды могут модулироваться для имитации патологических признаков. Оспаривая модель с помощью цитокинов, аномальная морфология100 и могут быть установлены изменения в уровнях экспрессии генов и белков, которые обычно наблюдаются при общих кожных заболеваниях, таких как атопический дерматит и псориаз35,101,102,103,104,105. Глушение специфических генов в кератиноцитах перед началом процесса восстановления 3D-модели является еще одним подходом, используемым для имитации особенностей кожных заболеваний и исследования новых терапевтических решений.106,107. Помимо моделирования только эпидермального слоя, дермальный компартмент может быть включен в модель (т.е. названный эквивалентами кожи человека или моделями полной толщины) путем встраивания фибробластов в коллагеновую матрицу до восстановления RhE, что делает его более физиологически значимым и подходящим для исследований, связанных со старением и заживлением ран.108,109,110. Кроме того, сфероиды опухолей были добавлены к эквивалентам кожи человека для изучения прогрессирования меланомы.111,112. Последними достижениями в области моделей кожи являются биопечать и кожа на чипе. В последнее время несколько исследовательских групп преуспели в разработке (перфузируемых) биопечатных эквивалентов кожи.45,113,114. Предлагаемый протокол использует преимущества 24-скважинного формата и несущей пластины, избегая вставок, которые должны обрабатываться индивидуально. Тем не менее, масштаб исследования по-прежнему довольно ограничен и не имеет автоматизации. Реализуя использование биопечати или «кожа на чипе», меньшие модели кожи могут использоваться с более автоматизированными процессами и в большем масштабе.
RhE, описанный в этом протоколе, имеет множество сходств с уже разработанными и хорошо охарактеризованными коммерческими эпидермальными моделями. Морфологический анализ показал, что, хотя количество жизнеспособных слоев в предлагаемой модели RhE ниже по сравнению с нативной кожей человека (т.е. 6-7 по сравнению с 7-14), оно сопоставимо с количеством жизнеспособных слоев модели RhE EpiDerm (т.е. 8-12)70. Подобно моделям EpiDerm, EpiSkin и SkinEthic, верхний слой RhE показывает паттерн плетения корзины из плотно упакованных слоев корнеоцитов28. Кроме того, анализ ТЕА показал, что количество слоев SC в предлагаемой модели RHE (т.е. 15-25) сопоставимо с количеством слоев EpiDerm (т.е. 16-25)70. В целом, предложенная модель RhE демонстрирует структуру, аналогичную структуре других коммерциализированных эпидермальных моделей, имитируя нативный эпидермис человека. Целостность ткани, измеренная TEER, находится в диапазоне с коммерческими моделями RHE (т.е. между 3000-5600 Ω.cm2)71,72,73 и другими штатными RHE (т.е. приблизительно 5000 Ω.cm2)74,115. Предложенная модель RHE хорошо дифференцирована, о чем свидетельствует наличие и правильная локализация маркеров дифференцировки и адгезии тканей. Кроме того, предлагаемая модель RhE реагирует на провоспалительные стимулы (т.е. LPS и TNF-α).
В заключение, текущий протокол показывает, как производить RH надежным образом и в относительно больших масштабах для удовлетворения потребностей исследователей как в академических, так и в частных учреждениях. Предложенная модель RhE имеет аналогичную морфологию, эпидермальную дифференцировку и биологическую реакцию на другие существующие коммерческие модели. Он предоставляет альтернативный инструмент как для фармацевтической, так и для дермато-косметической области, когда требуется доступ к соответствующей модели кожи.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Acetic acid</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >A6283</td>
			<td >Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibiotic-antimycotic (100x)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aqueous Eosin Y solution</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >HT110280</td>
			<td >Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td >Sigma Aldrich or Merck</td>
			<td>C8106 or 1.02378.0500</td>
			<td >Prepare a stock solution of 0.144 M, filter sterilize and store aliquots at -20 &#176;C.&#160; It is recommended to prepare new aliquots every 6 months.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>Prepare a stock at 100 &#956;g/mL and store aliquots at -20 &#176;C. Working conditon is 1 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Entellan mounting medium</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.07960.0500</td>
			<td>Mounting medium for H&#38;E staining.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EpiLife medium (referred to as keratinocyte growth medium)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>MEPI500CA</td>
			<td >Contains 0.06 mM of Ca2+.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol absolute</td>
			<td >Any supplier</td>
			<td >N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formalin 10%</td>
			<td >Leica Biosystems</td>
			<td >3800770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human keratinocytes growth supplement (HKGS) (100x)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>S0015</td>
			<td >To reach final concentrations of 0.2% [v/v] BPE, 0.2 ng/mL human recombinant EGF, 0.18 &#956;g/mL hydrocortisone,5 &#956;g/mL bovine transferrin, and 0.01 &#181;g/mL human recombinant insulin-like growth factor-I.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropanol</td>
			<td >Biosolve B.V.</td>
			<td >0016264102BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kaiser&#39;s glycerol gelatine, phenol-free</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.08635.0100</td>
			<td>Mounting medium for IF staining.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Keratinocyte growth factor (KGF)</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG-050</td>
			<td >Reconstitute KGF protein at 100 &#956;g/mL in sterile 0.1% [w/v] BSA in PBS. Prepare aliquots and store at -20&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lactate dehydrogenase (LDH) assay kit</td>
			<td >Roche</td>
			<td >4744926001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td >Prepare a stock solution of 25 mg/mL, filter sterilize and store aliquots at -20&#176;C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. Store in the dark.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lipopolysaccharide (LPS), E.coli strain O55:B5</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >L4524</td>
			<td >Prepare a stock of 1 mg/mL in sterile PBS and store aliquots at -20 &#176;C. Working concentration is 100 &#956;g/mL.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mayer&#8217;s Haematoxylin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >MHS80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs)</td>
			<td >Lonza</td>
			<td>00192906</td>
			<td >Human primary keratinocytes isolated from neonatal foreskin, pooled from at least three donors.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10010056 or 10010-015</td>
			<td >Reference numbers can vary between countries.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;)</td>
			<td >ImmunoTools</td>
			<td >11344483</td>
			<td>Prepare a stock of 100 &#956;g/mL in sterile ultrapure water. Working concentration is 40 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile ultrapure water</td>
			<td >Any supplier</td>
			<td >N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M5655</td>
			<td>Prepare a stock of 5 mg/mL MTT in sterile PBS. Working concentration is 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>93426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan blue (0.4% [v/v])</td>
			<td >Any supplier</td>
			<td >N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin inhibitor</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>R007100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA (0.05% [v/v])</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tween 20</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylene</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab150113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tri-sodium citrate dihydrate</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.06448.0500</td>
			<td>For antigen retrieval buffer for IF staining.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Dylight 488)</td>
			<td >Agrisera</td>
			<td>AS09 633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filaggrin Mouse antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP2-53243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Involucrin Rabbit antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP2-33742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Keratin 10 Mouse antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP2-32962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Desmoglein-1 Mouse antibody&#160;</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>MAB944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Loricrin Rabbit antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP1-33610</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivating a three-dimensional reconstructed human epidermis at a large scale

Представлена трехмерная модель эпидермиса человека, реконструированная из неонатальных первичных кератиноцитов. Здесь описан протокол процесса культивирования и характеристики модели. Неонатальные первичные кератиноциты выращивают погружаются на проницаемые поликарбонатные вставки и поднимаются на воздушно-жидкостную границе через три дня после посева. После четырнадцати дней стимуляции с определенными факторами роста и аскорбиновой кислотой в культуральной среде с высоким содержанием кальция модель полностью дифференцирована. Гистологический анализ выявил полностью стратифицированный эпидермис, имитирующий морфологию нативной кожи человека. Для характеристики модели и ее барьерных функций уровни белка и локализация, специфичные для дифференцировки кератиноцитов на ранней стадии (т.е. кератина 10), дифференцировки поздней стадии (т.е. инволукрина, лорикрина и филаггрина) и тканевой адгезии (т.е. десмоглеина 1), оценивали иммунофлуоресценцией. Целостность тканевого барьера дополнительно оценивали путем измерения трансэпителиального электрического сопротивления. R-эконструированный эпидермис человека реагировал на провоспалительные стимулы (т.е. липополисахарид и фактор некроза опухоли альфа), что приводило к увеличению высвобождения цитокинов (т.е. интерлейкина 1 альфа и интерлейкина 8). Этот протокол представляет собой простой и воспроизводимый метод in vitro для культивирования реконструированного эпидермиса человека в качестве инструмента для оценки воздействия на окружающую среду и широкого спектра исследований, связанных с кожей.

NHEKs, культивируемые в 2D, отображают традиционную морфологию с последовательной полигональной формой(рисунок 2A). Как описано выше, NHEK засевают в культурально-вставные после достижения слияния приблизительно 80%. Морфология RHes была проанализирована с использованием окрашивания H&E и TEM. Через 15 дней в ALI получается полностью стратифицированная ткань, о чем свидетельствуют ее четыре основных эпидермальных слоя: SB, SS, SG и SC(рисунок 2B). В слое SB ячейки имеют столбчатую форму. От второго слоя к верхним слоям RHE NHEK дифференцируются, как это наблюдается по изменениям в морфологии клеток (от столбчатой формы в слое SB к остистой форме в слое SS). В слое SG клетки имеют более уплощенные формы и отображают гранулы кератохиалина (KG), которые представлены в виде фиолетовых точек в цитоплазме. Их характерная круглая и звездная форма выделена белыми стрелками на изображении H&E(рисунок 2C). Клетки в SC, терминально дифференцированы и полностью сплющены и не имеют клеточного ядра. Стратифицированные RHEs имеют общую толщину 84,3 ± 2,4 мкм, а их SC имеет толщину 19,6 ± 3,2 мкм(рисунок 2D). Эти значения сопоставимы с теми, которые были зарегистрированы для нативной кожи человека, т.е. 60-120 мкм и 10-20 мкм соответственно69. Количество жизнеспособных слоев составляет 6-7, что ниже по сравнению с нативной кожей человека, составить примерно 7-1470. Ультраструктурный анализ RHEs в разные моменты времени в протоколе восстановления (т.е. через 7, 10, 13 и 15 дней) выявляет процесс ороговения RH с увеличением количества слоев корнеоцитов с течениемвремени (рисунок 2E). Через 15 дней в ALI SC ткани RhE состоит примерно из 15-25 слоев, что сопоставимо со значением, сообщенным для нативной кожи человека (т.е. 15-20 слоев)69.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig2v2.jpg"> Рисунок 2:Первичные кератиноциты и реконструированный эпидермис человека. (А) Фазово-контрастная микроскопия изображения первичных кератиноцитов перед посевом на вставки. Шкала бара составляет 50 мкм.(B-C)H&E яркое поле микроскопическое изображение RhE. Шкала бара составляет 50 мкм(B)и 25 мкм(C). (D)Количественная оценка толщины RhE и SC (средняя ± SEM, n=3). (E)Изображения просвечивающих электронных микроскопических сечений RhE через 7, 10, 13 и 15 дней в ALI. Шкала составляет 4 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig2v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
В соответствии со стадией дифференцировки, NHEKs, растущие в 3D, показывают различные профили экспрессии белка в соответствии с их стадией дифференцировки. Экспрессию белков, специфичных для дифференцировки кератиноцитов на ранней стадии (т.е. кератина 10), дифференцировки кератиноцитов поздней стадии (т.е. инволукрина, лорикрина и филаггрина) и адгезии кератиноцитов (т.е. десмоглеина 1) в RHEs определяли с помощью окрашивания ИФ. Экспрессия инволюкрина проявляется более преимущественно в слое SG, поскольку ее экспрессия инициируется раньше в процессе дифференцировки(рисунок 3D),тогда как филаггрин и лорикрин экспрессируются в верхних слоях(рисунок 3B-C). Экспрессия кератина 10 была обнаружена во всех жизнеспособных слоях, за исключением слоя SB(рисунок 3E). RHes отображают функциональные десмосомальные соединения, о чем свидетельствует экспрессия десмоглина 1 в межклеточном пространстве жизнеспособных эпидермальных слоев(фиг.3F). В заключение, все пять маркеров выражены и расположены в соответствующих эпидермальных слоях и переводятся в здоровый процесс эпидермальной дифференцировки.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig03.jpg"> Рисунок 3:Эпидермальная дифференцировка, тканевая адгезия и целостность тканей реконструированного эпидермиса человека. (A) H & E яркое поле микроскопическое изображение RhE. Конфокальные флуоресцентные микроскопические изображения(B)филаггрина (FLG),(C)лорикрина (LOR),(D)инволукрина (INV),(E)кератина 10 (K10) и (F) десмоглина 1 (DSG-1), представленного в пурпурном виде. Окрашивание ядер (DAPI) представлено синим цветом. Шкала составляет 25 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Барьерные свойства модели RhE исследовали путем оценки жизнеспособности и целостности тканей. Целостность ткани определяли через 15 дней путем измерения TEER с помощью вольтомметра. Значения 2567 ± 415Ω,см2, зарегистрированные для RH, переводят формирование непрерывногобарьера (рисунок 4A). Эти значения находятся в диапазоне с значениями, сообщенными для моделей RhE71,72,73,74. Кроме того, требуемое время воздействия цитотоксического эталонного химического вещества (т.е. тритона X-100) для снижения жизнеспособности ткани на 50% (ET50)определяли с помощью анализа на тиазолиловый синий тетразолий бромид (MTT). Значение ET50, измеренное для RhE, составило 2,1 часа. Это значение попадает в диапазон принятия других 3D-моделей эпидермия, которые подходят для надежного прогнозирования классификации раздражения (Руководящий принцип 439 ОЭСР)19.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig4v3.jpg"> Рисунок 4:Барьерные свойства реконструированного эпидермиса человека. (А) Целостность тканей, измеренная с помощью трансэпителиального электрического сопротивления (среднее ± SEM, n=6). (B)ET50, определяемый путем измерения жизнеспособности тканей (т.е. анализа MTT) при местном воздействии 78,3 мкл 1% Тритона X-100 (средняя ± SEM, n=3).
Реакция RHes исследовалась на известные провоспалительные раздражители. RhEs обрабатывали системно, т.е. добавление стимулов в среду базолатерального компартмента, используя 100 мкг/мл липополисахарида Escherichia coli (LPS) и 40 нг/мл фактора некроза опухоли альфа (TNF-α). После 24 часов стимуляции собирали клеточную культурную среду. Цитотоксичность измеряли с помощью анализа лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и сравнивали со значениями известного мембранного разрушителя, моющего средства Triton X-100(рисунок 5). Значительное увеличение (p < 0,05, односторонняя ANOVA, множественный сравнительный тест Даннетта) было показано в активности ЛДГ у RHEs, обработанных Triton X-100. Лечение ЛПС и α TNF показало, что они не цитотоксичны.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig5v3.jpg"> Рисунок 5:Цитотоксичность, измеренная с помощью анализа лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Данные представлены в виде относительных значений для контроля, необработанных тканей (CTRL); среднее ± SEM, n=9 (тритон X-100), n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). Значимость была проверена с помощью одностороннего ANOVA, множественного сравнительного теста Даннетта. Звездочкой обозначена статистически значимая разница по сравнению с CTRL, ****p < 0,0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig5v3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Высвобождение интерлейкина 1 альфа (IL-1α) и интерлейкина 8 (IL-8) в среде RhE количественно оценивали с использованием ИФА. На рисунке 6 показано как количественное, так и относительное высвобождение IL-1α и IL-8 RH при оспаривании с LPS и TNF-α. Лечение ЛПС привело к статистически значимому (p < 0,05, непарный Т-тест Стьюдента) индуцированного высвобождения IL-8 (увеличение в 9,6 ± 1,0 раза) и IL-1α (увеличение в 2,7 ± в 1,3 раза). TNF-α не индуцировало достоверно высвобождение IL-8, хотя наблюдалась тенденция повышения уровней IL-8 (2,3 ± увеличение в 0,8 раза). Тем не менее, TNF-α значительно (p < 0,05, непарный Т-тест Студента) вызвал высвобождение IL-1α (увеличение в 1,8 ± 0,5 раза).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig6v3.jpg"> Рисунок 6:Провоспалительные реакции в реконструированном эпидермисе человека. Концентрации высвобождения IL-8 RhE при 24-часовом испытании с LPS(A)и TNF-α (B). Данные представлены в виде среднего ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (C) Данные представлены в виде среднего относительного значения по сравнению с контрольными, необработанными тканями (CTRL) ± SEM, n = 8 (LPS), n = 3 (TNF-α). Концентрация высвобождения ИЛ-1α RhE при 24-часовом испытании с ЛПС(D)и ФНО-α(Е). Данные представлены в виде среднего ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (F) Данные представлены как среднее относительное значение по сравнению с CTRL ± SEM, n= 4 (LPS), n = 3 (TNF-α). Значимость была проверена непарным Т-тестом Студента. Звездочкой обозначены статистически значимые различия по сравнению с CTRL, *p < 0,05, ****p < 0,0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig6v3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale at JoVE.com

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

Этот протокол описывает простой метод культивирования трехмерного восстановленного эпидермиса человека воспроизводимым и надежным способом. Кроме того, он характеризует структурно-функциональную взаимосвязь модели эпидермального барьера. Также представлены биологические реакции восстановленного эпидермиса человека на провоспалительные раздражители.

Культивирование трехмерного реконструированного эпидермиса человека в больших масштабах

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Модель эпидермиса человека in vitro или сконструированная модель эпидермиса человека были впервые разработаны в девяностых годах с основной целью разработки альтернативных методов тестирования экспериментов на животных. Эти 3D-модели эпидермия в настоящее время широко используются для проверки безопасности и эффективности косметических ингредиентов. В то время как его можно приобрести у нескольких поставщиков тканей, возможность воссоздать 3D-модель в лаборатории дает большую гибкость в конечной точке интереса.Существует несколько исследовательских статей, кратко описывающих протокол восстановления 3D-эпидермальной модели, но на сегодняшний день не было доступных видео, показывающих критические этапы процесса восстановления. Это является причиной публикации этой видеобумаго. Приготовление реконструированного эпидермиса человека обеспечивает большую свободу в процессе культивирования, например, изменения в составе культуральной среды, провоспалительные или окислительные триггеры стресса, заглушение генов, представляющих интерес, а также ингибирование или стимуляция определенных биологических процессов.Для начала разморозьте флакон с 1 миллионом крио-сохраненных нормальных эпидермальных кератиноцитов человека, или NHEKs, на водяной бане при 37 градусах Цельсия, погрузив часть флакона в воду. Высиживайте флакон в течение одной-двух минут на водяной бане, пока не будет виден только небольшой кусочек льда. Повторно суспендировать клетки очень осторожно, пипетируя вверх и вниз два-три раза.Переложите клеточную суспензию в две колбы T75, содержащие в общей сложности 15 миллилитров предварительно предупрежденной оттаивающей среды, в результате чего плотность посева составит от 6,7 раз 10 до четвертой ячейки на сантиметр в квадрате. Предварительно заполните 24 луночника 1,5 миллилитрами погруженной среды, в идеале используя дозаторную пипетку. После культивирования клеток до 80% слияния они готовы к посеву во вставки для культивирования реконструированного эпидермиса человека, или RHEs.Удалите базальную среду из колб T75 с помощью NHEKs. Промыть клетки, добавив пять миллилитров предварительно нагретого PBS в каждую колбу T75, затем удалите PBS из колб. Добавьте два-три миллилитра предварительно подогретого 0,05% трипсина-ЭДТА в каждую колбу, убедившись, что раствор трипсина равномерно распределен по площади клеточной культуры колбы.Поместите колбы в инкубатор клеточной культуры на четыре минуты, затем проверьте, отсоеживаются ли клетки с помощью микроскопа при увеличении 10 X. Стук по колбе, чтобы помочь клеткам освободиться от поверхности колбы. Как только все клетки будут отделены, добавьте равный объем предварительно нагретого ингибитора трипсина в каждую колбу T75 и перенесите клеточную суспензию из колбы в трубку центрифуги.Промыть колбы пятью миллилитрами предварительно разогретого ПБС и перенести в центрифужную трубку, содержащую клеточную суспензию. Центрифугировать собранные клетки в 400 раз G в течение пяти минут. Осторожно выбросьте большую часть супернатанта, оставив примерно от 100 до 200 микролитров в трубке.Осторожно проведите пальцами по трубке, чтобы осторожно ослабить гранулу. Осторожно повторно суспендируйте гранулы клеток в небольшом объеме погруженной среды, пипетируя вверх и вниз от 5 до 10 раз, чтобы обеспечить однородную суспензию клеток. Начните с небольшого объема, чтобы избежать образования клеточных агрегатов, и добавьте до одного миллилитра погруженной среды на начальную колбу T75.Подсчитайте ячейки в суспензии с помощью метода исключения синего цвета trypan. Разбавляют клеточную суспензию дополнительной погруженной средой до достижения концентрации от 3,525 раз 10 до пятой ячейки на миллилитр, используя первое уравнение, приведенное в текстовой рукописи. Выполните второй подсчет клеток разбавленного раствора и используйте второе уравнение в текстовой рукописи для расчета объема клеточной суспензии, который будет засеян во вкладыш культуры.Повесьте 24 вставки для посева скважин в самое высокое положение несущей пластины и перенесите несущую пластину на 24 скважинные пластины, предварительно заполненные погруженной средой. Добавьте определенный объем клеточной суспензии к каждой вставке, заботясь о том, чтобы не коснуться вставки. После посева инкубируют 24 плиты колодца в течение 10-15 минут при комнатной температуре, чтобы преодолеть эффект края.Не перемещайте пластины в течение этого времени. Переложите пластинки в инкубатор клеточной культуры, и оставьте их в погруженном состоянии на три дня. После трехдневной инкубации в инкубаторе клеточной культуры подвергают клетки, которые прилипли к поверхности мембраны, интерфейсу воздушной жидкости, или ALI, путем удаления погруженной среды из апикальной камеры с помощью аспирационной системы и стеклянной пипетки Пастера.Заполните новые 24 скважинные пластины 1,5 миллилитрами свежей предварительно нагретой среды ALI и переложите несущую пластину с культурными вставками на новые многоствольные пластины. Перенесите многобойные пластины обратно в инкубатор клеточных культур. Обновляйте носитель ALI каждые два-три дня в течение 14 дней.Кератиноциты в 2D культуре демонстрируют традиционную морфологию с последовательной полигональной формой. Через 15 дней в ALI реконструированный эпидермис человека образует полностью стратифицированную ткань, на которую указывают его четыре основных эпидермальных слоя. Ультраструктурный анализ реконструированного эпидермиса человека в разные моменты времени в протоколе восстановления выявляет процесс рогового ороговения с увеличением количества слоев участка роговицы с течением времени.Кератиноциты в эпидермисе показывают различные профили экспрессии белка в зависимости от стадии их дифференцировки. Экспрессия инволюкрина проявляется преимущественно в слое SG, тогда как экспрессия филаггрина и лорикрина расположена в верхних слоях. Экспрессия кератина-10 была обнаружена во всех жизнеспособных слоях, за исключением слоя SB.Реконструированный эпидермис человека демонстрирует функциональные десмосомные соединения, о чем свидетельствует экспрессия Десмоглейна-1 в межклеточном пространстве жизнеспособных эпидермальных слоев. Барьерные свойства реконструированной модели эпидермиса были исследованы путем оценки жизнеспособности ткани при местном лечении известным разрушителем барьера и путем оценки целостности ткани. Целостность ткани определяли через 15 дней путем измерения TEER вольтметром.Исследована реакция эпидермиса на липополисахарид и фактор некроза опухоли альфа. Как ЛПС, так и альфа-обработка TNF были нетоксичными. относительно управления Triton X-100.Высвобождение интерлейкина-1 альфа и интерлейкина-8 в среде RHE количественно оценивали с помощью лизиса IL. Лечение ЛПС привело к статистически значимому увеличению регуляции высвобождения интерлейкина-1 альфа и интерлейкина-8. Альфа-лечение ФНО привело к статистически значимому увеличению регуляции только высвобождения интерлейкина-1 альфа.Однако явная тенденция повышения уровня интерлейкина-8 наблюдалась и при стимуляции ФНО альфа. Следуя этому протоколу, TEER может быть измерен как значение целостности барьера. Жизнеспособность или цитотоксичность могут быть измерены, например, с помощью анализа MTT или LDH.Супернатант может быть использован для измерения секреции цитокинов или других белков. Кроме того, ткань может быть использована для изучения экспрессии белков или генов, представляющих интерес.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Bioengineering

Unit 1

The Integumentary System

SCIENTISTS IN ACTION

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Альгинат гидрогелей для трехмерных органной культуры яичников и Яйцеводы

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Трехмерная реконструкция человеческой кожи Модель: инструмент для изучения нормальной кожи и меланомы Прогрессия

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Плоские и трехмерной печати проводящей краски

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Человека хрящевой ткани Изготовление с использованием трехмерных струйных технологии печати

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Анализ миграции клеток в трехмерном коллагеновой матрице

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Клонирование и крупномасштабное производство высокопроизводительного аденовирусные векторы на основе типа аденовируса человека 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

Трехмерная Биомиметический Технология: Роман Biorubber Создает Определено микро- и макроуровне архитектур в коллагене гидрогелей

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Получение и анализ<em&gt; In Vitro</em&gt; Трехмерное карциному груди Суррогаты

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Развитие многоклеточного трехмерной модели Органотипической слизистой оболочки пищеварительного тракта человека Выращенный в условиях микрогравитации

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Платформа Lab-on-a-CD для генерации многоклеточных трехмерных сфероидов

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...