Name: single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes
Uploaded: 2020-12-22T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes at JoVE.com

लेखकों को अपनी तरह के वित्तीय योगदान है जो इस प्रकाशन के उत्पादन लागत को कवर के लिए केयर्न रिसर्च लिमिटेड स्वीकार करना चाहते हैं । इसके अलावा, हम सुश्री आईएनएस म्यूलर और सुश्री स्टेफनी केस्टेल को उनके उत्कृष्ट तकनीकी समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं ।
लेखकों के अनुसंधान को जर्मन सेंटर फॉर कार्डियोवैस्कुलर रिसर्च (डीजेएचके), ड्यूश फॉरचुंग्सजेमेन्सचैफ्ट (डीएफजी, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन, वीओ 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 और जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति के तहत-EXC 2067/1-390729940) और Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20) ।

1. सेलुलर तैयारी
नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले मानव आईपीएससी स्वस्थ दानदाताओं से प्राप्त किए गए थे और डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग और लैक्टेट शुद्धिकरण तकनीकों के पूरी तरह से परिभाषित छ...

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	<li>Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+fluorescent+voltage+indicators+for+studying+membrane+potential.">Small molecule fluorescent voltage indicators for studying membrane potential.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 33, 74-80 (2016).</li><li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+using+a+library+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+reveals+disease-specific+patterns+of+cardiotoxicity.">Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li><li>Horv&#225;th, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+resting+membrane+potential+and+low+inward+rectifier+potassium+currents+are+not+inherent+features+of+hiPSC-derived+cardiomyocytes.">Low resting membrane potential and low inward rectifier potassium currents are not inherent features of hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 822-833 (2018).</li><li>Salama, G., Morad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Merocyanine+540+as+an+optical+probe+of+transmembrane+electrical+activity+in+the+heart.">Merocyanine 540 as an optical probe of transmembrane electrical activity in the heart.</a> Science. 191 (4226), 485-487 (1976).</li><li>Hortigon-Vinagre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+ratiometric+fluorescence+measurements+of+the+voltage+sensitive+dye+Di-4-ANEPPS+to+examine+action+potential+characteristics+and+drug+effects+on+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">The use of ratiometric fluorescence measurements of the voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS to examine action potential characteristics and drug effects on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Toxicological Sciences. 154 (2), 320-331 (2016).</li><li>Blinova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+multisite+study+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+drug+proarrhythmic+potential+assessment.">International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment.</a> Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).</li><li>Miller, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optically+monitoring+voltage+in+neurons+by+photo-induced+electron+transfer+through+molecular+wires.">Optically monitoring voltage in neurons by photo-induced electron transfer through molecular wires.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (6), 2114-2119 (2012).</li><li>Bedut, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+drug+profiling+with+voltage-+and+calcium-sensitive+fluorescent+probes+in+human+iPSC-derived+cardiomyocytes.">High-throughput drug profiling with voltage- and calcium-sensitive fluorescent probes in human iPSC-derived cardiomyocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (1), 44-53 (2016).</li><li>McKeithan, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+platform+for+assessment+of+congenital+and+drug-induced+arrhythmia+with+hiPSC-derived+cardiomyocytes.">An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hiPSC-derived cardiomyocytes.</a> Frontiers in Physiology. 8, 766 (2017).</li><li>Duncan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-mediated+shortening+of+action+potentials+in+LQTS2+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Drug-mediated shortening of action potentials in LQTS2 human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Stem Cells and Development. 26 (23), 1695-1705 (2017).</li><li>Asakura, K., Hayashi, S., Ojima, A., Taniguchi, T., Miyamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+acquisition+and+analysis+methods+in+multi-electrode+array+experiments+with+iPS+cell-derived+cardiomyocytes.">Improvement of acquisition and analysis methods in multi-electrode array experiments with iPS cell-derived cardiomyocytes.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 75, 17-26 (2015).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt/&#946;-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions.">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/&#946;-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes.">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li><li>Kleinsorge, M., Cyganek, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subtype-directed+differentiation+of+human+iPSCs+into+atrial+and+ventricular+cardiomyocytes.">Subtype-directed differentiation of human iPSCs into atrial and ventricular cardiomyocytes.</a> STAR Protocols. , 100026 (2020).</li><li>Knollmann, B. C., Katchman, A. N., Franz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monophasic+action+potential+recordings+from+intact+mouse+heart:+validation,+regional+heterogeneity,+and+relation+to+refractoriness.">Monophasic action potential recordings from intact mouse heart: validation, regional heterogeneity, and relation to refractoriness.</a> Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 12 (11), 1286-1294 (2001).</li><li>Leopold, J. A., Loscalzo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+precision+medicine+in+cardiovascular+disease.">Emerging role of precision medicine in cardiovascular disease.</a> Circulation Research. 122 (9), 1302-1315 (2018).</li><li>Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+atrial+myocytes+for+simultaneous+measurements+of+Ca2++transients+and+membrane+currents.">Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50235 (2013).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++Leak+and+increased+Na+-Ca2++exchanger+function+underlie+delayed+afterdepolarizations+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation.">Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ Leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).</li><li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+atrial+arrhythmogenesis+in+patients+with+paroxysmal+atrial+fibrillation.">Cellular and molecular mechanisms of atrial arrhythmogenesis in patients with paroxysmal atrial fibrillation.</a> Circulation. 129 (2), 145-156 (2014).</li><li>Fakuade, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+atrial+cytosolic+calcium+handling+contributes+to+the+development+of+postoperative+atrial+fibrillation.">Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation.</a> Cardiovascular Research. , 162 (2020).</li><li>Gross, E., Bedlack, R. S., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-wavelength+ratiometric+fluorescence+measurement+of+the+membrane+dipole+potential.">Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurement of the membrane dipole potential.</a> Biophysical Journal. 67 (1), 208-216 (1994).</li><li>Matiukas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near-infrared+voltage-sensitive+fluorescent+dyes+optimized+for+optical+mapping+in+blood-perfused+myocardium.">Near-infrared voltage-sensitive fluorescent dyes optimized for optical mapping in blood-perfused myocardium.</a> Heart Rhythm. 4 (11), 1441-1451 (2007).</li><li>Mutoh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrally-resolved+response+properties+of+the+three+most+advanced+fret+based+fluorescent+protein+voltage+probes.">Spectrally-resolved response properties of the three most advanced fret based fluorescent protein voltage probes.</a> PLoS One. 4 (2), 4555 (2009).</li><li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins.">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).</li><li>Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photostable+silicon+rhodamine+platform+for+optical+voltage+sensing.">A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (33), 10767-10776 (2015).</li><li>Deal, P. E., Kulkarni, R. U., Al-Abdullatif, S. H., Miller, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isomerically+pure+tetramethylrhodamine+voltage+reporters.">Isomerically pure tetramethylrhodamine voltage reporters.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9085-9088 (2016).</li><li>Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectra,+membrane+binding,+and+potentiometric+responses+of+new+charge+shift+probes.">Spectra, membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes.</a> Biochemistry. 24 (21), 5749-5755 (1985).</li><li>Fromherz, P., Muller, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+fluorescence+of+amphiphilic+hemicyanine+dyes+in+neuron+membrane.">Voltage-sensitive fluorescence of amphiphilic hemicyanine dyes in neuron membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1150 (2), 111-122 (1993).</li><li>Salama, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+new,+long-wavelength,+voltage-sensitive+dyes+in+the+heart.">Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart.</a> Journal of Membrane Biology. 208 (2), 125-140 (2005).</li><li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+action+potentials+and+subthreshold+electrical+events+imaged+in+neurons+with+a+fluorescent+protein+voltage+probe.">Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe.</a> Neuron. 75 (5), 779-785 (2012).</li><li>Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., MacLaurin, D., Cohen, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recording+of+action+potentials+in+mammalian+neurons+using+a+microbial+rhodopsin.">Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin.</a> Nature Methods. 9 (1), 90-95 (2012).</li><li>Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+membrane+voltage+measurements+using+FRET+with+new+fluorescent+proteins.">Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 5 (8), 683-685 (2008).</li><li>Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Kn&#246;pfel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+genetically+encodable+fluorescent+voltage+sensor+exploiting+fast+Ci-VSP+voltage-sensing+movements.">Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements.</a> PLoS One. 3 (6), 2514 (2008).</li><li>Bradley, J., Luo, R., Otis, T. S., DiGregorio, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submillisecond+optical+reporting+of+membrane+potential+in+situ+using+a+neuronal+tracer+dye.">Submillisecond optical reporting of membrane potential in situ using a neuronal tracer dye.</a> The Journal of neuroscience. 29 (29), 9197-9209 (2009).</li><li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells+&amp;+tissues.">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells &amp; tissues.</a> Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).</li><li>Kappadan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+optical+measurement+of+cardiac+restitution,+contraction,+and+fibrillation+dynamics+in+beating+vs.+blebbistatin-uncoupled+isolated+rabbit+hearts.">High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts.</a> Frontiers in Physiology. 11, 464 (2020).</li><li>Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrophysiological+and+mechanical+effects+of+2,3-butane-dione+monoxime+and+cytochalasin-D+in+the+Langendorff+perfused+rabbit+heart.">The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart.</a> Experimental Physiology. 89 (2), 163-172 (2004).</li><li>K&#233;pir&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=para-Nitroblebbistatin,+the+non-cytotoxic+and+photostable+Myosin+inhibitor.">para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable Myosin inhibitor.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).</li></ol>

यहां हम इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मॉडलिंग और कार्डियक ड्रग स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त अलग-थलग आईपीएससी-सीएम से विस्तृत एपी प्रोफाइल प्राप्त करने के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम अपने ?...

कार्डियोमायोसाइट्स के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मॉडलिंग और कार्डियक ड्रग स्क्रीनिंग के लिए कुशल प्लेटफार्मों का निर्माण विभिन्न प्रकार के अतालता विकारों के लिए चिकित्सीय रणनीतियों के विकास के लिए आवश्यक है। प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) प्रौद्योगिकी के तेजी से विस्तार अलग रोगी व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (आईपीएससी-सीएम) का उपयोग कर मानव रोग मॉडलिंग और औषधीय जांच में आशाजनक पैठ का उत्पादन किया है । पैच-क्लैंप (वर्तमान-क्लैंप) के माध्यम से इन कोशिकाओं के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल लक्षण वर्णन के लिए "गोल्ड स्टैंडर्ड" तकनीक कार्रवाई क्षमता (एपी) आकृति विज्ञान और अवधि की मात्रा निर्धारित कर सकती है, हालांकि, यह विधि अविश्वसनीय रूप से जटिल और धीमी है, और उच्च थ्रूपुट डेटा अधिग्रहण 1 के लिए अच्छीतरहसे अनुकूल नहीं है। आईपीएससी-सीएम को नियमित रूप से वयस्क देशी कार्डियोमायोसाइट्स2की तुलना में डायस्टोलिक झिल्ली की क्षमता और रिसाव में वृद्धि की संभावना बताई जाती है। यह सुझाव दिया जाता है कि आईपीएससी-सीएम में देखी गई छोटी कोशिका आकार और कम झिल्ली क्षमता वर्तमान क्लैंप तकनीक का उपयोग करते समय कुछ व्यवस्थित त्रुटि पैदा कर सकती है, शायद इन विचलन3को समझा सकती है। एक आईपीएससी-सीएम प्लेटफॉर्म की उपयोगिता को अधिकतम करने के लिए, आईपीएससी-सीएम में एक सेल स्तर पर ट्रांसमेम्ब्रान वोल्टेज परिवर्तन की विशेषता होने पर थ्रूपुट बढ़ाने और डेटा सटीकता सुनिश्चित करने के लिए एक अतिरिक्त विधि मूल्यवान है।
वोल्टेज संवेदनशील रंगों (वीएसडी) लंबे समय से पारंपरिक तकनीकों के मुकाबले हृदय एपी काइनेटिक्स के तेज, गैर-आक्रामक और समकक्ष विश्लेषण प्रदान करने के लिए एक प्रस्तावित विधि रही है4। हाल ही में हुए एक अध्ययन में कार्डियक एपी5को सही ढंग से निर्धारित करने के लिए रेशेट्रिक वोल्टेज सेंसिटिव प्रोब फोटोमेट्री की उपयुक्तता का प्रदर्शन किया गया है । इसके अलावा, ऑप्टिकल फोटोमेट्री दृष्टिकोण को आसानी से स्केल करने की क्षमता इस तकनीक को चिकित्सीय दवा विकास (जैसे, सिपा) में महत्वपूर्ण बड़े पैमाने पर कार्डियोटॉक्सीसिटी स्क्रीन पर उधार देती है। माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी और वोल्टेज-सेंसिंग ऑप्टिकल तकनीकों का उपयोग करके एक अंधे बहु-साइट अध्ययन में मानकीकृत कार्डियोटॉक्सिसिटी प्रोटोकॉल के विकास ने इस दृष्टिकोण6के प्रमुख मूल्य का प्रदर्शन किया है।
कई शक्तिशाली उपकरणों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, और नए जांच के चल रहे सिंथेटिक विकास हृदय और तंत्रिका निर्माण की एक किस्म भर में अपनी प्रभावशीलता को व्यवस्थित करने के लिए रोमांचक क्षमता दिखाते हैं । आदर्श वीएसडी में कम कैपेसिटिव लोड, फोटोब्लेचिंग और साइटोटॉक्सिकिटी प्रदर्शित करते हुए काइनेटिक्स और संवेदनशीलता में वृद्धि होगी। हाल ही में संश्लेषित VF2.1Cl (FluoVolt) इन लाभकारी गुणों में से कई काफी हद तक अपने उपन्यास तार आधारित आणविक संरचना के कारण व्यक्त करता है, जो नए वोल्टेजफ्लूर (वीएफ) परिवार7के अन्य सदस्यों द्वारा साझा किया गया है । आम इलेक्ट्रोक्रोमिक वीएसडी के विपरीत जिसमें प्लाज्मा झिल्ली के लिए आणविक और विद्युत रूप से संविलियन सरल जांच की जाती है, इस डाई में निष्क्रिय रूप से डाला गया, झिल्ली-फैले सिंथेटिक तार होते हैं जो एक इलेक्ट्रॉन-समृद्ध दाता को संशोधित फ्लोरोसिन फ्लोरोफोर (फिटसी) के साथ जोड़ते हैं। मशीनी विवरण चित्र 1में प्रदान किए गए हैं । यह डाई झिल्ली वोल्टेज में उतार-चढ़ाव के प्रति उत्कृष्ट संवेदनशीलता को दर्शाता है, जो तुलनात्मक गति 7 पर अन्य सामान्य जांच में देखे गए ~ 10% के विपरीत प्रति 100 एमवी उत्सर्जन तीव्रता में27%परिवर्तन प्रदर्शित करता है। इसके अलावा, वायर-आधारित पीईटी सिस्टम सीधे सेलुलर इलेक्ट्रिक फील्ड के साथ बातचीत नहीं करते हैं जो सेलुलर कैपेसिटिव लोड में न्यूनतम विद्युत हस्तक्षेप और नगण्य परिवर्तन पैदा करता है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig01.jpg"> चित्रा 1: VF2.1Cl डाई के रासायनिक, स्पेक्ट्रल और मशीनी पैरामीटर। (A)VF2.1Cl. आणविक सुविधाओं की रासायनिक संरचना नोट करने के लिए फेनिलीन विनाइलीन आणविक तार के भीतर कई एल्किल समूहों को शामिल किया गया है जो प्लाज्मा झिल्ली में सम्मिलन की सुविधा प्रदान करते हैं । एक नकारात्मक आवेशित सल्फोनिक एसिड समूह फिटसी जांच के लिए संयुग्मित लिपिड बाइलेयर के विद्युत क्षेत्र के सापेक्ष लंबवत प्रविष्टि के पास बाहृशल सतह और एड्स पर फ्लोरोफोर स्थिरीकरण सुनिश्चित करता है। (ख)एक लक्ष्य कोशिका के प्लाज्मा झिल्ली में एम्बेडिंग लंबवत VF2.1Cl की एक सरलीकृत योजनाबद्ध । (ग)वीएफ 2.1सीएल डाई का अवशोषण और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा। स्पेक्ट्रा मानक फिटसी और जीएफपी जांच के समान है। (घ)VF2.1Cl की कार्यनीतता के यंत्रवादी तरीके का चित्रण। आराम की स्थिति (हाइपरपोलराइज्ड) में, नकारात्मक इंट्रासेलुलर वोल्टेज रोस्ट्रल फ्लोरोफोर की ओर मुफ्त इलेक्ट्रॉनों को ड्राइव करते हैं। इलेक्ट्रॉन बहुतायत सुनिश्चित करता है फोटो प्रेरित इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण (पीईटी) ऑप्टिकल उत्तेजन के बाद उत्तेजित राज्य से बाहर एक मार्ग के रूप में इष्ट है, प्रभावी ढंग से फ्लोरेसेंस शमन । इसके विपरीत, एक डीपोलराइज्ड झिल्ली क्षमता ऑप्टिकल एक्सिलिएशन पर फ्लोरेसेंस के पक्ष में नीचे इलेक्ट्रॉन आंदोलन को प्रभावित करती है। परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट प्रतिक्रिया झिल्ली वोल्टेज से संबंधित है और सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल काइनेटिक्स पर विस्तृत लौकिक जानकारी इकट्ठा करने के लिए ठीक से उपयोग किया जा सकता है। (ई)प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड (ऊपरी) और फ्लोरेसेंस पर 470 एनएम (लोअर) वीएफ 2.1सीएल से भरे लेपोरीन कार्डियोमायोसाइट्स की छवियां।(एफ)जेड स्टैक एक लोडेड कार्डियोमायोसाइट के। तीर सेलुलर झिल्ली के लिए VF2.1Cl के स्पष्ट स्थानीयकरण के क्षेत्रों का संकेत देते हैं। छवियों को एक कताई डिस्क कॉन्फोकल सिस्टम के साथ अधिग्रहीत किया गया था जिसमें एक्स-लाइटवी 3 कताई डिस्क कॉन्फोकल हेड शामिल था, जिसमें 50 माइक्रोन पिनहोल पैटर्न था; एलडीआई-7 प्रकाशक; प्राइम95बी कैमरा और एक प्लानपो लैम्ब्डा 100x उद्देश्य। स्केल बार: 20 माइक्रोन करें इस <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61890/61890fig01large.jpg" target="_blank">आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
वीएफ 2.1सीएल को संजीद जाने वाली फिटसी जांच यह सुनिश्चित करती है कि इसका उपयोग मानक और जीएफपी फ़िल्टर कॉन्फ़िगरेशन के तहत प्रभावी ढंग से किया जा सकता है, और इसके लिए केवल एक चैनल अधिग्रहण प्रणाली की आवश्यकता होती है, जिनमें से दोनों फ्लोरोसेंट इमेजिंग प्लेटफार्मों की आम विशेषताएं हैं। इस डाई के साथ घने मानव आईपीएससी-सीएम मोनोलेयर का विश्लेषण हाल ही में8,9, 10,11बतायागया है । हमारा प्रोटोकॉल एकल, अलग आईपीएससी-सीएम की हमारी जांच के कारण इन अध्ययनों से अलग है, जो घने सिंकायल मोनोलेयर के विद्युत और पैराक्राइन प्रभावों से बेफिक्र है, और जटिल कॉन्फोकल या वाइड-फील्ड इमेजिंग व्यवस्थाओं के विपरीत एक किफायती और अनुकूलन फोटोमेट्री सिस्टम का हमारा उपयोग है।
यहां, हम अलग मानव आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स और देशी कार्डियोमायोसाइट्स (पूरक फ़ाइलदेखें) से मजबूत ऑप्टिकल एपीएस के तेजी से अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम एकल सेल फोटोमेट्री मापन के लिए कला मंच के अनुकूलन राज्य के साथ मिलकर VF2.1Cl का उपयोग करें। इन प्रायोगिक प्रोटोकॉल विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र गोटिंगेन (नंबर 10/9/15) की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25 Trypsin EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td>HN04.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-Glucose anhydrous&#160;BioChemica</td>
			<td>ITW Reagents</td>
			<td>A1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoVolt Membrane Potential Kit&#160;</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>F10488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth&#160;</td>
			<td>HN77.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lamanin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9265.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nifedipine&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21829-25-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor Y27632</td>
			<td>Stemolecule</td>
			<td>04-0012-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>61870010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene EDTA&#160;</td>
			<td>Gibco&#160;</td>
			<td>15040033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>495LP Dichroic Beamsplitter&#160;</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circle Coverslips, Thickness 0</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>CB00100RA020MNT0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1550B</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual OptoLED Power Supply&#160;</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET470/40x Excitation Filter&#160;</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ET535/50m</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etched Neubauer Hemacytometer</td>
			<td>Hausser Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Cubes&#160;</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX73 Inverted Microscope&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MonoLED</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiport Adaptors&#160;</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myopacer Cell Stimulator&#160;</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optomask Shutter&#160;</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optoscan System Controller</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PH-1 Temperature Controlled Platform&#160;&#160;</td>
			<td>Warner Instruments&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photomultiplier Detector&#160;</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT Amplifier Insert</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMT Supply Insert</td>
			<td>Cairn Research&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RC-26G Open Bath Chamber&#160;</td>
			<td>Warner Instruments&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SA-OLY/2AL Stage Adaptor&#160;</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T565lpxr Dichroic Beamsplitter&#160;</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T660lpxr Dichroic Beamsplitter</td>
			<td>Chroma Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC-20 Dual Channel Temperature Controller&#160;</td>
			<td>npi Electronic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLFLN 40X Objective</td>
			<td>Olympus&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB 3.0 Colour Camera&#160;</td>
			<td>Imaging Source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampex 11.1</td>
			<td>Molecular Devices&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clampfit 11.1</td>
			<td>Molecular Devices&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IC Capture 2.4&#160;</td>
			<td>Imaging Source&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 8</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell optical action potential measurement in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes

कार्डियोमायोसाइट इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की मात्रा निर्धारित करने के लिए पारंपरिक इंट्रासेलुलर माइक्रोइलेक्ट्रोड तकनीक बेहद जटिल, श्रम गहन हैं, और आम तौर पर कम थ्रूपुट में किए जाते हैं। प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) प्रौद्योगिकी के तेजी से और चल रहे विस्तार हृदय अनुसंधान में एक नया मानक प्रस्तुत करता है और वैकल्पिक तरीकों अब एक ही सेल के स्तर पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल डेटा के थ्रूपुट को बढ़ाने के लिए आवश्यक हैं । VF2.1Cl हाल ही में व्युत्पन्न वोल्टेज संवेदनशील डाई है जो एक तेजी से एकल चैनल, झिल्ली क्षमता में उतार-चढ़ाव के लिए उच्च परिमाण प्रतिक्रिया प्रदान करता है। इसमें अन्य मौजूदा वोल्टेज संकेतकों से बेहतर गतिज होती है और पारंपरिक माइक्रोइलेक्ट्रोड तकनीकों के बराबर कार्यात्मक डेटा उपलब्ध होता है। यहां, हम मॉड्यूलर और अत्यधिक किफायती फोटोमेट्री सिस्टम का उपयोग करके बाहरी रूप से पुस्तक वाले मानव आईपीएससी व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स में सरलीकृत, गैर-आक्रामक कार्रवाई संभावित लक्षण वर्णन प्रदर्शित करते हैं।

<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61890/61890fig03.jpg"> चित्रा 3: ऑप्टिकल एक्शन पोटेंशियल (एपी) अलग देशी कार्डियोमायोसाइट्स और मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (आईपीएससी-सीएम) के प्र...

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Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

यहां हम एक उच्च गति मॉड्यूलर फोटोमेट्री सिस्टम का उपयोग करके प्रेरित pluripotent स्टेम सेल व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स से कार्रवाई क्षमता के ऑप्टिकल अधिग्रहण और लक्षण वर्णन करते हैं।

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स में एकल सेल ऑप्टिकल एक्शन संभावित माप

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

तीन आयामी ऑप्टिकल संकल्प Photoacoustic माइक्रोस्कोपी

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

माउस हार्ट में कार्रवाई क्षमता और कैल्शियम यात्रियों के ऑप्टिकल मानचित्रण

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

विकास, विस्तार, और<em&gt; विवो में</em&gt; मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) से मानव एन.के. कोशिकाओं की निगरानी और और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

मांसपेशियों के उत्थान के माउस मॉडल में प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न मेसोंगियोब्लास्ट की तरह मायोजेनिक प्रोजेनिटर का प्रत्यारोपण

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Human iPSC-Derived Cardiomyocyte Networks on Multiwell Micro-electrode Arrays for Recurrent Action Potential Recordings

बार-बार कार्रवाई की क्षमता वाली रिकॉर्डिंग के लिए मल्टीवेल माइक्रो-इलेक्ट्रोड ऐरे पर मानव iPSC-Derived Cardiomycye नेटवर्क

Cardiac safety screening is of paramount importance for drug discovery and therapeutics. Therefore, the development of novel high-throughput ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

पेट की त्वचा और प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल की पीढ़ी से वयस्क मानव डर्मल फाइब्रोब्लास्ट का अलगाव एक गैर एकीकृत विधि का उपयोग कर

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

रासायनिक रूप से परिभाषित परिस्थितियों में मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से परिपक्व गुर्दे Podocytes के निर्देशित भेदभाव

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल गोलाकार ले जाने वाले कोर-शेल माइक्रोकैप्सूल का माइक्रोफ्लुइडिक फैब्रिकेशन

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

इसोजेनिक किडनी ग्लोमेरुलस चिप मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से इंजीनियर

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

Evaluation of Cardiac Contractility Modulation Therapy in 2D Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

2 डी मानव स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स में कार्डियक कॉन्ट्रैक्टिलिटी मॉड्यूलेशन थेरेपी का मूल्यांकन

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are currently being explored for multiple in vitro applications and have been used ...