Name: application of mouse parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute of sperm
Uploaded: 2020-11-19T15:00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm at JoVE.com

نشكر الدكتور جوليو دي مينين على اشتقاق خطوط الكتائب والدكتور ريمو فريمان على عملية قياس التدفق الخلوي. ونعترف أيضا بالسيدة ميشيل شافنر والسيد توماس م. هينيك للدعم التقني في نقل الأجنة. ودعمت هذا العمل المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (المنحة 31003A_152814/1).

<ol>
	<li>Ellegren, H., Galtier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+genetic+diversity.">Determinants of genetic diversity.</a> Nature Reviews: Genetics. 17 (7), 422-433 (2016).</li><li>Huijbers, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+genetically+modified+mice:+A+decision+guide.">Generating genetically modified mice: A decision guide.</a> Methods in Molecular Biology. 1642, 1-19 (2017).</li><li>Aizawa, E., Dumeau, C. E., Freimann, R., Di Minin, G., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+of+semi-cloned+embryos+generated+from+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells.">Polyploidy of semi-cloned embryos generated from parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> PloS One. 15 (9), 0233072 (2020).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+live+transgenic+mice.">Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice.</a> Nature. 490 (7420), 407-411 (2012).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+fertile+bimaternal+offspring+following+intracytoplasmic+injection+of+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells.">Birth of fertile bimaternal offspring following intracytoplasmic injection of parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell Research. 26 (1), 135-138 (2016).</li><li>Wan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+fertile+mice.">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells produce fertile mice.</a> Cell Research. 23 (11), 1330-1333 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+genetically+modified+mice+by+oocyte+injection+of+androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells.">Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell. 149 (3), 605-617 (2012).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+efficiently+support+mouse+generation+by+oocyte+injection.">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells efficiently support mouse generation by oocyte injection.</a> Cell Research. 26 (1), 131-134 (2016).</li><li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+genetics+through+derivation+of+haploid+mouse+embryonic+stem+cells.">Forward and reverse genetics through derivation of haploid mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 563-574 (2011).</li><li>Leeb, M., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+haploid+embryonic+stem+cells+from+mouse+embryos.">Derivation of haploid embryonic stem cells from mouse embryos.</a> Nature. 479 (7371), 131-134 (2011).</li><li>Surani, M. A., Barton, S. C., Norris, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+reconstituted+mouse+eggs+suggests+imprinting+of+the+genome+during+gametogenesis.">Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis.</a> Nature. 308 (5959), 548-550 (1984).</li><li>Li, Z. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bimaternal+and+bipaternal+mice+from+hypomethylated+haploid+ESCs+with+imprinting+region+deletions.">Generation of bimaternal and bipaternal mice from hypomethylated haploid ESCs with imprinting region deletions.</a> Cell Stem Cell. 23 (5), 665-676 (2018).</li><li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+maintenance+of+mouse+haploid+embryonic+stem+cells.">Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Shuai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mammalian+offspring+by+haploid+embryonic+stem+cells+microinjection.">Generation of mammalian offspring by haploid embryonic stem cells microinjection.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 31, 1-15 (2014).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li><li>O'Neill, G. T., Rolfe, L. R., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+potential+and+chromosome+constitution+of+strontium-induced+mouse+parthenogenones.">Developmental potential and chromosome constitution of strontium-induced mouse parthenogenones.</a> Molecular Reproduction and Development. 30 (3), 214-219 (1991).</li><li>Campbell, K. H., McWhir, J., Ritchie, W. A., Wilmut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheep+cloned+by+nuclear+transfer+from+a+cultured+cell+line.">Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line.</a> Nature. 380 (6569), 64-66 (1996).</li><li>Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-term+development+of+mice+from+enucleated+oocytes+injected+with+cumulus+cell+nuclei.">Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.</a> Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).</li><li>Wilmut, I., Schnieke, A. E., McWhir, J., Kind, A. J., Campbell, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+offspring+derived+from+fetal+and+adult+mammalian+cells.">Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.</a> Nature. 385 (6619), 810-813 (1997).</li><li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+frogs+derived+from+the+nuclei+of+single+somatic+cells.">Adult frogs derived from the nuclei of single somatic cells.</a> Developmental Biology. 4, 256-273 (1962).</li><li>Campbell, K. H., Alberio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+the+genome:+role+of+the+cell+cycle.">Reprogramming the genome: role of the cell cycle.</a> Reproduction Supplement. 61, 477-494 (2003).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-mediated+genetic+screening+in+mice+with+haploid+embryonic+stem+cells+carrying+a+guide+RNA+library.">CRISPR-Cas9-mediated genetic screening in mice with haploid embryonic stem cells carrying a guide RNA library.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 221-232 (2015).</li><li>Bai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genetic+screening+in+mice+through+haploid+embryonic+stem+cells+identifies+critical+genes+in+bone+development.">Targeted genetic screening in mice through haploid embryonic stem cells identifies critical genes in bone development.</a> PLoS Biology. 17 (7), 3000350 (2019).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-mediated+base-editing+screening+in+mice+identifies+DND1+amino+acids+that+are+critical+for+primordial+germ+cell+development.">CRISPR-Cas9-mediated base-editing screening in mice identifies DND1 amino acids that are critical for primordial germ cell development.</a> Nature Cell Biology. 20 (11), 1315-1325 (2018).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

استنساخ الثدييات عن طريق نقل الخلايا الجسدية النووية (SCNT) كانت رائدة في 1990s19،20،21. وجاءت هذه التطورات في أعقاب دراسات الاستنساخ التي أجريت قبل 30 عاما فيالبرمائيات 22. ويعكس التأخير الكبير صعوبة علم الأجنة وبصمات الجينوم في الثدييات. تطوير الثدييات SCNT هو الأساس لتطبيق haESC لاستبدال الحيوانات المنوية ، وهو مفصل في هذا البروتوكول.
مزامنة دورة الخلية هو عامل مهم لنجاح SCNT23. وهذا هو الحال أيضا لحقن haESC في هذا البروتوكول. يتطلب إدخال جينوم المتبرع إلى المتلقي مطابقة مراحل دورة الخلية لتجنب الكسر الكروموسومي أو الأنوبلويدات التي من شأنها إلغاء نمو الجنين. شبه الاستنساخ لديه تعقيد إضافي أن اثنين من الجينوم وstoplast تحتاج إلى أن تكون متوافقة. وقد أثبت تقرير سابق أن حقن ال haESCs الاندروجينية المعتقلين في مرحلة M أسفر عن معدلات نمو أفضل للأجنة شبه المستنسخة من حقن haESCs من مرحلة G1 في البويضات7. ويقترح هذا التقرير المرحلة M كنقطة تزامن مناسبة للاستنساخ شبه. وبناء على ذلك، ألقي القبض على الكتائب ميتوتيتشيلي في مرحلة ميتافيزي مع demecolcine وحقنها في ooplasm من البويضات MII، والتي تم القبض عليها بشكل طبيعي في ميتافاز الثاني من الميوسيس. والأهم من ذلك، يمكن تحقيق الاعتقال في المرحلة M في ESCs الماوس بكفاءة عالية، وتوفير تزامن ممتاز بين دورات الخلية المانحة والمتلقية.
أثناء الانقسام ، ينهار الغشاء النووي وأشكال المغزل التي ترتبط بها الكروموسومات المكررة. بعد حقن M-المرحلة DKO-phaESCs، يتم فصل الكروماتيدات الشقيقة إلى جسم قطبي زائف وzygote7 (الشكل 3E). وبالتالي، تساهم مجموعة واحدة من الكروموسومات من DKO-phaESC في الجنين شبه المستنسخ. ومن الأهمية بمكان أن الكروماتيدات الشقيقة للكروموسومات DKO-phaESC يمكن فصلها بشكل صحيح بعد الحقن. غشاء البلازما من DKO-phaESC سليمة يمنع الفصل في الجسم القطبي الزائف. لقد لاحظنا بالفعل حالات نادرة لم يتم فيها تمزق غشاء البلازما في DKO-phaESCs ، وأظهرت الأجنة DKO-phaESCs سليمة في ooplasm بعد الحقن(الشكل 3D). لذلك ، يجب توخي الحذر لإزالة غشاء البلازما من DKO-phaESCs عن طريق الأنابيب. أثناء الحقن ، من المهم بنفس القدر تجنب تعطيل المغزل الميوتيكي للبويضة ، مما قد يؤدي إلى عيوب فصل الكروموسومات والحث على الانسداد أيضا.
في الثدييات ، يحد البصمة الجينومية من تطبيق الكتائب كبديل للحيوانات المنوية. تمتلك haESCs البارثينوجينية تكوينا أموميا من البصمات الجينومية ، في حين تمتلك الحيوانات المنوية تكوينا أبويا. لذلك ، لم يحدث جيل من الجراء على المدى الكامل بعد حقن الكتائب البرية كبديل للحيوانات المنوية. للتغلب على هذا القيد، يتم تصميم عمليات حذف IG- و H19-DMRs في phaESCs. تعديل التعبير المطبوع في Igf2-H19 الأم وGl2-Dlk1 loci كافية لتغيير تكوين بصمات الجينوم للسماح لتوليد الفئران شبه المستنسخة مع وتيرة أكثر من 5.1٪، على أساس الأجنة المنقولة 2 خلية. تشير هذه الملاحظات إلى أن استهداف جينين مطبوعين يحول جينوم الكتائب إلى تكوين أبوي وظيفي يمكن أن يحل محل الحيوانات المنوية في الفئران. ومع ذلك، يلزم إدخال تعديل وراثي دائم على الكتائب من أجل هذه الاستراتيجية. كاستراتيجية بديلة، يمكن النظر في haESC الاندروجينية. وتستمد haESCs الاندروجينية من جينوم الحيوانات المنوية وتمتلك بصمات الأب. كانت هناك تقارير تفيد بأن haESCs الذكورية البرية ساهمت كبديل للحيوانات المنوية لتوليد الجراء على المدى الكامل على تردد يتراوح بين 1.3٪ و 1.9٪ من الأجنة المنقولة4و7و24. كما تم الحصول على الجراء كاملة المدة عن طريق حقن haESCs الاندروجينية مع حذف IG- وH19-DMRs على تردد 20.2٪ من الأجنة المنقولة من 2 خلايا24. ومن المرجح أن تكون زيادة كفاءة شبه الاستنساخ باستخدام مركبات هايسك الاندروجينية المعدلة بسبب عدم استقرار البصمات في الثقافة. يتم تصحيح عيوب الطباعة عن طريق الحذف الوراثي ل DMRs الحرجة.
وبالنظر إلى صعوبة إدخال تعديلات جينية مباشرة على جينوم البويضات أو الحيوانات المنوية، فإن ال haESCs هي أداة قيمة للتلاعب بالجينوم الأبوي بشكل منفصل. استخدام haESCs كبديل للحيوانات المنوية يوفر ميزة ملحوظة لتحرير الجينوم في الجرثومة الماوس. وقد جمعت دراسة حديثة بين تحرير الجينوم القائم على CRISPR/Cas9 وتطبيق haESCs لتوصيف المناطق المطبوعة التي تعتبر حاسمة للتنمية الجنينية12. حللت هذه الدراسة دور Rasgrf1- DMR بالاشتراك مع H19- و IG- DMRs في تطوير الفئران ثنائية اللون ، ووظيفة 7 DMRs مختلفة في تطوير الفئران ثنائية الترنيخ. شكلت طريقة استبدال haESCs للحيوانات المنوية الأساس لنهج الفحص الجيني لتحديد الأحماض الأمينية الرئيسية داخل بروتين DND1 في تطوير الخلايا الجرثومية البدائية وتحديد الجينات في نمو العظام24و25و26. الدراسات على البصمة الجينومية والفحص الجيني لتحديد العوامل الرئيسية في النمو الجنيني هي نهج كبيرة لتطبيق haESCs كجينوم لعبة.

في الثدييات، الأمشاج هي الخلايا الوحيدة التي تنقل المعلومات الوراثية إلى الجيل القادم. الانصهار من البويضات والحيوانات المنوية يشكل الزيغوت diploid التي تتطور إلى بالغ. الطفرات في الجينوم gametic وبالتالي ورثت من قبل النسل ودفع الاختلاف الجيني في الأنواع1. وقد تم تطبيق إدخال الطفرات في الجرثومة لإنتاج الحيوانات المعدلة وراثيا لدراسات بيولوجية متنوعة بما في ذلك توصيف وظيفة الجينات ونمذجة الأمراض. كل من البويضات والحيوانات المنوية هي خلايا متمايزة بشكل ميؤوس منه ومتخصصة للغاية توقفت عن الانتشار. ولذلك ، فإن التعديل المباشر ل gametes صعب من الناحية الفنية ، وتم تطوير نهج متخصصة. ويمكن إدخال تعديلات جينية في الجرثومة الماوس عن طريق حقن ESCs المعدلة وراثيا في الكيسات الأريمية، حيث أنها تندمج في الجنين النامية واستعمار الجرثومة. بالإضافة إلى ذلك ، أصبح التعديل الوراثي للzygotes باستخدام نهج تحرير الجينوم ، بما في ذلك نظام CRISPR / Cas9 ، معتمدا على نطاق واسع2.
في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن نهج متميز ، والذي يطبق haESCs كبديل لجينوم gametic3،4،5،6،7،8. HaESCs هي خطوط الخلايا الجذعية المستمدة من كتلة الخلية الداخلية من الكيسات الأريمية الهابلويدية البارثينوجينية أو الاندروجينية وتمتلك مجموعة واحدة من الكروموسومات4و7و9و10. وقد ثبت أن كلا من haESCs البارثينوجينية والدروجينية يمكن أن تسهم في جينوم الفئران شبه المستنسخة بعد الحقن داخل السيتوبلازمي في البويضات. وعلى النقيض من النهج الأخرى، يمكن تعديل جينوم الهايسك مباشرة في الثقافة بسبب قدرتها على التجديد الذاتي. إدخال التعديلات الوراثية في الجرثومة عن طريق استبدال الحيوانات المنوية مع haESCs هو وسيلة هامة للدراسات البيولوجية. وهو ينص على إمكانية زراعة الجينوم الأمومي أو الأبوي والتعامل معه بشكل منفصل، وهو مستمد من ال haESCs البارثينوجينية أو الاندروجينية، على التوالي. ويمكن بعد ذلك استخدام HaESCs كبديل الجينوم gametic ، وهو أمر مفيد بشكل خاص لدراسات الطباعة الجينومية ، والتعبير عن أليل محددة ، والعمليات الخاصة الأبوية.
في الفئران ، مطلوب كل من المعلومات الجينومية الأمومية والأبية لنمو الجنين الطبيعي11. لذلك ، لم يكن من الممكن الحصول على الجراء كاملة الأجل عندما تم حقن ال haESCs البارثينوجينية البرية (phaESCs) لتحل محل جينوم الحيوانات المنوية5،8. للتغلب على كتلة النمو، يجب تصحيح البصمة الجينومية لجينوم الأم من ال haESCs البارثينوجينية إلى تكوين أبوي. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق التلاعب بالمناطق المثيلية المتمايزة. حتى الآن ، تم دراسة عمليات الحذف المستهدفة من H19- DMR ، Gtl2 - Dlk1 IG- DMR ، وRasgrf1- DMR لقمع الجينات المعبر عنها الأمهات في phaESCs3،5،8،12. أثبتت هذه الدراسات أن حذف كل من H19-DMR و IG-DMR كافية لتحويل الأم إلى تكوين بصمة أبوية يمكن أن تحل محل كروموسومات الحيوانات المنوية. الحقن داخل السيتوبلازمي من الكتائب التي تحمل حذف DMR اثنين في البويضات أسفرت عن الجراء شبه المستنسخة مع تردد بين 5.1٪ و 15.5٪ من الأجنة المنقولة من 2 خلية.
ويستند هذا البروتوكول على تطبيق phaESCs مع حذف كل من H19-DMR و IG-DMR، والتي نقوم بعبارة phaESCs بالضربة القاضية المزدوجة (DKO-phaESCs). نحن نقدم تعليمات مفصلة لتعديل البصمة الجينومية في الكتائب لإنشاء خطوط DKO-phaESC ، لحقن DKO-phaESCs في البويضات كبديل لجينوم الحيوانات المنوية ، لثقافة الأجنة شبه المستنسخة إلى الكيسات الأريمية ، والحصول على الفئران شبه المستنسخة. هذا البروتوكول هو مرجع للباحثين الذين يحتاجون إلى تلاعب دقيق ومباشر في الجينوم الأبوي وتوليد الأجنة والفئران شبه المستنسخة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mLTube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.150</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150628</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M6250</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA fraction</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR 99021</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1386</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Demecolcine solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D1925</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM / F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DR4 mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>3208</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E5134</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>biowest</td>
			<td>S1810-500</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium</td>
			<td>amsbio</td>
			<td>11897</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G1890</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irradiated MEF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A34966</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF (Leukemia inhibitory factor)</td>
			<td>(Homemade)</td>
			<td>-</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDiff 227</td>
			<td>Takara</td>
			<td>Y40002</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 0325901</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1408</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#40973</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piggyBac transposase plasmid</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>PB210PA-1</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX330 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#42230</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX458 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#48138</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F549S</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0192</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100317</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109634</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Axon</td>
			<td>A3830</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71729</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Epeendorf</td>
			<td>5384000012</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Tube with cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios EQ</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.1640</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-gauge 1/2 inch needle</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z192362-100EA</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6D2F1 mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>100006</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG</td>
			<td>MSD animal health</td>
			<td>49451</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010015</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG</td>
			<td>Avivasysbio</td>
			<td>OPPA1037 5000 IU</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179830</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Center-well dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3260</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital rocker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880020</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0878</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H4272</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MR-020P-5F</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M16 medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7292</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7167</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P1049-1PAK</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strontium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>13909</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.5607</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass cappilary</td>
			<td>Science product</td>
			<td>GB100T-8P</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram 4r Oil</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5196000030</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorinert FC-770</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F3556</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipette</td>
			<td>BioMedical Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-U</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-900</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pipette</td>
			<td>BioMedical Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlaoder tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252 956.003</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulaor arms</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>NT-88-V3</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PiezoXpert</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5194000016</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVP (Polyvinylpyrrolidine)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PVP360</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of mouse parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute of sperm

في الكائنات الحية مع التكاثر الجنسي، والخلايا الجرثومية هي مصدر الخلايا totipotent التي تتطور إلى أفراد جدد. في الفئران ، وتخصيب البويضات من قبل spermatozoon يخلق zygote totipotent. في الآونة الأخيرة، ذكرت العديد من المنشورات أن الخلايا الجذعية الجنينية haploid (haESCs) يمكن أن تكون بديلا عن الجينوم الجامدي وتسهم في الأجنة، التي تتطور إلى فئران. هنا، نقدم بروتوكولا لتطبيق haESCs البارثينوجينية كبديل للحيوانات المنوية لبناء الأجنة عن طريق الحقن داخل السيتوبلازمي في البويضات. يتكون هذا البروتوكول من خطوات لإعداد haESCs كبديل للحيوانات المنوية ، وحقن كروموسومات haESC في البويضات ، وزراعة الأجنة شبه المستنسخة. يمكن للأجنة أن تنتج فئرانا شبه مستنسخة خصبة بعد نقل الأجنة. استخدام haESCs كبديل للحيوانات المنوية يسهل تحرير الجينوم في الجرثومة ، ودراسات التطور الجنيني ، والتحقيق في البصمة الجينومية.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm at JoVE.com

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

تهدف هذه المقالة إلى إظهار استخدام الخلايا الجذعية الجنينية الهيمونوجينية كبديل للحيوانات المنوية لبناء أجنة شبه مستنسخة.

تطبيق الماوس البارثينوجينيك Haploid الخلايا الجذعية الجنينية كبديل للحيوانات المنوية

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

اشتقاق خلايا القلب السلف من الخلايا الجذعية الجنينية

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

التمايز العصبي للماوس الخلايا الجذعية الجنينية في المصل خالية أحادي الطبقة الثقافة

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

توليد كريسبر / Cas9 ساطة Monoallelic الحذف لدراسة وظيفة محسن في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

عزل خلايا الفئران الجنينية مكون للدم غشائي

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

إنتاج الخلايا الجذعية المحفزة من الفأر الأمنيوسي الخلايا السوائل عن طريق نظام ينقول

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

الدراسات هيكل الوظائف في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس عن طريق بوساطة Recombinase-كاسيت تبادل

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

أفقي جبل كامل: A معالجة الرواية والتصوير بروتوكول للثدي، ثلاثة-- الأبعاد الأنسجة عبر-- أقسام الجلد

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

في المختبر توليد المشتقات سميط من البشرية التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

البطانة الظهارة الظهارية الظهارة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات في حالة محددة خالية من التغذية وXeno

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...