Name: cultivating a three-dimensional reconstructed human epidermis at a large scale
Uploaded: 2021-05-28T13:30:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale at JoVE.com

Europeiska unionens program för forskning och innovation vid Horisonten 2020 inom ramen för Marie Skłodowska-Curie-bidraget med bidragsavtalet nr 765602 finansierade detta arbete. Alla författare erkänner stödet från Adolphe Merkle Foundation och Universitetet i Ferrara och erkänner tacksamt Dow Silicones Belgium. Dr. Miguel Spuch-Calvar är erkänd för att förbereda de grafiska bilderna av RhE-odlingsprocessen. Författarna tackar Dr. Barbara Drasler, Dr. Franco Cervellati och Dr. Agnès Tessier för deras tekniska stöd och diskussioner.

Granska och följa nationella och internationella etiska överväganden och villkor relaterade till användning av mänskliga vävnader eller celler innan du planerar och utför någon forskningsverksamhet som involverar detta protokoll. OBS: Alla steg i detta protokoll måste utföras under aseptiska förhållanden. Biosäkerhetsnivå 2-metoder är minimikravet för odling av rhes. Alla nödvändiga säkerhetsåtgärder skall vidtas vid hantering av de kemikalier/reagenser som beskrivs i detta protokoll.
1. Förberedelse av cellkulturmedier
OBS: Det finns tre olika typer av serumfria odlingsmedier som används för odling av rhes (tabell 1): i) det basala mediet med låg kalciumnivå (60 μM Ca2+) som används för 2D-kulturen i NHEKs; ii) Det nedsänkta mediet med hög kalciumhalt (1,5 mM Ca2+) som används för sådd av NHEKs i cellkulturinsättningssystemet. och iii) alimediet (Air-Liquid Interface) med hög kalciumhalt (1,5 mM Ca2+), askorbinsyra och keratinocyttillväxtfaktor (KGF).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Medium</td>
			<td>Medelhög information</td>
			<td>Erforderliga antal</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Basalt medium</td>
			<td>Keratinocyte tillväxtmedel</td>
			<td rowspan="3">36 ml/24 brunnar</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] HKGS</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] 100x antibiotikum-antimykotisk</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Nedsänkt medium</td>
			<td>Keratinocyte tillväxtmedel</td>
			<td rowspan="4">36 ml/24 brunnar</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] HKGS</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] 100x antibiotikum-antimykotisk</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1,5 mM Ca2+
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">Luft-flytande gränssnitt medium</td>
			<td>Keratinocyte tillväxtmedel</td>
			<td rowspan="6">216 ml/24 brunnar</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] HKGS</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1 % [v/v] 100x antibiotikum-antimykotisk</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 1,5 mM Ca2+
</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 50 μg/ml askorbinsyra</td>
		</tr>
<tr>
<td>+ 10 ng/mL keratinocyte tillväxtfaktor</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1. Sammanfattningstabell över de olika kulturmedier som används för att odla rhes. Lista över olika kulturmedier med kosttillskott.
<ol><li>Förbered det basala mediet.<ol>
<li>Komplettera flaskan med 500 ml keratinocyt tillväxtmedium (Materialförteckning) med 5 ml humant keratinocyt tillväxttillskott (HKGS) för att nå slutliga koncentrationer på 0,2% [v/v] nötkreatur Hypofysextrakt (BPE), 0,2 ng/ml human rekombinant epidermal tillväxtfaktor (EGF), 0,18 μg/mL hydrokortison, 5 μg/mL bovint transferrin, och 0,01 μg/ml rekombinant humaninsulinliknande tillväxtfaktor-I (IGF-I).</li>
		<li>Tillsätt 5 ml 100x antimykotisk antimykotisk lösning som innehåller 10 000 enheter/ml penicillin, 10 000 μg/ml streptomycin och 25 μg/ml amphotericin B.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbered det nedsänkta mediet.<ol>
<li>Komplettera flaskan med 500 ml keratinocyttillväxtmedium (Materialförteckning) med 5 ml HKGS för att nå slutliga koncentrationer på 0,2% [v/v] BPE, 0,2 ng/ml humant rekombinant EGF, 0,18 μg/ml hydrokortison, 5 μg/ml bovint transferrin och 0,01 μg/ml humant rekombinant IGF-I.</li>
		<li>Tillsätt 5 ml 100x antimykotisk antimykotisk lösning.</li>
		<li>Tillsätt 5 ml av en 0,144 M CaCl2 (kalciumklorid) stamlösning för att nå en slutlig koncentration på 1,5 mM Ca2+. OBS: Kalciumkoncentrationen har redan ökat under den nedsänkta fasen för att stimulera differentiering av keratinocyterna och initiera stratifieringsprocessen49.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbered ali-mediet (air-liquid interface).<ol>
<li>Komplettera en flaska med 500 ml keratinocyttillväxtmedium (Materialförteckning) med 5 ml HKGS för att nå slutliga koncentrationer på 0,2% [v/v] BPE, 0,2 ng/ml humant rekombinant EGF, 0,18 μg/ml hydrokortison, 5 μg/ml bovint transferrin och 0,01 μg/ml humant rekombinant IGF-I.</li>
		<li>Tillsätt 5 ml 100x antimykotisk antimykotisk lösning.</li>
		<li>Tillsätt 5 ml av en 0,144 M CaCl2 lagerlösning för att nå en slutlig koncentration på 1,5 mM Ca2+.</li>
		<li>Tillsätt 1 ml askorbinsyralagerlösning på 25 mg/ml för att uppnå en slutlig koncentration på 50 μg/ml askorbinsyra.</li>
		<li>Tillsätt 50 μL av en KGF på 100 μg/ml i 1 % [w/v] bovint serumalbumin i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att uppnå en slutlig koncentration på 10 ng/mL KGF. OBS: Eftersom askorbinsyra är känslig för oxidation rekommenderas att använda ett stabilt askorbinsyraderivat, såsom magnesium l-ascorbyl-2-fosfat59 eller L-askorbinsyra 2-fosfat sesquimagnesium60. Om askorbinsyra används rekommenderas att alimediet kompletteras med askorbinsyra före varje uppdatering.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Kultur av NHEKs
OBS: Eftersom primära mänskliga keratinocyter förblir proliferativa vid sin fjärde eller femte passage61, används NHEKs i sin tredje passage för odling av rhes. Primära keratinocyter bör hanteras mycket noggrant på grund av deras höga känslighet. Noggrann och långsam pipetting av cellupphängningar när som helst är mycket viktigt, för att inte störa cellernas tillstånd.
<ol><li>Tina en flaska med 1 x 106 kryopreserverade NHEKs i ett vattenbad vid 37 °C genom att dränka en del av injektionsflaskan i vattnet. Inkubera injektionsflaskan i 1-2 minuter i vattenbadet tills endast en liten isbit är synlig. VARNING: Sänk inte ner hela injektionsflaskan i vattenbadet för att undvika kontaminering. Tina inte cellerna längre än 2 minuter. detta kan minska cellens livskraft. Torka flaskan med en 70% etanollösning innan du överför röret till laminarhuven.</li>
	<li>Återanvänd cellerna mycket försiktigt genom att pipetta upp och ner 2-3 gånger. Överför cellupphängningen till två T75-flaskor som innehåller totalt 15 ml förvärmt upptiningsmedium, vilket resulterar i en såddtäthet på 6,7 x 104 celler/cm2. OBS: För de två första passagerna och upptining av kryopreserverade NHEKs används cellkulturmedium enligt leverantörens rekommendationer.</li>
	<li>Placera kolvarna i cellkulturinkubatorn (37 °C, 5 % CO2och 95 % relativ fuktighet (RH)).</li>
	<li>Efter cirka 24 timmar, byt ut upptiningsmediet mot det basala mediet för att avlägsna dimetylsulfoxid (DMSO) från keratinocytefrysningslösningen.</li>
	<li>Uppdatera det basala mediet varannan dag.</li>
	<li>Efter 4-6 dagars odling bör cellerna vara cirka 80% konfluenta och redo för sådd i insatser för odling av rhes. OBS: Keratinocyter bör odlas till maximalt 80% sammanflöde för att bevara deras proliferativakapacitet 62. Antalet celler som ska tinas måste ta hänsyn till flera parametrar, såsom cellpassagenumret, cellens livskraft vid upptining, såddeffektiviteten samt fördubblingstiden.</li>
</ol>3. Sådd av NHEKs
OBS: Detta protokoll är utformat för användning i ett 24-brunns bärarplattaformat. Om andra plåtformat krävs (t.ex. 12- eller 6-brunnsformat) bör optimeringar i såddtäthet och medelvolym övervägas. Figur 1 sammanfattar en föreslagen tidslinje för RhE-odling och visar odlingsförhållandena.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig1v4.jpg"> Figur 1: Schematisk tidslinje för rekonstitutionsprotokollet. Presentation av RhE-modellens beredning, odlingsprocess och applicering (exponering för kemisk substans). Schemat innehåller lämpliga cellkulturmedietyper för varje steg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig1v4large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<ol><li>Förfyll 24-brunnsplattor med 1,5 ml nedsänkt medium, helst med en dispenserpipett.</li>
	<li>Ta bort basalmediet från T75-flaskorna som används för NHEKs kultur.</li>
	<li>Skölj cellerna genom att tillsätta 5 ml förvärmd PBS till varje T75-kolv.</li>
	<li>Ta bort PBS från kolvarna. OBS: Detta steg är avgörande, eftersom mediet innehåller proteiner och kalcium som kommer att hämma trypsinaktiviteten.</li>
	<li>Tillsätt 2-3 ml förvärmd 0,05% [v/v] trypsin/etylendikamintetra ättiksyra (EDTA) till varje T75-kolv. Se till att trypsinlösningen är jämnt fördelad på kolvens cellkulturområde. VARNING: Volymen på 2 ml baseras på den 80% sammanflöde som nämns ovan. Använd 3 ml för flaskor med högre sammanflöde.</li>
	<li>Placera kolvarna i 4 minuter i cellkulturinkubatorn (37 °C, 5 % CO2och 95 % RH). Kontrollera om cellerna lossar med mikroskopet vid en förstoring på 10x. Rap kolven mot handflatan för att hjälpa cellerna att frigöra sig från kolvens yta. Fristående celler kan observeras som rundade celler som flyter i trypsinlösningen. VARNING: Inkubera inte cellerna i trypsin längre än 6 minuter. Överb trypsinisering kan skada cellerna och minska deras vidhäftning63.</li>
	<li>När alla celler har lossnat, tillsätt en lika stor volym (dvs. 2-3 ml) förvärmd trypsinhämmare till varje T75-kolv.</li>
	<li>Överför cellfjädringen från kolvarna till ett centrifugrör.</li>
	<li>Skölj kolvarna med 5 ml förvärmt PBS och överför dem till centrifugröret som innehåller cellfjädringen. OBS: Se till att de flesta cellerna samlas in genom att kontrollera antalet restceller i kolvarna under mikroskopet. Kolvens yta ska vara 95% tom. Om så inte är fallet är det möjligt att upprepa trypsiniseringssteget (3.3-3.9). Observera dock att återförsök bör undvikas.</li>
	<li>Centrifugera de skördade cellerna vid 400 x g i 5 min.</li>
	<li>Kassera försiktigt det mesta av supernatanten och lämna cirka 100-200 μL i röret. VARNING: Aspirera inte pelleten under denna procedur. </li>
	<li>Återanvänd försiktigt cellpellet i en låg volym nedsänkt medium, pipett upp och ner 5-10 gånger för att säkerställa en enhetlig cellupphängning. Börja med en låg volym (dvs. 500 μL) för att undvika bildandet av cellaggregat och tillsätt upp till 1 ml nedsänkt medium totalt per första T75-kolv. OBS: Snärta försiktigt röret med fingrarna för att försiktigt lösa upp en del av cellpelleten i supernaten.</li>
	<li>Räkna cellerna i suspensionen med trypan blue exclusion-metoden.<ol>
<li>Späd 0,4% [v/v] trypan blå fläck och cellensuspension i ett 1:1-förhållande, genom att lägga till 10 μL 0,4% [v/v] trypanblå fläck till 10 μL cellfjädring. Lägg till 10 μL av lösningen i en räknebild. Mät cellantalet omedelbart efter att cellfjädringen har blandats med trypanblått, eftersom trypanblått börjar minska cellens livskraft efter exponering längre än 1 min65. VARNING: Trypan blå visade sig vara en potentiell mutagen, cancerframkallande och teratogen64. Hantera färgämnet med försiktighet och kassera avfallet på ett säkert sätt enligt lokala laboratoriebestämmelser. OBS: Ett alternativt tillvägagångssätt för användning av trypanblått är det icke-farliga färgämnet Erythrosin B66.</li>
	</ol></li>
	<li>Späd cellfjädringen med ytterligare nedsänkt medium för att nå en koncentration på 3,525 x 105 celler/ml i nedsänkt medium genom att tillsätta volymen V2 enligt ekvation 1: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61802/61802eq01.jpg"> C1 = räknad cellkoncentration i cellsuspensionen som erhålls i 3.12 (celler/ml) V1 = volym som används för att återanvända cellpellet i 3,12 (ml) C2 = riktad cellkoncentration i suspensionen (dvs. 3,525 x 105 celler/ml) V2 = volym som ska tillsättas för att nå den riktade cellkoncentrationen (mL) OBS: Ytan på den rekommenderade odlingsinsatsen är 0,47 cm2; Därför är motsvarande såddtäthet 3,75 x 105 celler/cm2.</li>
	<li>Utför ett andra cellantal (C3)av den utspädda lösningen som erhålls i steg 3.14. Använd ekvation 2 för att beräkna cellfjädringsvolymen (V4)som ska sås in i odlingsinsatsen: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61802/61902eq02.jpg"> C3 = riktad cellkoncentration i suspensionen (dvs. 3,525 x 105 celler/ml) V3 = riktad volym på cellfjädringen som ska sås i odlingsinsatsen (dvs. 0,5 ml) C4 = räknad cellkoncentration i den utspädda suspensionen som erhålls i 3.14 (celler/ml) V4 = cellfjädringens faktiska volym som ska sås i odlingsinsatsen (ml)</li>
	<li>Häng de 24 cellkulturinsatserna i det högsta läget på den rekommenderade bärarplattan och överför bärarplattan till 24-brunnsplattan förfylld med nedsänkt medium (se 3.1). VARNING: När bärarplattan överförs till multibrunnsplattan, se till att inga luftbubblor fastnar mellan insatsmembranet och det nedsänkta mediet från basalfacket, eftersom detta kommer att påverka cellernas utfodring och i slutändan äventyra RhE-livskraften och morfologin.</li>
	<li>Lägg till den bestämda volymen V4 (från ekvation 2) av cellfjädringen till varje skär. OBS: Vi rekommenderar att du använder den omvända pipetting-tekniken för att noggrant dela ut cellfjädringen till odlingsinsatserna. VARNING: Se till att inte skada membranet när cellens fjädring doseras i odlingsinsatsen. En försiktighetsåtgärd är att dispensera cellupphängningen längs skärsystemets vägg utan att vidröra membranets yta.</li>
	<li>Efter sådd, inkubera 24-brunnsplattorna i 10-15 min vid rumstemperatur, för att övervinna en kanteffekt (dvs. icke-enhetlig temperaturfördelning mellan alla brunnar67). Flytta inte plattorna under denna tid.</li>
	<li>Överför plattorna till cellkulturinkubatorn (37 °C, 5 % CO2och 95 % RH). Cellerna underhålls under nedsänkta förhållanden i tre dagar. OBS: För att undvika vävnadsvariation, stapla inte plattorna i inkubatorn efter sådd för att se till att varje skär får samma mängd värme. Efter tre dagar (dvs. under ALI-odling) är stapling av tallrikar möjlig.</li>
</ol>4. Odling vid luft-flytande gränssnitt
<ol><li>Efter en tre dagars inkubation i cellkulturinkubatorn (37 °C, 5% CO2och 95% RH), exponera cellerna som har klibbat vid membranytan till ALI genom att ta bort det nedsänkta mediet från det apatiska facket helst med hjälp av ett aspirationssystem och en glas Pasteurpipett. OBS: Alternativt kan det nedsänkta mediet från det apatiska facket avlägsnas med en manuell mikropipett.</li>
	<li>Fyll nya 24-brunnsplattor med 1,5 ml färskt förvärmt ALI-medium och överför bärarplattorna med kulturinsatserna till de nya multibrunnsplattorna.</li>
	<li>Överför multi-well plattorna tillbaka till cellkulturinkubatorn (37 °C, 5% CO2och 95% RH).</li>
	<li>Uppdatera ALI-mediet var 2-3: e dag i 14 dagar.</li>
	<li>Utför uppdateringen i två steg: 1) förbered en ny platta som innehåller 1,5 ml/brunn färskt förvärmt ALI-medium och 2) överför bärarplattan till den nya plattan. VARNING: Under hela beredningsförfarandet är det bäst att inte ta bort locket som täcker bärarplattan för att skydda rhesna från potentiell kontaminering. OBS: ALI-steget är avgörande för utvecklingen av en stratifierad epidermal modell eftersom det möjliggör terminal differentiering av keratinocyterna68. Efter att ha gått till ALI krävs en visuell kontroll av skären för att kontrollera om det finns "läckande vävnader": medelstora droppar på vävnadsytan som kommer från det basolaterala utrymmet. Om läckaget inträffar vid ALI dag 3, ta försiktigt bort mediet från odlingsinsatsen utan att röra vid vävnadens yta. Om läckaget kvarstår rekommenderas att läckande vävnader kasseras eftersom det är en indikation på att det inte finns någon korrekt barriärbildning i RhE-modellen.</li>
	<li>I slutet av rekonstitutionsprocessen kan vävnaderna utsättas för olika stressfaktorer för att inducera till exempel oxidativ stress eller inflammation. Parallellt kan de behandlas med kemiska föreningar eller kosmetiska ingredienser. OBS: Under exponeringen/behandlingen hålls vävnader vanligtvis i nedsänkt medium från och med ALI D14. När vävnader förväntas exponeras/behandlas under en längre tid (dvs. 48-72 timmar) rekommenderas i) att inleda exponeringen/behandlingen tidigare i ALI-odlingsprocessen, såsom D7-D9, för att undvika gallring av de livskraftiga skikten och förtjockningen av SC, och ii) att inkubera vävnaderna i ALI-medium för att fortsätta stimulera cellproliferation.</li>
	<li>För RhE-skörd, samla vävnader och cellkulturmedium vid den tidpunkt då det är av intresse för histologisk analys, livsduglighetsanalyser, protein/RNA-extraktion och enzymkopplade immunosorbenta analyser (ELISA).</li>
</ol>

Marc Eeman och Benedetta Petracca är anställda i Dow Silicones Belgium. Alla andra författare har inget att avslöja.

RhEs används ofta som screeningverktyg inom de farmaceutiska och dermato-kosmetiskafälten 36,75,76,77,78. Även om flera företag har gjort sådana rhes kommersiellt tillgängliga, förblir de kostsamma och begränsar möjligheten att variera odlingsparametrarna efter behov för att ta itu med nya forskningsfrågor. Detta dokument beskriver produktionsförfarandet för interna rhes på ett robust och tillförlitligt sätt och ger en detaljerad karakterisering av de erhållna vävnaderna för att bekräfta modellens relevans som ett alternativt tillvägagångssätt för djurförsök.
Några av stegen i protokollet är avgörande för att säkerställa korrekt keratinocyte differentiering och RhE reproducerbarhet. Detta kan utföras genom att använda optimala celler, medelstora typer och odlingsförhållanden. I den föreslagna RhE-modellen valdes neonatal NHEKs för deras brist på antigen exponering, jämfört med vuxna NHEKs. Keratinocyter begränsades dessutom till kaukasisk etnicitet för att undvika variation mellan arter. Primära keratinocyter används vanligtvis för deras förmåga att differentiera och stratifiera79. De kan erhållas kommersiellt eller genom in-house isolering från vuxen hud80. Odlingen av en cellinje (dvs. HaCaT) på ett polykarbonatmembran har visat sig misslyckas med differentiering och visat en nedsatt förmåga att syntetisera lipider som är nödvändiga för barriärbildning81. Införandet av olika kulturmatriser, såsom hydrogeler, kollagen, fibrin och sfäroidkulturer, resulterade dock i en framgångsrik utveckling av 3D-hudmodeller78,82,83,84,85,86. De odödliga cellinjerna, N/TERT, har visat sig vara lämpliga för utveckling av rhes35. Primära keratinocyter förblir proliferativa vid sin fjärde eller femte passage61, omfattar det nuvarande protokollet användningen av keratinocyter i sin tredje passage. De Vuyst m.fl. har visat att cellens såddtäthet är av betydelse och måste vara tillräcklig (dvs. ≥ 2,5x105 celler/cm2) för att säkerställa att mediet från det basolaterala utrymmet inte sprids till det apatiska utrymmet. Otillräcklig såddtäthet (dvs. < 2.5x105 celler/cm2) kan leda till oförmåga att bilda en korrekt barriär, vilket indikeras av diffusion av medium från det basolaterala till det apatiska utrymmet, vilket resulterar i nedsänkta istället för ALI-odlingsförhållanden62. Serumfritt keratinocyttillväxtmedium (se Tabell över material) föredrogs för reproducerbarhetsändamål, eftersom det erbjuder fördelen att arbeta med ett kemiskt definierat medium och minskar risken för kontaminering. Detta medium har en lägre kalciumkoncentration (dvs. 60 μM) och stimulerar därför spridningen av keratinocyter87. Att öka kalciumkoncentrationen (dvs. 1,5 mM) från rhe-odlingens första steg gynnar keratinocyt differentiering och hudbarriärbildning och homeostas49. Dessutom kompletteras ALI-mediet med askorbinsyra, vilket har visat sig vara avgörande för bildandet av SC-lipider och för att främja differentiering52,53,54. ALI-mediet innehåller också KGF, som är en tillväxtfaktor som utsöndras av fibroblaster som kan binda till keratinocyttransmembranreceptorer och vid aktivering har en dubbel roll i differentiering och sårreparation55,88. Det är viktigt att uppdatera ALI-mediet med specifika tidsintervall för att ge en konstant tillförsel av färska näringsämnen till rhes. Användningen av ett bärplåtssystem är avgörande för RhE-odling i större skala (dvs. 24 skär/platta). Det erbjuder fördelen med att spara tid, minska risken för kontaminering och lämnar mindre utrymme för införandet av mänskliga fel. Det ger också möjlighet att odla rhes i en hög volym media (dvs. 1,5 ml), vilket minskar det önskade antalet ALI-medium-uppdateringar. Dessutom ger det möjlighet att överföra en full platta med skär till en tallrik med färskt medium, undvika kontakt med skären individuellt eller avslöja plåtlocket.
Det finns flera begränsningar i RhE-modellen som bör noteras. I inhemsk mänsklig hud finns en jämvikt mellan spridningen av keratinocyter i basalskiktet och lossningen av hornhinnor i SC (dvs. desquamation)89. In vitro sker dock inte desquamation. Därför förblir hornhinnorna fästa vid RhE och bildar en tjock SC som är mindre fysiologiskt relevant. Därför finns det en begränsad odlingstid av rhes. Dessutom är denna RhE-modell enkel och enkel, eftersom den består av en singular celltyp, det vill säga keratinocyten, som är den mest rikliga celltypen av epidermis. Det finns dock andra celltyper bosatta i epidermis, såsom melanocyter, dendritiska celler (dvs. Langerhansceller), T-celler (t.ex. CD8+ celler) och Merkel-celler13. För att öka hudmodellens fysiologiska relevans har forskare gjort hudmodeller mer komplexa genom att tillsätta melanocyter38 , immunceller39, eller patientbaserade celler90. Man bör komma ihåg att barriäregenskaperna hos mänskliga hudmodeller är olika jämfört med inhemsk mänsklig hud, på grund av särskilt en annan SC lipidkomposition och en högre barriärpermeabilitet 91,92,93,94,95. Flera studier har dock rapporterat förändringar i barriäregenskaper hos mänskliga hudmodeller genom odling under hypoxi96 eller minskad relativ luftfuktighet97, modulering av dermalmatrisen med chitosan98, och förändring av de fria fettsyrorna i odlingsmediet99. Dessutom, i både enkla och mer komplexa rhes, kan kulturförhållandena och medium sammansättning moduleras för att efterlikna patologiska egenskaper. Genom att utmana modellen med cytokiner, en onormal morfologi100 och förändringar i gen- och proteinuttrycksnivåer kan fastställas som vanligtvis observeras vid vanliga hudsjukdomar, såsom atopisk dermatit och psoriasis35,101,102,103,104,105. Att tysta specifika gener i keratinocyter innan 3D-modellens rekonstitutionsprocess påbörjas är ett annat tillvägagångssätt som används för att efterlikna funktioner i hudsjukdomar och undersöka nya terapeutiska lösningar106,107. Förutom modellering av ett epidermalt skikt kan ett dermala fack inkluderas i modellen (dvs. namngivna motsvarigheter till mänsklig hud eller modeller med full tjocklek) genom att bädda in fibroblaster i en kollagenmatris före RhE-beredning, vilket gör det mer fysiologiskt relevant och lämpligt för åldrande och sårläkningsrelaterade studier108,109,110. Dessutom har tumörsfäroider tillsatts humana hudekvivalenter för att studera melanomprogression111,112. De senaste framstegen inom hudmodeller är biotryck och skin-on-a-chip. Flera forskargrupper har nyligen lyckats utveckla (perfusable) biotryckta hudekvivalenter45,113,114. Det föreslagna protokollet utnyttjar ett 24-brunnsformat och en bärplåt, vilket undviker att skär hanteras individuellt. Studieskalan är dock fortfarande ganska begränsad och saknar automatisering. Genom att implementera användningen av biotryck eller hud-på-ett-chip kan mindre hudmodeller användas med mer automatiserade processer och i större skala.
RhE som beskrivs i detta protokoll har flera likheter med de redan utvecklade och väl karakteriserade kommersiella epidermala modellerna. Den morfologiska analysen har visat att även om antalet livskraftiga skikt i den föreslagna RhE-modellen är lägre jämfört med den inhemska mänskliga huden (dvs. 6-7 jämfört med 7-14), är den jämförbar med EpiDerm RhE-modellen (dvs. 8-12)70. På samma sätt som EpiDerm-, EpiSkin- och SkinEthic-modellerna visar det övre RhE-skiktet ett korgvävt mönster av tätt packade corneocytelager28. Dessutom visade TEM-analysen att antalet SC-skikt i den föreslagna RhE-modellen (dvs. 15–25) är jämförbart med Antalet skikt i EpiDerm (dvs. 16–25)70. Sammantaget visar den föreslagna RhE-modellen en liknande struktur som andra kommersialiserade epidermala modeller, som efterliknar den inhemska mänskliga epidermis. Vävnadsintegriteten mätt med TEER ligger inom räckhåll för kommersiella RhE-modeller (dvs. mellan 3000-5600 Ω,cm2)71,72,73 och andra interna rhes (dvs. cirka 5000 Ω,cm2)74,115. Den föreslagna RhE-modellen visar sig vara väl differentierad, vilket indikeras av närvaron och korrekt lokalisering av differentiering och vävnad vidhäftning markörer. Dessutom visar sig den föreslagna RhE-modellen vara lyhörd för proinflammatoriska stimuli (dvs. LPS och TNF-α).
Avslutningsvis visar det nuvarande protokollet hur man producerar rhes på ett tillförlitligt sätt och i relativt stor skala för att tillgodose forskarnas behov i både akademiska och privata institutioner. Den föreslagna RhE-modellen visar sig ha liknande morfologi, epidermal differentiering och biologisk lyhördhet för andra befintliga kommersiella modeller. Det ger ett alternativt verktyg för både det farmaceutiska och dermato-kosmetiska området när tillgång till en relevant hudmodell krävs.

Epidermis är det yttersta lagret av huden, vid det direkta gränssnittet mellan människokroppen och den yttre miljön. Dess huvudfunktioner är att ge skydd och hydrering1. Epidermis fungerar som en effektiv fysisk barriär mot yttre medel och förhindrar överdriven vattenförlust från kroppen. Dessa hudfunktioner beror främst på det cellulära arrangemanget i de yttersta lagren av huden, kompositionen och organisationen av intercellulära lipider2. Epidermis består främst av keratinocyter som migrerar uppåt till utsidan av vävnaden och genomgår differentiering. Det finns 4-5 epidermala lager som kännetecknas av deras differentieringsstadium. Från insidan till utsidan börjar epidermalla skikten från den livskraftiga epidermis, dvs stratumbasale (SB), stratum spinosum (SS) och stratum granulosum (SG), till det icke-livskraftiga översta skiktet, dvs stratum corneum (SC)3. Det basala skiktet består huvudsakligen av prolifererande keratinberikade keratinocyter, som migrerar genom SS vid differentiering4. Under keratinocyte mognad uppstår olika förändringar i proteinuttryck och struktur. Keratinocyter klibbar sig genom bildandet av desmosomala korsningar5. I SG initieras genereringen av lamellära kroppar. De består av lipidprekursorer och enzymer som är avgörande för bildandet av hudbarriärfunktionen6. SG kännetecknas också av närvaron av keratohyalingranulat i keratinocyternas cytoplasma. Vid gränssnittet med SC extruderas innehållet i de lamellära kropparna i de intercellulära utrymmena och de icke-polära lipiderna som ceramider, kolesterol och fria fettsyror organiserar sig i staplade lamellära lipid bilayers för att bilda den extracelluläralipidmatrisen 7. I SC förlorar cellerna alla cellulära organeller inklusive kärnan, på grund av enzymatiska nedbrytningsprocesser och antar en tillplattad morfologi. De är omgivna av ett cornified kuvert av korslänkade proteinskikt, och kallas corneocytes8,9. Desmosomal komponenter är korslänkade till cornified kuvertet för att bilda corneodesmosomes och binda hornhinnansocyter tillsammans. Det resulterande epitel förnyas kontinuerligt från stamceller, med en omsättningstid på cirka 5-6 veckor10. Differentieringsprocessen för keratinocyterna, som resulterar i en helt stratifierad epidermis, är avgörande för bildandet av hudens barriärfunktion11.
Under sårning och inflammation inducerar keratinocyter förändringar i vidhäftningsmolekyler och ytreceptorer och utlöser proinflammatoriska svar via utsöndring av cytokiner, kemokiner och antimikrobiella peptider12. Huden är inte bara en fysisk barriär mot exogena ämnen; Det fungerar också som en immunsensor vid exponering för patogener. Dessutom reglerar det diffusionen av flera ämnen över sina lager, såsom vatteninnehåll för att skydda människokroppen från uttorkning. Huden är också involverad i syntesen av D-vitamin och har olika andra metaboliska funktioner3,13,14.
För att bedöma de negativa effekterna av exogena ämnen har toxikologer i årtionden förlitat sig på djurförsök, men idag är det inte det föredragna tillvägagångssättet. Förutom att ha begränsad prediktiv kapacitet för mänsklig toxicitet, involverar djurmodeller många etiska frågor. Förbudet mot djurförsök inom kosmetikaindustrin och rekommendationen att följa 3R-principen (dvs. ersättning, minskning och förfining) inom forskningen har lett till utveckling av alternativa testmetoder baserade på in vitro-metoder15. De första in vitro hudcellsmodellerna har redan beskrivits på 90-talet, och en imponerande utveckling från enkla mänskliga keratinocyte monokulturer till helt differentierade epidermis och fulltjockleksmodeller har uppnåtts16. Numera har hudvävnadsteknik fått betydelse inom både läkemedels- och dermato-kosmetiska områden. Under de senaste två decennierna har flera företag kommersialiserat tredimensionella (3D) rekonstruerade mänskliga epidermis (RhE) som representerar standardiserade och reproducerbara verktyg för hudrelaterade studier. Flera kommersiella RhE-modeller godtas för in vitro-hudtestning av kemikalier i enlighet med OECD:s riktlinjer för testning av hudirritation17,18 (dvs. testriktlinje 43919) och hudkorrosion20 (dvs. testriktlinje 43121). In vitro-testet för hudsensibilisering22 (dvs. SENS-IS-analys) är för närvarande i godkännandespåret och under peer-review23. Det finns också många andra analyser utvecklade som använder kommersiella RhE-modeller, för att utvärdera fototoxicitet24, för att testa läkemedelsformuleringar25, kosmetiska formuleringar ochaktiva ingredienser 26, för att studera hudbarriärfunktionen27 och för att testa det biologiska svaret på miljöstressorer28,29,30,31.
Förutom kommersiellt tillgängliga 3D-hudmodeller har flera forskargrupper utvecklat sina egna RhEs32,33,34,35,36,37. Interna rhes erbjuder fördelen för att kontrollera kulturförhållandena enligt syftet med studien. Specifikt kan forskare välja typ och källa till de keratinocyter som ska användas för rekonstitution av deras 3D epidermala modell (dvs. primär kontra odödlig, neonatal kontra åldrad, singel vs. poolade slumpmässiga givare, kön, etnicitet, individuella levnadsvanor som rökning, etc.). De har möjlighet att variera sammansättningen av odlingsmediet och införliva tillväxtfaktorer, vitaminer eller andra föreningar som kan modulera uttrycket av målproteiner eller lipider. Med interna rhes kan forskare också undersöka biologiska svar och biomekaniska egenskaper som en funktion av differentieringstillståndet för 3D-modellen. Förutom dessa intuitiva parametrar finns det kontinuerliga ansträngningar för att öka komplexiteten hos 3D-hudmodeller och göra dem mer fysiologiskt relevanta, till exempel genom att lägga till andra epidermala celltyper (t.ex. melanocyter och immunceller)38,39, genom att odla keratinocyterna ovanpå en fibroblastbefolkad kollagenmatris40,41,42, och genom att inkludera komponenter i kärlnätverket43,44,45.
Även om det är möjligt att anpassa kulturvillkoren efter specifika behov finns det parametrar som måste respekteras för att garantera både kvaliteten och relevansen av en RhE. För att odla RhE-vävnader sås normala humana epidermala keratinocyter (NHEKs) i specifika genomsläppliga odlingsinsatser vars porösa syntetiska membran separerar brunnarna i två fack, dvs. det apatiska och basolaterala facket. Membranets porositet (dvs. en porstorlek på 0,4 μm) är sådan att det gör det möjligt att bilda ett cellmonoskikt i det apatiska utrymmet utan att cellerna förs till den basala insatssidan och utfodring av keratinocyterna med väsentliga näringsämnen från odlingsmediet i det basolaterala utrymmet. I början av rekonstitutionsprocessen odlas NHEKs under nedsänkta förhållanden i några dagar för att tillåta deras vidhäftning på membranet. Kalciumnivån i båda avdelningarna ökas jämfört med kalciumkoncentrationen som används för NHEKs 2D-kultur för att bromsa spridningen av celler och istället främja deras differentiering46. En epidermal kalciumgradient är nödvändig för att reglera barriärbildningen och homeostas47,48. Höga kalciumnivåer (dvs. upp till 1,5 mM) främjar bildandet av intercellulära korsningar och modulerar bildandet av det cornifierade kuvertet under terminal differentiering49. När keratinocyter bildar ett kontinuerligt och tätt vidhäftande monoskikt på det stödjande membranet avlägsnas mediet från det apatiska facket och odlingsprocessen fortsätter vid det luft-flytande gränssnittet (ALI) för att stimulera stratifiering och upprätta en epidermalbarriär 50,51. Särskilda odlingsförhållanden är avgörande för att få ett fullständigt stratifierat epitel36. Under rekonstitutionsprocessen vid ALI kompletteras mediet i det basolaterala utrymmet med keratinocyttillväxtfaktor (KGF), insulin, kalcium och askorbinsyra. Askorbinsyra spelar en viktig roll i bildandet av en lämplig SC lipidbarriär, som nära liknar den inhemska mänskliga huden52. Keratinocyter odlade i askorbinsyra-kompletterat medium visar en differentierad fenotyp, med ett förbättrat antal keratohyalin granulat, samt organiserade intercellulära lipid lameller i interstices av corneocytes52. Sådan tillskott är viktigt för att förbättra epidermal barriär funktion genom att öka cornified kuvert innehåll och undvika utarmning av hydrofil antioxidant butiker53,54. KGF, en viktig parakrina medlare av epidermal spridning och differentiering, används för att stimulera NHEKs55.
De viktigaste nackdelarna med interna rhes inkluderar förlusten av standardisering mellan forskningsinstitutioner och ökad arbetsintensitet och tidsförbrukning (upp till 3 veckor jämfört med de färdiga kommersiella modellerna). Syftet med detta dokument är att ta itu med dessa nackdelar och lägga grunden för produktionen i större skala. Förutom de ovan nämnda fördelarna med interna rhes syftar det nuvarande protokollet till att minska intra- och variabiliteten mellan vävnader, minska föroreningsriskerna och effektivisera odlingsprocessen.
Det nuvarande protokollet beskriver en reproducerbar och robust metod för att odla rhes med neonatal NHEKs. Dessutom visar det representativa resultat av karakteriseringen av RhEs morfologi, barriärintegritet och uttryck av proteiner som är specifika för epidermal differentiering. RhEs morfologiska struktur undersöktes med hematoxylin och eosin (H&E) färgning och överföring elektronmikroskopi (TEM). För att utvärdera barriärintegriteten mättes det transepidermala elektriska motståndet (TEER) och exponeringstiden för Triton X-100 för att minska 50% av vävnadens livskraft (ET50). Bildandet av desmosomal korsningar (dvs. desmoglein 1) analyserades av immunofluorescence (IF) att utvärdera keratinocyte vidhäftning. Bildandet av epidermala strukturella proteiner (dvs involucrin, loricrin och filaggrin) utvärderades och upptäcktes med IF. Dessa proteiner är involverade i bildandet av det mycket korslänkade proteinhöljet som omger SC-hornhinnor och som ett resultat är viktiga markörer för sen epidermal differentiering56,57. Dessutom användes IF för att analysera keratin 10, ett protein inducerat i tidiga fasen differentierade celler i SS58 och hittades inuti alla differentierade lager. Slutligen undersöktes RhE: s svar på proinflammatory stimuli (dvs lipopolysackarid och tumör nekros faktor alfa). Nivåerna av interleukin 1 alfa (IL-1α) och interleukin 8 (IL-8) mättes i cellkulturmedierna med enzymkopplade immunosorbenta analyser (ELISA).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >Acetic acid</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >A6283</td>
			<td >Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibiotic-antimycotic (100x)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Aqueous Eosin Y solution</td>
			<td >Sigma Aldrich</td>
			<td >HT110280</td>
			<td >Acidify Eosin solution with 1 mL acetic acid per 100 mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td >Sigma Aldrich or Merck</td>
			<td>C8106 or 1.02378.0500</td>
			<td >Prepare a stock solution of 0.144 M, filter sterilize and store aliquots at -20 &#176;C.&#160; It is recommended to prepare new aliquots every 6 months.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>Prepare a stock at 100 &#956;g/mL and store aliquots at -20 &#176;C. Working conditon is 1 &#956;g/mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Entellan mounting medium</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.07960.0500</td>
			<td>Mounting medium for H&#38;E staining.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EpiLife medium (referred to as keratinocyte growth medium)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>MEPI500CA</td>
			<td >Contains 0.06 mM of Ca2+.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethanol absolute</td>
			<td >Any supplier</td>
			<td >N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formalin 10%</td>
			<td >Leica Biosystems</td>
			<td >3800770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Human keratinocytes growth supplement (HKGS) (100x)</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>S0015</td>
			<td >To reach final concentrations of 0.2% [v/v] BPE, 0.2 ng/mL human recombinant EGF, 0.18 &#956;g/mL hydrocortisone,5 &#956;g/mL bovine transferrin, and 0.01 &#181;g/mL human recombinant insulin-like growth factor-I.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropanol</td>
			<td >Biosolve B.V.</td>
			<td >0016264102BS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kaiser&#39;s glycerol gelatine, phenol-free</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.08635.0100</td>
			<td>Mounting medium for IF staining.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Keratinocyte growth factor (KGF)</td>
			<td >R&#38;D Systems</td>
			<td>251-KG-050</td>
			<td >Reconstitute KGF protein at 100 &#956;g/mL in sterile 0.1% [w/v] BSA in PBS. Prepare aliquots and store at -20&#176;C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lactate dehydrogenase (LDH) assay kit</td>
			<td >Roche</td>
			<td >4744926001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate&#160;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8960</td>
			<td >Prepare a stock solution of 25 mg/mL, filter sterilize and store aliquots at -20&#176;C. It is recommended to prepare new aliquots every 6 months. Store in the dark.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lipopolysaccharide (LPS), E.coli strain O55:B5</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >L4524</td>
			<td >Prepare a stock of 1 mg/mL in sterile PBS and store aliquots at -20 &#176;C. Working concentration is 100 &#956;g/mL.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mayer&#8217;s Haematoxylin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >MHS80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal human epidermal keratinocytes (NHEKs)</td>
			<td >Lonza</td>
			<td>00192906</td>
			<td >Human primary keratinocytes isolated from neonatal foreskin, pooled from at least three donors.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phosphate-buffered saline</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10010056 or 10010-015</td>
			<td >Reference numbers can vary between countries.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Recombinant tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;)</td>
			<td >ImmunoTools</td>
			<td >11344483</td>
			<td>Prepare a stock of 100 &#956;g/mL in sterile ultrapure water. Working concentration is 40 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile ultrapure water</td>
			<td >Any supplier</td>
			<td >N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M5655</td>
			<td>Prepare a stock of 5 mg/mL MTT in sterile PBS. Working concentration is 1 mg/mL.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>93426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypan blue (0.4% [v/v])</td>
			<td >Any supplier</td>
			<td >N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin inhibitor</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>R007100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin/EDTA (0.05% [v/v])</td>
			<td >Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tween 20</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylene</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td >Abcam</td>
			<td>Ab150113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tri-sodium citrate dihydrate</td>
			<td >Merck</td>
			<td>1.06448.0500</td>
			<td>For antigen retrieval buffer for IF staining.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Dylight 488)</td>
			<td >Agrisera</td>
			<td>AS09 633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Filaggrin Mouse antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP2-53243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Involucrin Rabbit antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP2-33742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Keratin 10 Mouse antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP2-32962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Desmoglein-1 Mouse antibody&#160;</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>MAB944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Loricrin Rabbit antibody</td>
			<td >BioTechne (Novus Biologicals)</td>
			<td>NBP1-33610</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cultivating a three-dimensional reconstructed human epidermis at a large scale

En tredimensionell mänskliga epidermis modell rekonstrueras från neonatal primära keratinocyter presenteras. Häri beskrivs ett protokoll för odlingsprocessen och karakteriseringen av modellen. Neonatal primära keratinocyter odlas nedsänkt på genomsläppliga polykarbonatinsatser och lyfts till luft-flytande gränssnittet tre dagar efter sådd. Efter fjorton dagars stimulering med definierade tillväxtfaktorer och askorbinsyra i högt kalciumkulturmedium är modellen helt differentierad. Histologiska analys visade en helt stratifierad epidermis, härma morfologi av inhemska mänskliga huden. För att karakterisera modellen och dess barriärfunktioner, proteinnivåer och lokalisering som är specifika för tidig keratinocyt differentiering (dvs. keratin 10), sen differentiering (dvs. involucrin, loricrin och filaggrin) och vävnad vidhäftning (dvs. desmoglein 1), bedömdes av immunofluorescens. Vävnad barriär integritet utvärderades ytterligare genom mätning av transepithelial elektrisk resistans. Rekonstruerad human epidermis var lyhörd för proinflammatory stimuli (dvs lipopolysackarid och tumör nekros faktor alfa), vilket leder till ökad cytokin release (dvs interleukin 1 alfa och interleukin 8). Detta protokoll representerar en enkel och reproducerbar in vitro-metod för att odla rekonstruerad mänsklig epidermis som ett verktyg för att bedöma miljöeffekter och ett brett spektrum av hudrelaterade studier.

NHEKs odlade i 2D visar en traditionell morfologi med en konsekvent polygonal form (Figur 2A). Som beskrivits ovan sås NHEKs in i kulturinsatser efter att ha nått en sammanflöde på cirka 80%. RhEs morfologi analyserades med H&E färgning och TEM. Efter 15 dagar vid ALI erhålls en fullständigt stratifierad vävnad enligt dess fyra huvudsakliga epidermala skikt: SB, SS, SG och SC (Figur 2B). I SB-lagret har cellerna en kolumnform. Från det andra lagret mot de övre lagren av RhE skiljer NHEKs som observerats av förändringarna i cellmorfologin (från en kolumnform i SB-skiktet, mot en spinous form i SS-skiktet). I SG-skiktet har cellerna en mer utplattad form och visar keratohyalingranulat (KG) som representeras som lila prickar i cytoplasman. Deras karakteristiska runda och stjärnform markeras med vita pilar på H&E-bilden (Figur 2C). Cellerna i SC, är terminalt differentierade och är helt platta och saknar en cellkärna. De stratifierade rhesna har en total tjocklek av 84.3 ± 2.4 μm och deras SC har en tjocklek av 19.6 ± 3.2 μm (Figure 2D). Dessa värden är jämförbara med de värden som rapporteras för inhemsk mänsklig hud,dvs. Antalet livskraftiga lager är 6-7, vilket är lägre jämfört med den inhemska mänskliga huden, som är ungefär 7-1470. Ultrastructural analys av rhes vid olika tidpunkter i rekonstitution protokollet (dvs. 7, 10, 13 och 15 dagar) avslöjar cornification processen rhes med ett ökat antal hornhinnansocyt lager över tiden (Figur 2E). Efter 15 dagar vid ALI är SC för RhE-vävnaden gjord av cirka 15-25 lager, vilket är jämförbart med det värde som rapporteras för inhemsk mänsklig hud (dvs. 15-20 lager)69.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig2v2.jpg"> Figur 2:Primära keratinocyter och rekonstruerad mänsklig epidermis. (A) Faskontrastmikroskopibild av primära keratinocyter innan de sås på skär. Skalstången är 50 μm. (B-C) H&E ljusfältmikroskopibild av RhE. Skalstången är 50 μm (B) och 25 μm (C). D)Kvantifiering av rhe- och sc-tjockleken (medelvärdet ± SEM, n=3). (E) Transmissionselektronmikroskopibilder av RhE-tvärsnitt efter 7, 10, 13 och 15 dagar på ALI. Skalbaren är 4 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig2v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Enligt deras differentieringsstadium visar NHEKs som växer i 3D olika proteinuttrycksprofiler beroende på deras differentieringsstadium. Uttrycket av proteiner som är specifika för keratinocyte differentiering i tidigt stadium (dvs. keratin 10), keratinocyte differentiering i sent skede (dvs. involucrin, loricrin och filaggrin) och keratinocyt vidhäftning (dvs. desmoglein 1) i RhEs bestämdes med hjälp av IF-färgning. Involucrin uttryck visas mer huvudsakligen beläget i SG skiktet eftersom dess uttryck initieras tidigare under differentieringsprocessen (Figur 3D), medan filaggrin och loricrin uttrycks i de övre lagren (Figur 3B-C). Keratin 10-uttrycket hittades i alla livskraftiga lager, förutom SB-skiktet (figur 3E). RhEs visar funktionella desmosomala korsningar, vilket indikeras av uttrycket av desmoglein 1 i det intercellulära utrymmet i de livskraftiga epidermalla skikten (Figur 3F). Sammanfattningsvis uttrycks och placeras alla fem markörer i lämpliga epidermala skikt och översätts till en hälsosam epidermal differentieringsprocess.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig03.jpg"> Figur 3: Epidermal differentiering, vävnad vidhäftning och vävnad integritet rekonstruerad mänskliga epidermis. (A) H&E ljus fältmikroskopi bild av RhE. Konfokal fluorescensmikroskopibilder av (B) filaggrin (FLG), (C) loricrin (LOR), (D) involukrin (INV), (E) keratin 10 (K10) och (F) desmoglein 1 (DSG-1) representerade i magenta. Nuclei färgning (DAPI) representeras i blått. Skalbaren är 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
RhE-modellens barriäregenskaper undersöktes genom att bedöma både vävnadens livskraft och integritet. Vävnadens integritet fastställdes efter 15 dagar genom att teer mättes med hjälp av en voltohmmeter. De 2567 ± 415 Ω,cm2 värden som registrerats för rhesna innebär bildandet av en kontinuerlig barriär (figur 4A). Dessa värden ligger inom räckhåll med de som rapporteras för RhE-modellerna71,72,73,74. Dessutom fastställdes den erforderliga exponeringstiden för en cytotoxisk referenskemikalie (dvs. Triton X-100) för att minska vävnadens livskraft med 50% (ET50)med en tiazolylblå tetrazoliumbromid (MTT) analys. ET50-värdet som uppmättes för RhE var 2,1 timmar. Detta värde ligger inom acceptansintervallet för andra epidermala 3D-modeller som är kvalificerade för tillförlitlig förutsägelse av irritationsklassificering (OECD-riktlinje 439)19.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig4v3.jpg"> Figur 4:Barriäregenskaper hos rekonstruerad mänsklig epidermis. (A) Vävnadsintegritet mätt med transepithelial elektrisk resistans (medelvärde ± SEM, n=6). B)ET50 som bestäms genom mätning av vävnadens livskraft (dvs. MTT-analys) vid aktuell exponering för 78,3 μL 1% Triton X-100 (medelvärde ± SEM, n=3).
Lyhördhet rhes undersöktes på kända proinflammatory stimuli. RhEs behandlades systemiskt, dvs. tillsats av stimuli i mediet i basolateral kupé, med hjälp av 100 μg/mL Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS) och 40 ng/mL tumör nekros faktor alfa (TNF-α). Efter 24 timmars stimuli samlades cellkulturmediet in. Cytotoxiciteten mättes med hjälp av en laktatdehydrogenas (LDH) analys och jämfördes med värdena för en känd membranstörare, Triton X-100-tvättmedlet (figur 5). En signifikant ökning (p < 0,05, enkelvägs ANOVA, Dunnetts multipla jämförelsetest) visades i LDH- aktivitet i rhes som behandlats med Triton X-100. LPS och TNF-α båda visade inte vara cytotoxiska.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig5v3.jpg"> Figur 5:Cytotoxiciteten mätt via LDH-analys (Laktat dehydrogenas). Data presenteras som relativa värden för kontroll, obehandlade vävnader (CTRL); medelvärdet ± SEM, n=9 (Triton X-100), n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). Signifikans testades med enkelvägs ANOVA, Dunnetts multipla jämförelsetest. Asterisk betecknar statistiskt signifikant skillnad jämfört med CTRL, ****p < 0,0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig5v3large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
Frisättningen av interleukin 1 alfa (IL-1α) och interleukin 8 (IL-8) i RhE-mediet kvantifierades med ELISA. Figur 6 visar både den kvantifierade och relativa IL-1α- och IL-8-utgåvan av rhes efter utmaning med LPS och TNF-α. LPS behandling resulterade i en statistiskt signifikant (p < 0,05, unpaired Student's T-test) inducerad frisättning av IL-8 (9,6 ± 1,0 gånger ökning) och IL-1α (2,7 ± 1,3 gånger ökning). TNF-α inducerar inte signifikant IL-8 release, även om en tendens till ökade IL-8 nivåer observerades (2,3 ± 0,8 gånger ökning). TNF-α gjorde dock signifikant (p < 0,05, unpaired Student's T-test) utlösa IL-1α release (1,8 ± 0,5 gånger ökning).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61802/61802fig6v3.jpg"> Figur 6: Proinflammatoriska svar i den rekonstruerade mänskliga epidermis. Koncentrationer av IL-8 som rhe släpper ut på en 24-timmars utmaning med LPS(A)och TNF-α (B). Data representeras som medelvärde ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (C) Data representeras som medelvärdet av relativt värde jämfört med kontroll, obehandlade vävnader (CTRL) ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). Koncentrationen av IL-1α-utsläpp av RhE på en 24-timmars utmaning med LPS(D)och TNF-α (E). Data representeras som medelvärde ± SEM, n=8 (LPS), n=3 (TNF-α). (F) Data representeras som medelvärdet av det relativa värdet jämfört med CTRL ± SEM, n=4 (LPS), n=3 (TNF-α). Betydelsen testades av en oparerad Students T-test. Asterisk betecknar statistiskt signifikanta skillnader jämfört med CTRL, *p < 0,05, ****p < 0,0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61802/61802fig6v3large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale at JoVE.com

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

Detta protokoll beskriver en enkel metod för att odla tredimensionella rekonstituerade mänskliga epidermis på ett reproducerbart och robust sätt. Dessutom karakteriserar det struktur-funktionsförhållandet för den epidermala barriärmodellen. De biologiska svaren från den rekonstituerade mänskliga epidermis på proinflammatory stimuli presenteras också.

Odla en tredimensionell rekonstruerad mänsklig epidermis i stor skala

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

In vitro eller konstruerade mänskliga epidermis modell utvecklades först på nittiotalet med ett primärt mål att utveckla alternativa testmetoder till djurförsök. Dessa 3D epidermala modeller används nu ofta för att testa både säkerhet och effekt av kosmetiska ingredienser. Medan det kan köpas från flera vävnadsleverantörer, ger det mer flexibilitet till slutpunkten att kunna rekonstruera en 3D-modell i ett laboratorium.Det finns flera forskningsartiklar som kortfattat beskriver rekonstitutionsprotokollet för en 3D epidermal modell, men det fanns hittills ingen tillgänglig video som visade de kritiska stegen i rekonstitutionsprocessen. Detta är anledningen till publiceringen av detta videopapper. Beredningen av in-house rekonstruerad mänsklig epidermis möjliggör mycket frihet i odlingsprocessen, såsom förändringar i kulturens medelstora sammansättning, proinflammatoriska eller oxidativa stressutlösare, tystning av gener av intresse och hämning eller stimulering av vissa biologiska processer.Till att börja med tina en flaska med 1 miljon kryobevarade normala mänskliga epidermal keratinocyter, eller NHEKs, i ett vattenbad vid 37 grader Celsius genom att dränka en del av flaskan i vatten. Inkubera injektionsflaskan i en till två minuter i vattenbadet tills endast en liten isbit är synlig. Återanvänd cellerna mycket försiktigt genom att pipetting upp och ner två till tre gånger.Överför cellupphängningen till två T75-flaskor som innehåller totalt 15 milliliter förförstärt upptiningsmedium, vilket resulterar i en såddtäthet på 6,7 gånger 10 till de fjärde cellerna per centimeter i kvadrat. Förfyll 24 brunnsplattor med 1,5 milliliter nedsänkt medium, helst med en dispenserpipett. Efter odling av cellerna till 80% confluency är de redo för sådd i skär för odling av rekonstruerad mänsklig epidermis, eller RHEs.Ta bort basalmediet från T75-flaskorna med NHEKs. Skölj cellerna genom att tillsätta fem milliliter förvärmd PBS till varje T75-kolv och ta sedan bort PBS från kolvarna. Tillsätt två till tre milliliter förvärmd 0,05% Trypsin-EDTA till varje kolv och se till att trypsinlösningen är jämnt fördelad på kolvens cellkulturområde.Placera kolvarna i cellkulturinkubatorn i fyra minuter och kontrollera sedan om cellerna lossar med mikroskopet vid en förstoring på 10 X. Rapa kolven för att hjälpa cellerna att frigöras från kolvens yta. När alla celler har lossnat, tillsätt en lika stor volym förvärmd trypsinhämmare till varje T75-kolv och överför cellfjädringen från kolvarna till ett centrifugeringsrör.Skölj kolvarna med fem milliliter förvärmd PBS och överför den till centrifugröret som innehåller cellfjädringen. Centrifugera de skördade cellerna vid 400 gånger G i fem minuter. Kassera försiktigt det mesta av supernatanten och lämna cirka 100 till 200 mikroliter i röret.Snärta försiktigt röret med fingrarna för att försiktigt lossa pelleten. Återanvänd försiktigt cellpellet i en låg volym nedsänkt medium, rör upp och ner 5 till 10 gånger för att säkerställa en enhetlig cellupphängning. Börja med en låg volym för att undvika bildandet av cellaggregat och tillsätt upp till en milliliter nedsänkt medium per första T75-kolv.Räkna cellerna i suspensionen med trypan blue exclusion-metoden. Späd cellupphängningen med ytterligare nedsänkt medium för att nå en koncentration på 3,525 gånger 10 till de femte cellerna per milliliter, med hjälp av den första ekvationen i textmanuskriptet. Utför ett andra cellantal av den utspädda lösningen och använd den andra ekvationen i textmanuskriptet för att beräkna cellfjädringsvolymen som ska sås in i kulturinsatsen.Häng de 24 brunnskulturinsatserna i bärarplattans högsta läge och överför bärarplattan till 24 brunnsplattan förfylld med nedsänkt medium. Lägg till den bestämda volymen av cellupphängningen i varje skär, var försiktig så att du inte rör vid insatsen. Efter sådd, inkubera 24 brunnsplattorna i 10 till 15 minuter vid rumstemperatur för att övervinna en kanteffekt.Flytta inte plattorna under denna tid. Överför plattorna till cellkulturinkubatorn och lämna dem under nedsänkta förhållanden i tre dagar. Efter en tre dagars inkubation i cellkulturinkubatorn, exponera cellerna som har fäst på membranytan till luftvätskans gränssnitt, eller ALI, genom att ta bort det nedsänkta mediet från det apatiska facket med ett aspirationssystem och en glas Pasteur-pipett.Fyll nya 24 brunnsplattor med 1,5 milliliter färskt förvärmt ALI-medium och överför bärarplattorna med kulturinsatserna till de nya multibrunnsplattorna. Överför multibrunnsplattorna tillbaka till cellkulturinkubatorn. Uppdatera ALI-mediet varannan till var tredje dag i 14 dagar.Keratinocyter i 2D-kulturen visar en traditionell morfologi med en konsekvent polygonal form. Efter 15 dagar på ALI bildar den rekonstruerade mänskliga epidermis en helt stratifierad vävnad, som indikeras av dess fyra huvudsakliga epidermala lager. Ultrastructural analys av rekonstruerade mänskliga epidermis vid olika tidpunkter i rekonstitution protokollet avslöjar cornification processen, med ett ökat antal hornhinnans plats lager över tiden.Keratinocyter i epidermis visar olika protein uttryck profiler enligt deras differentieringsstadiet. Involucrin uttryck visas mer främst i SG skiktet, medan uttrycket av filaggrin och loricrin ligger i de övre lagren. Keratin-10-uttrycket hittades i alla livskraftiga lager utom SB-skiktet.Den rekonstruerade mänskliga epidermis visar funktionella desmosomala korsningar, vilket indikeras av uttrycket av Desmoglein-1 i det intercellulära utrymmet i de livskraftiga epidermala skikten. Barriäregenskaperna hos den rekonstruerade epidermismodellen undersöktes genom att bedöma vävnadens livskraft vid aktuell behandling med en känd barriärstörare och genom att bedöma vävnadens integritet. Vävnadens integritet fastställdes efter 15 dagar genom att teer med en voltmeter mättes.Lyhördhet epidermis till Lipopolysaccharide och Tumör nekros faktor alfa undersöktes. Både LPS och TNF alfa behandlingar var giftfria. i förhållande till Triton X-100-kontrollen.Frisättningen av Interleukin-1 alfa och Interleukin-8 i RHE medium kvantifierades med IL lysis. LPS behandling resulterade i en statistiskt signifikant up-regulation i frisättningen av Interleukin-1 alfa och Interleukin-8. TNF alfa behandling resulterade i en statistiskt signifikant up-regulation i endast frisättningen av Interleukin-1 alfa.En tydlig tendens till ökade Interleukin-8 nivåer observerades emellertid också vid stimulering med TNF alfa. Enligt detta protokoll kan TEER mätas som ett värde för barriärintegritet. Livskraften eller cytotoxiciteten kan mätas med exempelvis en MTT- eller LDH-analys.Supernatanten kan användas för att mäta utsöndring av cytokiner eller andra proteiner. Dessutom kan vävnaden användas för att studera uttryck av proteiner eller gener av intresse.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Bioengineering

Unit 1

The Integumentary System

SCIENTISTS IN ACTION

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Alginat Hydrogeler för tredimensionella Organ Kultur äggstockarna och äggledarna

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

Den tredimensionella human hud Rekonstruera Modell: ett verktyg för att studera normal hud och melanom Progression

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Plana och tredimensionella Tryckning av ledande bläck

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Human Brosk Tissue Fabrication Använda Tredimensionell Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

Analys av Cell Migration inom en tredimensionell kollagenmatris

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Kloning och storskalig produktion av hög kapacitet Adenovirusvektorer Baserat på den mänskliga adenovirus typ 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Three-dimensional Biomimetic Technology: Novel Biorubber Creates Defined Micro- and Macro-scale Architectures in Collagen Hydrogels

Tredimensionell Biomimetic Technology: Novel Biorubber Skapar Defined mikro- och makroskala arkitekturer i Collagen Hydrogeler

Tissue scaffolds play a crucial role in the tissue regeneration process. The ideal scaffold must fulfill several requirements such as having proper ...

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Beredning och analys av<em&gt; In Vitro</em&gt; Tredimensionell bröstkarcinom Surrogates

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Utveckling av en multicellulär Tredimensionell Organotypiska modell av det mänskliga tarmslemhinnan odlade under mikrogravitation

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

Lab-on-a-CD Platform for Generating Multicellular Three-dimensional Spheroids

Lab-på-en-CD plattform för att generera Multicellulära tredimensionell spheroids

A three-dimensional spheroid cell culture can obtain more useful results in cell experiments because it can better simulate cell microenvironments of the ...