Name: studying cavitation enhanced therapy
Uploaded: 2021-04-09T13:00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Cavitation Enhanced Therapy at JoVE.com

Авторы благодарят Исследовательский совет по инженерным и физическим наукам за поддержку этой работы через грант EP/L024012/1. VB также поддерживается Исследовательским советом по инженерным и физическим наукам (EPSRC) и Советом по медицинским исследованиям (MRC) (грант EP / L016052/1). VB и AV благодарят Фонд Кларендона за стипендии для аспирантов. AV также благодарит Эксетерский колледж за стипендию Сантандера. Авторы в долгу перед Джеймсом Фиском и Дэвидом Солсбери за их неоценимую помощь в изготовлении аппарата. Они также с благодарностью признают вклад докторов Дарио Каруго и Джошуа Оуэна в разработку более ранних прототипов SATs.

Авторам нечего раскрывать.

Критические шаги для любого акустического измерения были инкапсулированы Апфелем в 1981году 76 как «знай ти жидкость, знай свое звуковое поле, знай, когда что-то происходит». В контексте этого протокола они охватывают калибровку и выравнивание датчиков, а также этапы подготовки воды и обработки пузырьков. Во-первых, важно, чтобы гидрофон, используемый для калибровки датчика привода и/или ПХД, сам по себе был точно откалиброван посредством регулярного внешнего обслуживания или внутреннего сравнения с эталонным стандартом. Аналогичным образом, реакция как датчика привода, так и ПХД должна регулярно характеризоваться для проверки любых изменений в выходе и/или потери чувствительности. Если условия вождения и чувствительность системы к приему неизвестны, то будет невозможно вывести какую-либо значимую связь между условиями воздействия, биоэффектами и акустическими излучениями. Непосредственно в связи с этим необходимо тщательно проверить выравнивание преобразователей друг с другом и камерой для отбора проб, чтобы убедиться, что условия воздействия в камере соответствуют ожидаемым, а объем отбора проб для ПХД соответствует интересуемой области. Как указано, температура и содержание газа в суспендивной среде могут существенно влиять на конечные результаты, и консистенция чрезвычайно важна в этом отношении77,78. Аналогичным образом, подготовка, характеристика и обработка суспензии кавитационного агента требуют очень пристального внимания для обеспечения ожидаемого распределения по размеру и концентрации частиц в образце. Например, если концентрация пузырьков слишком высока, произойдет эффективное экранирование объема образца от падающего поля США. Агенты MB особенно подвержены разрушению и слиянию, и дальнейшие рекомендации по их обращению можно найти в Mulvana et. ал. (2012)79.
Очень распространенной проблемой с обнаружением кавитационных сигналов является достижение адекватного SNR. Это частично связано с природой самого сигнала, как описано, но также может быть связано с источниками электрического шума в экспериментальной установке. Проверка соединений между компонентами системы, в частности с участием коаксиальных кабелей, может помочь устранить некоторые из них. Может потребоваться замена или ремонт коаксиальных кабелей. Идентификация, удаление или деактивация другого оборудования в лаборатории, такого как насосы, которые могут вызвать электрический шум, также может помочь. Плохое согласование электрического импеданса между компонентами системы может быть еще одной причиной плохого соотношения сигнал/шум, а также потенциального повреждения оборудования и должно быть тщательно проверено. Параметры запуска генератора сигналов и осциллографа также должны быть проверены, чтобы убедиться, что они настроены соответствующим образом для эксперимента и не вернулись к настройкам по умолчанию производителя. Если происходит значительное разрушение пузырьков во время обработки, в случае SAT2 может быть полезно прикрепить второй шприц к выходному отверстию и использовать его для осторожного извлечения жидкости из камеры, тем самым втягивая суспензию. Это также может помочь в устранении макропузырьков или обеспечении потока во время воздействия США, если это возможно.
Невозможно полностью устранить акустические отражения в камере образца, и, следовательно, поле падающего не будет полностью однородным по всему объему образца. Как упоминалось на этапах 1.3.2 и 1.3.3, пропускаемость акустических окон будет зависеть от частоты, и поэтому следует тщательно рассмотреть желаемую полосу пропускания для измерений акустической эмиссии. В частности, могут наблюдаться значительные множественные отражения высокочастотных компонентов. Это еще одна причина, по которой калибровка поля в полностью собранной системе так важна для минимизации неопределенности в давлении инцидента. Следует также рассмотреть вопрос о надлежащем обустраивание регистрируемых сигналов для сведения к минимуму последствий множественных отражений. Использование коммерческих устройств для удобства и потребность в акустической прозрачности означает, что некоторая оптическая прозрачность должна быть принесено в жертву. Это может повлиять на качество последующей визуализации, например, для оценки жизнеспособности клеток или поглощения лекарственного средства. Некоторые из мембран, используемых в коммерческих устройствах, также являются пористыми и, таким образом, происходит несовершенная изоляция между камерой для образцов и окружающей водяной баней. Как указано выше, соответствующий риск загрязнения может быть уменьшен с помощью меньшей подкамеры, содержимое которой может регулярно заменяться. Устройства для клеточных культур, указанные в Таблице материалов, подходят в первую очередь для клеточных монослоев, которые могут не быть репрезентативными для тканей с точки зрения всех биоэффектов, опосредованных УЗИ/кавитацией. Близость клеток к твердой поверхности также будет влиять на динамику МБ таким образом, что может не отражать условия in vivo, например, способствуя микропотоку и микроджеттингу, как описано во введении. Однако эти ограничения могут быть устранены путем простой замены альтернативных моделей тканей.
Цель предложения САТ состоит в том, чтобы обеспечить средства повышения воспроизводимости условий акустического воздействия и акустической эмиссии между исследованиями биоэффектов, опосредованных США, что, как мы надеемся, будет способствовать лучшему пониманию основных механизмов и разработке методов мониторинга лечения для повышения безопасности и эффективности. Системы спроектированы таким образом, чтобы быть совместимыми с коммерчески доступными устройствами для культивирования клеток, что позволяет выполнять широкий спектр биологических анализов в соответствии с интересующим применением и позволяет проводить эксперименты с высокой пропускной способностью, устраняя необходимость в трудоемких процедурах выравнивания между прогонами. Стандартизация протоколов для характеристики условий воздействия и улавливания акустических излучений, зависящая от системы изменчивость, как мы надеемся, может быть уменьшена. Диапазон параметров, которые должны быть изучены для конкретного эксперимента, будет зависеть от применения (желаемый биоэффект, тип клетки, глубина ткани-мишени, если in vivo и т. Д.) И характер любого используемого кавитационного агента. Учитывая большое количество переменных (частота США, амплитуда давления, длина импульса, частота повторения импульсов и т.д.), полное изучение всего пространства параметров вряд ли осуществимо. Преимущество предлагаемого протокола заключается в том, что он позволяет быстро установить некоторые границы в этом пространстве параметров. Например, он позволяет определить минимальное давление, при котором генерируется кавитационный сигнал, максимальное давление или длину импульса, которые могут быть использованы до того, как произойдет отслоение/гибель клеток, и давление, при котором производятся дробные гармоники или широкополосный шум. Рекомендуется, чтобы такой набор обзорных измерений проводился в качестве первого шага в любом исследовании.
Как представлено, SATs предназначены для мониторинга акустического излучения в режиме реального времени, при этом биологические анализы выполняются вне эксперимента. Однако было бы относительно просто модифицировать SAT, чтобы обеспечить прямое оптическое наблюдение за камерой образца с помощью объектива микроскопа. Это, в свою очередь, может быть связано с флуоресцентной и/или высокоскоростной системой микроскопии, чтобы, например, можно было наблюдать поглощение лекарств и динамику пузырьков. Выход PCD в том виде, в какой он представлен в настоящее время с точки зрения напряжения, указывает: i) типы кавитационного поведения и их относительные пропорции; ii) как долго сохраняются эти кавитационные поведения; iii) коррелируют ли наблюдаемые кумулятивные по времени характеристики воздействия с конкретным биоэффектом; и iv) согласуются ли относительные уровни и зависящие от времени поведения с предыдущими экспериментами в системе воздействия. Хотя чувствительность приема ПХД может быть количественно определена, для того чтобы достоверно охарактеризовать акустическое излучение с точки зрения абсолютной энергии, требуется дополнительная пространственная информация. Это может быть достигнуто путем замены PCD на массив зонда для реализации пассивного акустического картирования (PAM)80. Это, однако, увеличит сложность обработки сигналов и требуемое вычислительное время и мощность.
Другие приборы для измерения электрического сопротивления мембраны или применения физических методов нацеливания, например магнитных полей, также могут быть включены. Также можно было бы использовать трехмерные тканевые структуры, такие как опухолевые сфероиды, органоиды или даже образцы тканей ex vivo на акустически «мягких» гелевых субстратах вместо клеточных монослоев для изучения УС и кавитационных опосредованных эффектов в более реалистичных тканевых средах.

Ультразвук (США) широко используется в качестве метода диагностической визуализации из-за его безопасного и неинвазивного характера, простоты его реализации у постели пациента и его экономической эффективности1. Наряду со своими диагностическими и мониторинговыми возможностями, США имеет значительный потенциал для терапевтического применения. Ранняя работа исследовала его использование в тромболизе, трансфекции ДНК и доставке лекарств2,3,4 и терапевтических US внастоящее время представляет собой очень активную область исследований, с приложениями, включая лечение опухолей5,6,7,иммунотерапию8,9,нарушение гематоэнцефалического барьера (ГЭБ)10,11,12,тромболизис13,14,15и лечение бактериальных инфекций16,17. Ключевым явлением, лежащим в основе этих применений, является кавитация: зародыш, рост и колебание газообразных полостей из-за изменений давления жидкости18,19.
Существует целый ряд механизмов, с помощью которых кавитация производит биологические эффекты. Например, высоконелинейная природа пузырьковых колебаний под воздействием прикладного поля США может генерировать микропоток в окружающей жидкости, который может как усиливать конвекцию лекарственного средства20, так и оказывать сдвиговые нагрузки на ткани в непосредственной близости от пузырьков. Это особенно распространено, когда пузырьки находятся в непосредственной близости от границы, заставляя пузырьки колебаться несферически, и может потенциально способствовать поглощению лекарственного средства через пермеабилизацию, вызванную сдвигом21,22,23,24. При более высоких давлениях наблюдаются колебания большей амплитуды и быстрый коллапс пузырьков, придающий прямое механическое напряжение25 и часто генерирующий ударные волны, и, как следствие, большие градиенты давления, которые могут нарушать и проникатьв ткани 26,27. Коллапс пузырьков вблизи поверхности также может привести к образованию высокоскоростных жидких микроджетов28,29,30. Эти микроструйные двигатели могут проникать в ткани, потенциально создавая поры или индуцируя вторичные волны напряжения31,32. Пермеабилизация биологических мембран как на тканевом, так и на клеточном уровнях по-разному называется сонофорезом, используемым главным образом в контексте УЗИ-индуцированного повышения проницаемости кожи33,34и сонопорации, используемой в основном для описания обратимой пермеабилизации клеточной мембраны за счет образования мембранных пор35,36.
Вязкое поглощение в жидкости, непосредственно окружающей колеблющийся пузырь, может производить существенный эффект нагрева37. Более того, высоконелинейные колебания производят акустическое излучение на частотах, превышая движущие поля США. Это приводит к усилению всасывания в окружающих тканях и дальнейшему нагреванию38. Коллапс пузырьков также может сопровождаться химическими эффектами из-за переходных высоких температур и давлений в ядре пузыря, таких как генерация высокореактивных веществ и электромагнитного излучения, известного как сонолюминесценция32. Эти эффекты были исследованы для оценки потенциального повреждения и/или активации соответствующих клеточных путей для доставки39 и использованы в локальной активации светочувствительных препаратов в подходе, известном как сонодинамическаятерапия 40,41,42,43.
Многие опосредованные США биоэффекты могут быть инициированы исключительно путем контроля параметров поля США (амплитуда давления, частота, длина импульса и частота повторения, а также продолжительность воздействия), но надежное создание кавитации в биологической ткани часто требует высоких входных энергий и, следовательно, несет повышенный риск повреждения. Введение экзогенных или искусственных кавитационных ядер может существенно снизить входную энергию, необходимую для получения широкого спектра эффектов, рассмотренных выше, и дополнительно вводит дополнительные эффекты, которые могут быть невозможны только с США. Кавитационные ядра включают пузырьки газа26,44,каплижидкости45,46,47 и твердые частицы48,49,50,причем наноразмерные кавитационные ядра являются эмерджентной областью исследования для их преимуществ с точки зрения длительного времени циркуляции, улучшенной экстравазации и длительной кавитационной активности49,51,52,53.
Наиболее часто используемыми ядрами являются газовые микропузырьки (МБ), первоначально использовавшиеся в качестве контрастных веществ в диагностической визуализации. Они обычно имеют диаметр 1-2 микрометра и содержат ядро высокомолекулярного газа с низкой растворимостью в водной среде. Ядро окружено защитной липидной, белковой или полимерной оболочкой, чаще всего состоящей из фосфолипидов54. При воздействии поля США сжимаемость МБ заставляет их подвергаться объемным колебаниям, что приводит к сильному акустическому рассеянию, которое отвечает за успех МБ в качестве контрастного вещества. Как уже упоминалось, эти колебания также приводят к вышеупомянутым механическим, термическим и химическим эффектам, которые могут быть использованы в терапевтических приложениях. Процесс нанесения покрытия MB также предлагает механизм инкапсуляции лекарственных средств в структуру MB и для присоединения лекарственных средств и/или целевых видов к поверхности MB. Данная методика облегчает триггерное высвобождение лекарственных средств для снижения системной токсичности55. Также недавно было показано, что материал с поверхности МБ может быть перенесен в биологические структуры, усиливая доставку лекарств посредством так называемой «сонопечати»56,57,58.
Мониторинг опосредоороженной США кавитационной активности может дать представление о результирующих биологических эффектах как in vitro, так и in vivo и потенциально позволяет настраивать и оптимизировать эти эффекты. Двумя наиболее широко применяемыми методами мониторинга кавитационной активности являются: i) оптические, которые используют сверхскоростную видеомикроскопию и, как правило, неосуществимы invivo; и ii) акустические, которые записывают повторно излучаемые звуковые поля, создаваемые колебающимися и / или коллапсирующими пузырьками. Как амплитудная, так и частотная составляющие акустического сигнала содержат информацию о поведении пузырьков. Было показано, что низкие концентрации пузырьков при низких амплитудах падающего США производят преимущественно гармонические излучения (целые кратные частоте движения)59. По мере увеличения давления привода спектр излучения пузырьков может также содержать дробные компоненты, известные как субгармоники и ультрагармоники60, которые указывают на более сильное нелинейное поведение, а также широкополосный шум, который указывает на инерционную кавитацию. Целочисленные гармоники являются основным индикатором пузырьковых колебаний, но также могут быть вызваны нелинейностью в любом месте экспериментальной системы, например, из-за нелинейного распространения. Напротив, дробные гармоники и широкополосный шум очень сильно коррелируют с динамикой пузырьков.
Взаимосвязь между поведением пузырьков и обнаруженными акустическими излучениями может быть осложнена факторами, включая падающее поле США, среду нуклеации и характеристики пути обнаружения60. Тем не менее, важная информация о поведении пузырьков и их взаимодействиях с клетками может быть получена путем распознавания тенденций частоты и энергии в акустическом спектре. Эти данные также могут предоставить ценную информацию, которая может быть использована для формирования основы для методов клинического мониторинга лечения. Чтобы в полной мере использовать эту информацию, требуется разработка надежных, переводимых и воспроизводимых экспериментальных методов.
В настоящее время существуют значительные различия в протоколах проектирования систем и проведения исследований в поддержку разработки кавитационной терапии. Что касается аппарата, то был предпринят ряд подходов к проектированию. Несколько групп использовали камеры с параллельными пластинами56,61,62,63,либо изготовленные на заказ, либо коммерчески доступные (например, OptiCell, ThermoFisher Scientific). Hu et al. (2013) разработали клеточную камеру в сочетании с модулем ультразвуковой обработки США и конфокальной визуализацией в реальномвремени 64,Carugo et al. (2015) использовали систему, содержащую коммерчески доступную чашку для клеточных культур с изготовленной на заказ крышкой PDMS, чтобы обеспечить погружение в водяную баню во время воздействия65в США, а Pereno et al. (2018) использовали устройство, состоящее из слоистых акустофлюидных резонаторов, которые позволяют одновременно оптическую и акустическую характеристику динамики пузырьков и взаимодействия пузырьковых клеток66. Использование изготовленных на заказ и специфичных для конкретных применений конструкций усложняет характеристику поля США и других условий воздействия окружающей среды, что затрудняет перекрестные сравнения исследований. Например, существуют значительные различия в параметрах США, выявленных для достижения успешной сонопорации, которые включают центральные частоты в диапазоне от 0,02 до 15 МГц, рабочие циклы, варьирующиеся от 1% до непрерывной волны, и разреженные давления в диапазоне от 0,1 до 20МПа 23,64,67,68,69,70 (таблица 1). Существуют также значительные различия в спектральных компонентах (гармониках, субгармониках и т. д.), которые были идентифицированы как связанные с конкретными биоэффектами.
Цель этой работы, таким образом, состоит в том, чтобы обеспечить легко воспроизводимую системную структуру проектирования и реализации для исследования in vitro кавитационных клеточных биоэффектов с конкретным включением возможности кавитационного мониторинга.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absorber</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>APTFlex F28 panel</td>
			<td>1.0 cm standard thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier (power)</td>
			<td>E&#38;I Ltd.</td>
			<td>1040L</td>
			<td>400W power amplifier to drive ultrasound source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier (pre)</td>
			<td>Stanford Research Systems</td>
			<td>SR445A</td>
			<td>Fixed gain multi-stage preamplifier for PCD signals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquarium heater</td>
			<td>Aquael</td>
			<td>Ultra 50W</td>
			<td>Different models for different tank sizes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>TiePie Engineering</td>
			<td>HS5-110-XM</td>
			<td>Extended memory option: 32M points per channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophone</td>
			<td>Precision Acoustics</td>
			<td>FOH</td>
			<td>0.01 mm diameter sensitive area minimises directivity effects</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbubbles</td>
			<td>Bracco</td>
			<td>SonoVue</td>
			<td>FDA approved microbubbles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD mirror (SAT3)</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>F-102</td>
			<td>90 degree beam reflection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD transducer</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>V320-SU</td>
			<td>Immersion transducer, 7.5MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCD waterproof cable</td>
			<td>Olympus NDT</td>
			<td>BCU-58-1 W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (SAT2 compartment lid)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>See Carugo et al. (2015) for preparation guidelines</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymer rod (SAT2 seal)</td>
			<td>Zeus</td>
			<td>PTFE monofilament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber plug (SAT3 lid/seal)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-2101</td>
			<td>6mm bottom dia., 8mm top dia., red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signal generator</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>33250</td>
			<td>Waveform generator for ultrasound source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate for cell exposure compartment, SAT2</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>&#181;-Dish 35mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate for cell exposure compartment, SAT3</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Transwell 6.5mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound source (SAT3)</td>
			<td>Sonic Concepts</td>
			<td>H107 with central hole</td>
			<td>Use of a HIFU-capable source allows pressures &#62;1MPa to be generated both at the focus and pre-focally for expanded spatial coverage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying cavitation enhanced therapy

Интерес к терапевтическому применению ультразвука является значительным и растущим, с потенциальными клиническими целями, начиная от рака до болезни Альцгеймера. Кавитация - образование и последующее движение пузырьков в ультразвуковом поле - представляет собой ключевое явление, лежащее в основе многих из этих методов лечения. Однако сохраняется значительная неопределенность в отношении подробных механизмов действия, с помощью которых кавитация способствует терапевтическому воздействию, и существует необходимость в разработке надежных методов мониторинга, которые могут быть реализованы клинически. В частности, существуют значительные различия между исследованиями в параметрах воздействия, которые, как сообщается, успешно обеспечивают терапевтические эффекты, и соответствующими акустическими излучениями. Целью данной статьи является предоставление руководящих принципов проектирования и экспериментального протокола с использованием широко доступных компонентов для проведения исследований биоэффектов, опосредованных кавитацией, и включение акустического мониторинга в режиме реального времени. Следует надеяться, что протокол позволит более широко включить акустический мониторинг в терапевтические ультразвуковые эксперименты и облегчит сравнение между исследованиями состояний воздействия и их корреляции с соответствующими биоэффектами.

На рисунке 4 показаны примеры реакций PCD во временной и частотной областях, иллюстрирующие три различных кавитационных поведения. Все данные были собраны на SAT3 с использованием SonoVue MBs, разбавленных в 5 раз в PBS, с конечной концентрацией ~2*107 МБ/мл. Температура для всех примеров в этом разделе составляла 19 ± 1 °C. Американский источник приводился в действие импульсом 2,0 мс на частоте 0,5 МГц для достижения пиковых отрицательных давлений 0,20(рисунок 4A и 4B),0,30(рисунок 4C и 4D)и 0,70 МПа(рисунок 4E и 4F). Запись сигнала началась за 1,4 мс до начала импульса США t = 0. Следы вставки показывают сигнал в записанном виде (красный) и с фильтром высоких частот 2 МГц (синий) для временного окна, центрированного во время полета от источника к отсеку воздействия ячейки к PCD. Низкоуровневая реакция до этого времени обусловлена непосредственно полученным излучением от источника, что характерно в конфигурациях, где ПХД находится позади источника в США.
При самом низком падающих давлении отклик PCD полностью состоит из целочисленных гармоник фундаментальной частоты США 0,5 МГц. Увеличение с 0,20 до 0,30 МПа приводит к выраженной ультрагармонии в спектре в дополнение к дальнейшему повышению целочисленных гармоник. Формы сигналов временной области при этих двух давлениях выглядят одинаково, хотя результаты 0,30 МПа показывают большую изменчивость в течение длительности импульса. При самом высоком давлении амплитуда формы сигнала временной области выросла нелинейно относительно более низких давлений в результате явно повышенного широкополосного шума, видимого в спектре. Этот шум обычно считается результатом инерционной кавитации и в этом примере соответствует разрушению МБ.
Чтобы увидеть это более четко, ответы PCD как функция времени показаны на рисунке 5. На левой панели(рисунок 5А)полные спектры показаны в течение 50 секунд времени экспозиции, в течение которого источник излучал 2,0 мс импульсов каждые 0,20 секунды. Соответствующие суммарные, гармонические и широкополосные мощности показаны на правой панели(рисунок 5B). США были включены при t = 3,0 с, в это время были замечены широкополосные ответы с большой амплитудой. Считается, что начальный всплеск соответствует разрушению самых больших пузырьков в суспензии (SonoVue является полидисперсным) и является распространенным наблюдением в кавитационных экспериментах с пузырьками с оболочкой и даже с недетагазированной средой (например, PBS).
Через несколько секунд широкополосный отклик быстро уменьшился, по-видимому, из-за разрушения пузырьков, и сигнал преимущественно состоял из гармоник. Это говорит о том, что освобожденный газ и оставшиеся МБ вибрируют стабильно и неинерциально. При t~50 с широкополосный компонент упал до уровня исходного фонового шума. Поэтому такие тесты воздействия важны при попытке понять временные рамки, в течение которых различные пузырьковые эффекты могут воздействовать на клетки в камере.
Пузырьки, вероятно, будут транслироваться в ответ на силы излучения, генерируемые во время воздействия США, и перемещение МБ в поле зрения ПХД и из него может привести к повышенной изменчивости контролируемого кавитационного сигнала, особенно при работе с разбавленными суспензиями. Поэтому чувствительная область ПХД должна охватывать как можно большую часть поверхности воздействия клеток. Сравнение откликов сфокусированных и несфокусированных ПХД с одинаковыми центральными частотами (см. Рисунок 2)показано на Рисунке 6с использованием разбавления МБ 20:1 в нормальной PBS - SAT2. Спектры времени и усредненные по выборке на панели рисунок 6A показывают, что несфокусированный ПХД содержит более сильный широкополосный отклик, сопровождаемый уменьшенной изменчивостью от образца к образцу как в гармонической(рисунок 6B),так и в ультрагармонической степенях(рисунок 6C).
Важно признать, что среды, используемые для работы клеток in vitro, не дегазированы и могут представлять повышенный фоновый уровень активности пузырьков. На рисунке 7 показан ответ в SAT2 PBS, используемого в предоставленном поставщиком виде и после двух часов дегазации в вакууме, после чего насыщение воздуха было снижено с 92% до 46%, как определено с помощью оптического датчика (PreSens, Германия). Спектры на рисунке 7А были усреднены за время экспозиции и повторены с пятью независимыми образцами, и ясно показывают явно повышенные ультрагармонические показатели в нормальном PBS. Степени, суммированные по трем гармоникам(рисунок 7B),находятся в пределах стандартного отклонения каждого экспериментального выхода. Напротив, ультрагармонические суммы на рисунке 7C показывают, что нормальный PBS имеет почти на порядок более высокий уровень и значительно более высокую изменчивость между выборками. Эти примеры показывают, что общая клеточная среда может демонстрировать поведение, которое может быть (неправильно) отнесено к присутствию МБ. Поскольку обычно нецелесообразно дегазировать культурную среду из-за негативного воздействия на клетки и/или стабильность кавитационного агента, крайне важно выполнить соответствующие контрольные действия в любом исследовании, связанном с кавитацией.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig1.jpg"> Рисунок 1: Иллюстрации двух конструкций систем воздействия США, включающих кавитационный мониторинг: SAT3 (D-F). (A) Аннотированная сборка SAT2 с боковой стенкой, удаленной для ясности. (B) SAT2 с неповрежденной боковой стенкой. (C)Отсек для воздействия ячеек SAT2, в разобранном виде. (D) Аннотированная сборка SAT3. (E)SAT3 в нормальной (слева) и линзированной (справа) конфигурациях для согласования ширины луча на разных частотах. (F)Отсек для воздействия ячеек SAT3, в разобранном виде. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig02.jpg"> Рисунок 2: Расчеты контуров поля полуамплитудного давления для несфокусированных (слева) и сферически сфокусированных (справа) преобразователей диаметром 12,7 мм. Частоты 2, 4 и 8 МГц показаны в виде красных, синих и зеленых контуров соответственно для элемента PCD в начале координат (0,0). Самые внешние контуры несфокусированного устройства относительно нечувствительны к частоте, но внутренняя структура зависит от частоты. Сферически сфокусированное поле сжимается по мере увеличения частоты, но внутри контуров поля плавно меняются. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig03.jpg"> Рисунок 3: Приборы для обработки и записи кавитационного сигнала (синие стрелки), возбуждения источника США (красные линии) и запуска сбора данных. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig04.jpg"> Рисунок 4: Время (слева) и частота (справа) ПХД-откликов, записанных с помощью МБ, разбавленных в 5 раз в PBS. Падающее пиковое отрицательное давление составляло (A, B) 0,2 МПа, (C, D) 0,4 МПа, (E, F) 0,7 МПа, все на частоте 0,5 МГц. Запись сигнала начинается за 1,4 мс до начала t=0 ультразвукового импульса длительностью 2,0 мс. (А, С, Е) Сигналы временной области (красный) отображаются на фиксированной вертикальной шкале, указывающей, как изменяется уровень отклика при давлении инцидента. Следы вставки показывают сигнал в записанном виде (красный) и с фильтром высоких частот 2 МГц (синий) для временного окна, центрированного во время полета от источника к отсеку воздействия ячейки к PCD. (Б, Д, Ф) Спектральные плотности шума и мощности сигнала рассчитаны для t<0 и t>0 соответственно. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig05.jpg"> Рисунок 5: История спектра в течение 50 секунд воздействия суспензии МБ, разбавленной в 5 раз в PBS. (A)Полные спектры и(B)суммарные, гармонические и широкополосные мощности сигнала, все в функции времени. Условия привода: 0,5 МГц, пиковое отрицательное давление 0,7 МПа, длительность импульса 2,0 мс, период повторения импульса 200 мс. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig06.jpg"> Рисунок 6: Эффект геометрии фокусировки ПХД, зарегистрированной при разбавлении микропузырьков 20:1 в нормальной PBS. Условия привода: 1,0 МГц, пиковое отрицательное давление 0,50 МПа, длительность импульса 3,0 мс, период повторения импульса 10 мс. (A) Полные спектры, усредненные за время экспозиции, и три независимых повтора образца. (B) Мощность в гармониках 3, 4 и 5 МГц и (C) мощность в ультрагармониках 2,5, 3,5 и 4,5 МГц. Толстые линии являются образцом, затененные области указывают +/- 1 стандартное отклонение. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61989/61989fig07.jpg"> Рисунок 7: Влияние дегазированных носителей, записанных с помощью PBS. (A) Полные спектры, усредненные за время экспозиции, и пять независимых повторов выборки. (B) Мощность в гармониках 3, 4 и 5 МГц и (C) мощность в ультрагармониках 2,5, 3,5 и 4,5 МГц. Толстые линии являются образцом, затененные области указывают +/- 1 стандартное отклонение. Условия привода: 1,0 МГц, пиковое отрицательное давление 0,50 МПа, длительность импульса 1,0 мс, период повторения импульса 200 мс. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61989/61989fig07large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>параметр</td>
			<td>единица</td>
			<td>минимум</td>
			<td>максимум</td>
		</tr>
<tr>
<td>частота</td>
			<td>МГц</td>
			<td>0.02</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>давление (пиковое отрицательное)</td>
			<td>Мпа</td>
			<td>0.1</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>длина импульса</td>
			<td>Циклов</td>
			<td>1</td>
			<td>Хо</td>
		</tr>
<tr>
<td>рабочий цикл</td>
			<td>%</td>
			<td>1</td>
			<td>Хо</td>
		</tr>
<tr>
<td>время экспозиции</td>
			<td>секунда</td>
			<td>10</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: Сводка диапазона сообщаемых параметров, способствующих сонопорации in vitro.

Watch this Scientific Journal Video about Studying Cavitation Enhanced Therapy at JoVE.com

Studying Cavitation Enhanced Therapy

Представленный экспериментальный протокол может быть использован для выполнения измерений кавитационной активности в реальном времени в устройстве клеточной культуры с целью проведения исследования условий, необходимых для успешной доставки лекарственного средства и/или других биоэффектов.

Изучение кавитационной усиленной терапии

Interest in the therapeutic applications of ultrasound is significant and growing, with potential clinical targets ranging from cancer to ...

Эти принципы проектирования настольных систем, сбора данных и анализа могут быть использованы в качестве рациональной основы для изучения in vitro кавитационной улучшенной терапии. Наши методы обеспечивают высокую пропускную способность тестирования при сохранении критических экспериментальных атрибутов интервального кавитационного мониторинга, повторяемого выравнивания образцов и совместимости с распространенными методами клеточного анализа. Кавитационная усиленная терапия имеет несколько потенциальных применений, включая лечение таких заболеваний, как рак и инсульт.Лучше понимая лежащие в основе механизмы, мы можем разработать лучшие методы лечения. Эта работа обеспечивает легко воспроизводимую структуру проектирования и реализации системы, позволяющую исследовать широкий спектр клеточных биоэффектов, вызванных кавитацией. В том числе доставка лекарств, сонопорация и сонопечать.Получение значимых результатов требует обеспечения воспроизводимости и контроля всех переменных в эксперименте. Крайне важно выполнить все соответствующие элементы управления и измерить электрический шум. Для подготовки систем к акустической трансфекции дегазация заполняемой жидкости под давлением 100 кПа в течение не менее двух часов для минимизации вероятности кавитации в пути распространения.Рекомендуется подтверждение с помощью зонда растворенного кислорода, что парциальное давление кислорода ниже 10 кПа. Медленно заполняйте испытательную камеру, чтобы свести к минимуму повторное введение воздуха в дегазированную жидкость, и немедленно очистите любые остаточные пузырьки с поверхностей датчика и контейнера для среды. Позвольте усилителю мощности ультразвукового источника нагреваться в соответствии с рекомендацией производителя, чтобы коэффициент усиления и выход были стабильными по отношению ко времени.И разбавьте кавитационный агент, мягко и непрерывно перемешивая, чтобы получить однородную суспензию, не заражая макропузырьки и не разрушая агент. При работе с микропузырьками обязательно обрабатывайте их осторожно. Для приготовления SAT2 перед началом эксперимента используйте этанол для стерилизации крышки PDM.Прижмите стерилизованную крышку к чашке для культивирование, чтобы сформировать ячейку отсека и загрузить 10-миллилитровой шприц, оснащенный тупой иглой 18 калибра с 10 миллилитрами заполняемой жидкости. Вставьте иглу через одно из заполненных отверстий PPM и медленно заполняйте камеру при наклоне, чтобы макропузырьки могли выйти через открытое заливное отверстие. Когда камера будет заполнена, вставьте четырех-пятимиллиметровый полимерный стержень в открытое отверстие и расположите узел так, чтобы отверстия были горизонтальными.Извлеките иглу во время впрыскивания дополнительной жидкости, чтобы воздух не втягивается в камеру, и закройте заливное отверстие другим полимерным стержнем. Визуально проверьте отсек на наличие застрявных макропузырьков и прижмите поместить отсек для экспозиции ячейки в держатель отсека. Рассмотрим плавучесть частиц в суспензии и то, как их плавучесть повлияет на их контакт с клетками при принятии решения об ориентации клеточного экспозиционного отсека.Затем, опуская крышку камеры под горизонтальным углом, чтобы предотвратить макропузырьки от покояния на погруженных частях устройства, установите крышку на верхнюю часть камеры. Перед выполнением экспериментальных измерений позвольте суспензии термически уравновесить температуру камеры. Использование тонкоигольчатой термопары для подтверждения того, что температура в камере стабилизировалась.Для мониторинга экспериментов в режиме реального времени, как во временной, так и в частотной областях, запустите процесс сбора данных и включите сигнал источника ультразвука. Используйте высоковольтный зонд для мониторинга выходного сигнала усилителя, который управляет ультразвуковым источником на протяжении всего эксперимента, чтобы гарантировать, что воздействие происходит так, как ожидалось. И убедитесь, что осциллограф настроен на компенсацию затухания зонда.Мониторинг пассивного кавитационного детектора во временной области показывает, соответствуют ли сигналы текущим настройкам приборов и видны ли кавитационные сигналы раньше, чем ожидалось. Мониторинг частотной области позволяет анализировать тип поведения пузырьков и может использоваться для регулировки уровней привода по мере необходимости для достижения желаемого клеточного стимула. В этом анализе при самом низком падающих давлении пассивная реакция детектора кавитации полностью состояла из целочисленных гармоник фундаментальной ультразвуковой частоты 0,5 МГц.Увеличение с 0,2 до 0,3 МПа приводило к выраженным ультрагармоникам в спектре в дополнение к дальнейшему повышенному целочисленным гармоникам. Формы волн во временной области при этих двух давлениях выглядели одинаково, хотя результаты 0,3 МПа продемонстрировали большую изменчивость в течение длительности импульса. При самом высоком давлении амплитуда формы волны во временной области росла нелинейно относительно более низких давлений в результате явно повышенного широкополосного шума, вероятно, из-за инерционной кавитации, вызванной разрушением микропузырьков.Здесь полные спектры показаны в течение 50-секундного времени экспозиции, в течение которого источник излучал два миллисекундных импульса каждые 0,2 секунды. Как видно на этом графике, иллюстрируя соответствующие общие гармонические и широкополосные мощности, широкополосные ответы с большой амплитудой были сгенерированы с первоначальным всплеском, который, как считается, коррелирует с разрушением крупнейших пузырьков. Через несколько секунд широкополосный отклик быстро уменьшается, по-видимому, из-за разрушения пузырьков.В этом анализе с использованием разбавления микропузырьков от 20 до 1 и нормального PBS спектры времени и образца показали, что несфокусированный пассивный детектор кавитации содержал более сильный широкополосный отклик, чем детектор фокусировки. Сопровождается пониженной в выборке образец изменчивостью как в гармонической, так и в ультрагармонической степенях. Биоэффекты, вызванные кавитацией, могут быть оценены с использованием таких методов, как флуоресцентная микроскопия, проточная цитометрия или биологические анализы.Это позволяет установить прочную связь между кавитационной активностью и биологическими эффектами. Этот метод позволил нам лучше идентифицировать взаимосвязи между поведением пузырьков и биологическими эффектами, которые выявили некоторые потенциальные новые механизмы, лежащие в основе кавитационной опосредования доставки лекарств.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Studying Cell Rolling Trajectories on Asymmetric Receptor Patterns

Изучение сотовый Роллинг Траектории на ассиметричные паттерны рецепторов

Lateral displacement of cells orthogonal to a flow stream by rolling on asymmetric receptor patterns presents an opportunity for development of new ...

Utilization of Plasmonic and Photonic Crystal Nanostructures for Enhanced Micro- and Nanoparticle Manipulation

Использование плазмонных наноструктур и фотонных кристаллов для работы с улучшенными микро-и наночастиц Манипуляция

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Endothelialized Microfluidics для изучения взаимодействий в микрососудистой гематологические заболевания

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Микрофлюидных Смесители для изучения сворачивания белков

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

Микрофлюидных устройство для изучения нескольких различных штаммов

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Diagnosis of Neoplasia in Barrett&#8217;s Esophagus using Vital-dye Enhanced Fluorescence Imaging

Diagnosis of Neoplasia in BarrettÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Esophagus using Vital-dye Enhanced Fluorescence Imaging

Диагностика Neoplasia в пищевода Барретта, используя Vital-красителя Enhanced флуоресцентных изображений

The ability to differentiate benign metaplasia in Barrett&#8217;s Esophagus (BE) from neoplasia in vivo remains difficult as both tissue types can be flat ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Синтез наночастиц золота Интегрированный фотография проблематики липосом и измерении их микропузырьков кавитации при импульсном лазерном возбуждении

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Robotic Mirror Therapy System for Functional Recovery of Hemiplegic Arms

Роботизированная система Зеркало терапии для восстановления функций Hemiplegic Arms

Mirror therapy has been performed as effective occupational therapy in a clinical setting for functional recovery of a hemiplegic arm after stroke. It is ...

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation Bubble(s)&#8211;Cell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

A Microfluidic System with Surface Patterning for Investigating Cavitation BubblesÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œCell Interaction and the Resultant Bioeffects at the Single-cell Level

Микрожидком система с поверхности паттернирования для исследования кавитационного пузырька (ы) -клетка взаимодействия и результирующая биоэффектов на уровне одной клетки

In this manuscript, we first describe the fabrication protocol of a microfluidic chip, with gold dots and fibronectin-coated regions on the same glass ...