Name: application of mouse parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute of sperm
Uploaded: 2020-11-19T15:00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm at JoVE.com

Vi takker Dr. Giulio Di Minin for avledning av phaESC linjer og Dr. Remo Freimann for strømning cytometri drift. Vi anerkjenner også Ms. Michèle Schaffner og Mr. Thomas M. Hennek for teknisk støtte med embryooverføring. Dette arbeidet ble støttet av Swiss National Science Foundation (tilskudd 31003A_152814/1).

<ol>
	<li>Ellegren, H., Galtier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+genetic+diversity.">Determinants of genetic diversity.</a> Nature Reviews: Genetics. 17 (7), 422-433 (2016).</li><li>Huijbers, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+genetically+modified+mice:+A+decision+guide.">Generating genetically modified mice: A decision guide.</a> Methods in Molecular Biology. 1642, 1-19 (2017).</li><li>Aizawa, E., Dumeau, C. E., Freimann, R., Di Minin, G., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+of+semi-cloned+embryos+generated+from+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells.">Polyploidy of semi-cloned embryos generated from parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> PloS One. 15 (9), 0233072 (2020).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+live+transgenic+mice.">Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice.</a> Nature. 490 (7420), 407-411 (2012).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+fertile+bimaternal+offspring+following+intracytoplasmic+injection+of+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells.">Birth of fertile bimaternal offspring following intracytoplasmic injection of parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell Research. 26 (1), 135-138 (2016).</li><li>Wan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+fertile+mice.">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells produce fertile mice.</a> Cell Research. 23 (11), 1330-1333 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+genetically+modified+mice+by+oocyte+injection+of+androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells.">Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell. 149 (3), 605-617 (2012).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+efficiently+support+mouse+generation+by+oocyte+injection.">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells efficiently support mouse generation by oocyte injection.</a> Cell Research. 26 (1), 131-134 (2016).</li><li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+genetics+through+derivation+of+haploid+mouse+embryonic+stem+cells.">Forward and reverse genetics through derivation of haploid mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 563-574 (2011).</li><li>Leeb, M., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+haploid+embryonic+stem+cells+from+mouse+embryos.">Derivation of haploid embryonic stem cells from mouse embryos.</a> Nature. 479 (7371), 131-134 (2011).</li><li>Surani, M. A., Barton, S. C., Norris, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+reconstituted+mouse+eggs+suggests+imprinting+of+the+genome+during+gametogenesis.">Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis.</a> Nature. 308 (5959), 548-550 (1984).</li><li>Li, Z. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bimaternal+and+bipaternal+mice+from+hypomethylated+haploid+ESCs+with+imprinting+region+deletions.">Generation of bimaternal and bipaternal mice from hypomethylated haploid ESCs with imprinting region deletions.</a> Cell Stem Cell. 23 (5), 665-676 (2018).</li><li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+maintenance+of+mouse+haploid+embryonic+stem+cells.">Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Shuai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mammalian+offspring+by+haploid+embryonic+stem+cells+microinjection.">Generation of mammalian offspring by haploid embryonic stem cells microinjection.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 31, 1-15 (2014).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li><li>O'Neill, G. T., Rolfe, L. R., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+potential+and+chromosome+constitution+of+strontium-induced+mouse+parthenogenones.">Developmental potential and chromosome constitution of strontium-induced mouse parthenogenones.</a> Molecular Reproduction and Development. 30 (3), 214-219 (1991).</li><li>Campbell, K. H., McWhir, J., Ritchie, W. A., Wilmut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheep+cloned+by+nuclear+transfer+from+a+cultured+cell+line.">Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line.</a> Nature. 380 (6569), 64-66 (1996).</li><li>Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-term+development+of+mice+from+enucleated+oocytes+injected+with+cumulus+cell+nuclei.">Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.</a> Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).</li><li>Wilmut, I., Schnieke, A. E., McWhir, J., Kind, A. J., Campbell, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+offspring+derived+from+fetal+and+adult+mammalian+cells.">Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.</a> Nature. 385 (6619), 810-813 (1997).</li><li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+frogs+derived+from+the+nuclei+of+single+somatic+cells.">Adult frogs derived from the nuclei of single somatic cells.</a> Developmental Biology. 4, 256-273 (1962).</li><li>Campbell, K. H., Alberio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+the+genome:+role+of+the+cell+cycle.">Reprogramming the genome: role of the cell cycle.</a> Reproduction Supplement. 61, 477-494 (2003).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-mediated+genetic+screening+in+mice+with+haploid+embryonic+stem+cells+carrying+a+guide+RNA+library.">CRISPR-Cas9-mediated genetic screening in mice with haploid embryonic stem cells carrying a guide RNA library.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 221-232 (2015).</li><li>Bai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genetic+screening+in+mice+through+haploid+embryonic+stem+cells+identifies+critical+genes+in+bone+development.">Targeted genetic screening in mice through haploid embryonic stem cells identifies critical genes in bone development.</a> PLoS Biology. 17 (7), 3000350 (2019).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-mediated+base-editing+screening+in+mice+identifies+DND1+amino+acids+that+are+critical+for+primordial+germ+cell+development.">CRISPR-Cas9-mediated base-editing screening in mice identifies DND1 amino acids that are critical for primordial germ cell development.</a> Nature Cell Biology. 20 (11), 1315-1325 (2018).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Kloning av pattedyr ved somatisk celle kjernefysisk overføring (SCNT) har vært banebrytende på 1990-tallet19,20,21. Denne utviklingen fulgte kloning studier utført 30 år tidligere i amfibier22. Den betydelige forsinkelsen gjenspeiler vanskeligheten med embryologi og genomisk avtrykk hos pattedyr. Utviklingen av pattedyr SCNT er grunnlaget for anvendelsen av haESC for å erstatte sæd, som er detaljert i denne protokollen.
Cellesyklussynkronisering er en viktig faktor for suksessen til SCNT23. Dette er også tilfelle for injeksjon av haESC i denne protokollen. Å introdusere et donorgenom i en mottaker krever at cellesyklusfasene tilpasses for å unngå kromosomal brudd eller aneuploidier som vil avvike embryoutvikling. Semi-kloning har den ekstra kompleksiteten som to genomer og en cytoplast må være kompatible. En tidligere rapport har vist at injeksjon av M-fase-arresterte androgenetiske heSCCer ga bedre utviklingsrater av halvkloste embryoer enn injeksjon av G1-fase haESC i oocytter7. Denne rapporten foreslår M-fase som et passende synkroniseringspunkt for halvkloning. Følgelig ble phaESCs mitotically arrestert i metafase med demecolcine og injisert i ooplasma av MII oocytter, som naturlig ble arrestert i metafase II av meiosis. Viktigst, M-fase arrestasjon kan oppnås i mus ESCs med høy effektivitet, noe som gir utmerket synkronisering mellom donor og mottaker celle sykluser.
Under mitose bryter atommembranen ned og en spindel dannes som de replikerte kromosomene festes til. Etter injeksjon av M-fase DKO-phaESCs, søster kromotider er segregert i en pseudo polar kropp og zygote7 (Figur 3E). Følgelig bidrar et enkelt sett med kromosomer fra en DKO-phaESC til det halvkloste embryoet. Det er kritisk at søsterkromotider av DKO-phaESC-kromosomer kan skilles riktig etter injeksjon. Plasmamembranen til en intakt DKO-phaESC forhindrer segregering i en pseudo polar kropp. Vi observerte faktisk sjeldne tilfeller der plasmamembranen til DKO-phaESCs ikke ble revnet, og embryoer viste intakte DKO-phaESCs i ooplasma etter injeksjon (Figur 3D). Derfor må det tas hensyn til å fjerne plasmamembranen til DKO-phaESCs ved pipettering. Under injeksjonen er det like viktig å unngå forstyrrelsen av den meiotiske spindelen av oocytten, noe som kan føre til kromosomsegregeringsfeil og indusere aneuploidy også.
Hos pattedyr begrenser genomisk avtrykk anvendelsen av phaESCs som sæderstatning. Parthenogenetic haESCs har en mors konfigurasjon av genomiske avtrykk, mens sæd har en farskonfigurasjon. Derfor har generering av fulltids valper ikke skjedd etter injeksjon av wildtype phaESCs som sædutskifting. For å overvinne denne begrensningen er slettinger av IG- og H19-DMRs konstruert i phaESCs. Modifikasjon av avtrykket uttrykk på mors Igf2-H19 og Gtl2-Dlk1 loci er tilstrekkelig til å endre konfigurasjonen av genomiske avtrykk for å tillate generering av halvkloste mus med en frekvens på over 5,1%, basert på overførte 2-cellers embryoer. Disse observasjonene tyder på at målretting av to trykte gener bytter genomet til phaESCs til en funksjonell farskonfigurasjon som kan erstatte sæd hos mus. Likevel er det nødvendig med en permanent genetisk modifikasjon av phaESCs for denne strategien. Som en alternativ strategi kan androgenetisk heESC vurderes. Androgenetic haESCs er avledet fra sperm genomet og har farsavtrykk. Det har vært rapporter om at wildtype androgenetic haESCs bidro som sæderstatning for å generere fulltids valper med en frekvens mellom 1,3% og 1,9% av overførte embryoer4,7,24. Fulltids valper har også blitt oppnådd ved å injisere androgenetiske haESCer med sletting av IG- og H19-DMRs med en frekvens på 20,2% av overførte 2-cellers embryoer24. Den økte effektiviteten ved halvkloning ved hjelp av modifiserte androgenetiske heSCCer er sannsynligvis fordi avtrykk kan bli ustabile i kulturen. Avtrykksfeil korrigeres ved genetisk sletting av kritiske DMRs.
Tatt i betraktning vanskeligheten med å introdusere genetiske modifikasjoner direkte i oocytten eller sædgenomene, er haESC et verdifullt verktøy for å manipulere foreldregenomene separat. Å bruke haESCs som erstatning for sæd gir en bemerkelsesverdig fordel for genomredigering i musens bakterie. En nylig studie har kombinert CRISPR / Cas9-basert genomredigering med anvendelse av haESC for karakterisering av avtrykksregioner som er kritiske for embryonal utvikling12. Denne studien analyserte Rasgrf1-DMRsrolle i kombinasjon med H19-og IG-DMRs i utviklingen av bimaternale mus, og funksjonen til 7 forskjellige DMRs i utviklingen av topaternale mus. Metoden for å erstatte heSCCs for sperm dannet grunnlaget for genetisk screening tilnærminger for å identifisere viktige aminosyrer i DND1-proteinet i primordial bakteriecelleutvikling og for å identifisere gener i beinutvikling24,25,26. Studier på genomisk avtrykk og genetisk screening for å identifisere nøkkelfaktorer i embryonisk utvikling er betydelige tilnærminger for anvendelse av heSCcs som spillgenomer.

Hos pattedyr er gameter de eneste cellene som overfører genetisk informasjon til neste generasjon. Fusjon av en oocytt og en spermatozoon danner en diploid zygote som utvikler seg til et voksent dyr. Mutasjoner i spillgenomer arves dermed av avkom og driver genetisk variasjon i art1. Innføring av mutasjoner i bakterien er anvendt for å produsere genmodifiserte dyr for ulike biologiske studier, inkludert karakterisering av genfunksjon og sykdomsmodellering. Både oocytter og spermatozoer er terminalt differensierte og høyt spesialiserte celler som har opphørt spredning. Derfor er direkte modifikasjon av gameter teknisk vanskelig, og spesialiserte tilnærminger er utviklet. Genetiske modifikasjoner kan innføres i musens bakterie ved injeksjon av genetisk modifiserte ESCer i blastocyster, hvor de integreres i det utviklende embryoet og koloniserer bakterien. I tillegg har genetisk modifikasjon av zygoter ved hjelp av genomredigeringsmetoder, inkludert CRISPR / Cas9-systemet, blitt allment vedtatt2.
Nylig har det blitt rapportert en enestående tilnærming, som gjelder haESCer som erstatning for et spillgenom3,4,5,6,7,8. HaESC er stamcellelinjer avledet fra den indre cellemassen av parthenogenetiske eller androgenetiske haploide blastocytter og har et enkelt sett med kromosomer4,7,9,10. Det har vist seg at både parthenogenetiske og androgenetiske heSCCer kan bidra til genomet av halvkloonede mus etter intracytoplasmisk injeksjon i oocytter. I motsetning til andre tilnærminger kan genomene til haESC-er endres direkte i kulturen på grunn av deres selvfornyelseskapasitet. Å introdusere genetiske modifikasjoner i bakterien ved å erstatte sæd med haESC er en viktig metode for biologiske studier. Det gir mulighet for separat kultur og manipulere mors eller farsgenom, som er avledet fra henholdsvis parthenogenetiske eller androgenetiske heSCCer. HaESC-er kan deretter brukes som gametisk genomerstatning, noe som er spesielt fordelaktig for studier av genomisk avtrykk, allelspesifikk uttrykk og foreldrespesifikke prosesser.
Hos mus er både mors og faderlig genomisk informasjon nødvendig for normal embryoutvikling11. Derfor kunne ikke fulltids valper oppnås når wild-type parthenogenetic haESCs (phaESCs) ble injisert for å erstatte sperm genomet5,8. For å overvinne utviklingsblokken må genomisk avtrykk av mors genom av parthenogenetiske heSCCer korrigeres til en farskonfigurasjon. Dette kan oppnås ved manipulering av differensialt metylerte regioner (DMRs). Til dags dato har målrettede slettinger av H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR og Rasgrf1-DMR blitt studert for å undertrykke maternalt uttrykte gener i phaESCs3,5,8,12. Disse studiene viste at sletting av både H19-DMRog IG-DMR er tilstrekkelig til å konvertere en mors til en paternal avtrykkskonfigurasjon som kan erstatte sædkromosomer. Intracytoplasmatisk injeksjon av phaESCs som bærer de to DMR-slettingene inn i oocytter, ga halv klonede valper med en frekvens mellom 5,1% og 15,5% av overførte 2-cellers embryoer.
Denne protokollen er basert på anvendelsen av phaESCs med slettinger av både H19-DMR og IG-DMR, som vi betegner dobbelt knockout phaESCs (DKO-phaESCs). Vi gir detaljerte instruksjoner for modifikasjon av genomisk avtrykk i phaESCs for å etablere DKO-phaESC linjer, for injeksjon av DKO-phaESCs i oocytter som en erstatning for et sperm genom, for kultur av semi-klonede embryoer til blastocyster, og for å oppnå semi-klonede mus. Denne protokollen er en referanse for forskere som krever presis og direkte manipulering av farsgenomet og generering av halvklonerte embryoer og mus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mLTube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.150</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150628</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M6250</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA fraction</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR 99021</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1386</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Demecolcine solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D1925</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM / F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DR4 mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>3208</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E5134</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>biowest</td>
			<td>S1810-500</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium</td>
			<td>amsbio</td>
			<td>11897</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G1890</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irradiated MEF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A34966</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF (Leukemia inhibitory factor)</td>
			<td>(Homemade)</td>
			<td>-</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDiff 227</td>
			<td>Takara</td>
			<td>Y40002</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 0325901</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1408</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#40973</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piggyBac transposase plasmid</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>PB210PA-1</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX330 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#42230</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX458 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#48138</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F549S</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0192</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100317</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109634</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Axon</td>
			<td>A3830</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71729</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Epeendorf</td>
			<td>5384000012</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Tube with cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios EQ</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.1640</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-gauge 1/2 inch needle</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z192362-100EA</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6D2F1 mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>100006</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG</td>
			<td>MSD animal health</td>
			<td>49451</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010015</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG</td>
			<td>Avivasysbio</td>
			<td>OPPA1037 5000 IU</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179830</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Center-well dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3260</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital rocker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880020</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0878</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H4272</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MR-020P-5F</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M16 medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7292</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7167</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P1049-1PAK</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strontium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>13909</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.5607</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass cappilary</td>
			<td>Science product</td>
			<td>GB100T-8P</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram 4r Oil</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5196000030</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorinert FC-770</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F3556</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipette</td>
			<td>BioMedical Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-U</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-900</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pipette</td>
			<td>BioMedical Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlaoder tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252 956.003</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulaor arms</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>NT-88-V3</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PiezoXpert</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5194000016</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVP (Polyvinylpyrrolidine)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PVP360</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of mouse parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute of sperm

I organismer med seksuell reproduksjon er bakterieceller kilden til totipotente celler som utvikler seg til nye individer. Hos mus skaper befruktning av en oocytt av en spermatozoon en totipotent zygote. Nylig har flere publikasjoner rapportert at haploide embryonale stamceller (heSC) kan være en erstatning for spillgenomer og bidra til embryoer, som utvikler seg til mus. Her presenterer vi en protokoll for å bruke parthenogenetiske heSCCer som erstatning for sæd for å konstruere embryoer ved intracytoplasmatisk injeksjon i oocytter. Denne protokollen består av trinn for å forberede haESC som sæderstatning, til injeksjon av haESC-kromosomer i oocytter og for kultur av halvkloste embryoer. Embryoene kan gi fruktbare halvkloste mus etter embryooverføring. Bruk av haESC som sæderstatning letter genomredigering i bakterien, studier av embryonal utvikling og undersøkelse av genomisk avtrykk.

Formålet med denne protokollen er å bruke haESCs som erstatning for sæd for å oppnå halvkloste embryoer og mus. Til dette formål ble en DKO-phaESC-linje som bærer CAG-EGFP-transgene generert og brukt til intracytoplasmatisk injeksjon i MII oocytter. For å oppnå en passende phaESC-linje med en paternal avtrykkskonfigurasjon, utførte vi genteknologi ved hjelp av Cas9-nukleaser. En haploid ESC-linje inneholder haploide og diploide celler som oppstår på grunn av en iboende tendens til haploide ESCer for diploidisering10. Et haploid kromosomsett er en forutsetning for vellykket utskifting av sædgenomet. DNA-innholdsanalyse ved strømningscytometri viser fordelingen av haploide og diploide celler ved G0/G1-, S- og G2/M-faser (figur 2A).
For å etablere DKO-phaESC-linjene ble wildtype phaESC-linjer transfektet med piggyBac transposonkonstruksjoner for stabilt transgent EGFP-uttrykk og med CRISPR / Cas9-plasmider for å oppnå sletting av H19- og IG-DMRs. Hvis du vil utelate diploide ESCer og isolere bare haploide ESCer som uttrykker EGFP, ble det definert en bestemt sorteringsport (figur 2A). Enkelthaploide EGFP-positive celler ble deretter belagt i individuelle brønner på 96-brønnsplater for å oppnå underkloner. MEF-matere ble brukt til å øke platingeffektiviteten og overlevelsen til de transfekterte phaESCene. Etter utvidelse av kulturene ble en innledende runde med genotyping utført av PCR for å identifisere underkloner som bærer sletting av begge DMRs. Etter at MEF-matere hadde blitt fjernet fra kulturene, ble det utført en ny genotyping for å bekrefte fraværet av wildtype-alleler på H19- og IG-DMRs (Figur 2B). Fra totalt 135 underkloner fikk vi 5 haploide DKO-phESC-linjer som bar de slettede allelene og var fri for wildtype-alleler av både H19-DMR og IG-DMR.
En CAG-EGFP-transgene ble introdusert i DKO-phaESCs for å studere deres bidrag til semi-klonede embryoer ved visualisering av grønn fluorescens under et mikroskop (Figur 3A). For intracytoplasmatisk injeksjon ble DKO-phaESCs behandlet med demecolcine for å arrestere dem i M-fase. Dermed ble cellesyklusen til DKO-phaESCs synkronisert med MII-oocytter. Flow cytometrianalyse viste 2 populasjoner tilsvarende G2/M fase arrestert haploid (2n) og diploidceller (4n) etter behandling med demecolcin (Figur 3B). Fraværet av den 1n haploide toppen indikerte at cellesyklusstansen i stor grad var fullført. M-fase haploid ESCs ble deretter sortert og injisert i oocytter. For dette ble en enkelt DKO-phaESC lastet inn i mikroinjeksjonspipetten og injisert i cytoplasma av en MII oocyte (Figur 3C). Plasmamembranen til DKO-phaESC ble revnet ved pipettering i spissen av mikroinjeksjonspipetten.
Etter injeksjonen ble EGFP-uttrykket sjelden påvist i de konstruerte semi-klonede embryoene da cytoplasmaet til DKO-phaESCs hadde spredt seg i den store cytoplasma av oocytten (Figur 3D). I sjeldne tilfeller kan et rundt punkt med intens EGFP-uttrykk observeres i ooplasma. Denne observasjonen var sannsynligvis forårsaket av utilsiktet injeksjon av intakte DKO-phaESCs. Unnlatelse av å sprekke DKO-phaESC cellemembranen er sannsynligvis ikke kompatibel med videre embryoutvikling og bør unngås. En time etter injeksjonen ble embryoer aktivert ved behandling med strontiumklorid18. Seks timer etter aktiveringen ble det observert opptil 3 polarlegemer under mikroskopet (figur 3E). Disse polarlegemene tilsvarer den første og andre polare kroppen av oocytten og en pseudo polar kropp fra DKO-phaESC7. I tillegg ble to pronuclei observert under et differensialinterferenskontrastmikroskop, som lignet det pronukleære stadiet av zygoter etter normal befruktning med sædceller.
For å demonstrere utviklingskompetanse ble halvklossede embryoer dyrket til blastocyststadiet (figur 5A). Videre ble en fulltidsmus oppnådd etter overføring av halv klonede 2-cellers stadium embryoer til oviduktene til en mottaker kvinne (Figur 5B). Som forventet var musen avledet fra et semi-klonet embryo en kvinne da verken oocytter eller oocyttavlede phaESCs bærer et Y-kromosom. Den halv klonede musen var altfor normal og produserte sunne avkom når den var parret med en wildtype Swiss Webster-mann. Inntil nå har den halvkloste musen vært i live i over 600 dager uten tilsynelatende helseproblemer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig01v3.jpg"> Figur 1: Oversikt over anvendelsen av DKO-phaESCs som sædutskifting. (A) En tidsramme for prosedyrene i protokollen. (B) Oppsettet viser trinnene for å opprette DKO-phaESC-linjer (trinn 1–6). (C) Ordningen viser trinnene for å konstruere halvklomet embryoer ved intracytoplasmatisk injeksjon av en DKO-phaESC i en MII oocyte (trinn 7-14). Forkortelser: DKO = dobbel knockout; phaESC = parthogenetisk haploid embryonal stamcelle; FACS = fluorescensaktivert cellesortering; MEF = mus embryonal fibroblast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig02v2.jpg"> Figur 2: Etablering av DKO-phaESC-linjer ved CRISPR/Cas9-medierte slettinger av H19- og IG-DMRs. (A) Flow cytometri analyse av phaESCs etter transfeksjon med piggyBac plasmider for stabile EGFP uttrykk og med 4 CRISPR / Cas9 plasmider. Ikke-transfekerte phaESCer vises som kontroll. DNA-profilen (øverst) viser cellesyklusfordelingen av haploide og diploide celler. G1/S-fase haploide celler som uttrykker EGFP er indikert av den grønne porten (bunn, høyre). (B) Genotyping av phaESC-underkloner som ble dyrket på MEFer (første genotyping) og etter fjerning av MEFer (andre genotyping). Under klonede phaESC-linjer 1, 2, 3 og 4 representerer wildtype-celler, celler med H19-DMR-sletting, med en IG-DMR-sletting, og med henholdsvis kombinert H19- og IG-DMR-sletting. DKO-phaESC linje 5-8 har både H19-DMR og IG-DMR slettinger og er fri for wildtype alleler. Forkortelser: DKO = dobbel knockout; phaESC = parthogenetisk haploid embryonal stamcelle; DMR = differensialt metylert region; MEF = mus embryonal fibroblast; EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; WT = wildtype. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig03v3.jpg"> Figur 3: Injeksjon av mitotically arrestert DKO-phaESCs i MII oocytes. (A) Morfologi av en DKO-phaESC kultur som bærer en CAG-EGFP transgene og sletting av H19- og IG-DMRs; skala bar = 50 μm. (B) Representativ strømning cytometri analyse av DKO-phaESCs etter arrestasjon med demecolcine for 8 h. DKO-phaESCs uten demecolcin behandling er vist som kontroll. (C) Morfologi av DKO-phaESCs i mikroinjeksjonspipetten. En enkelt intakt DKO-phaESC før (venstre) og etter (høyre) rupturing plasmamembranen ved pipettering er vist; skala bar = 20 μm. (D) Konstruerte embryoer ved 1 time etter injeksjon av DKO-phaESCs i MII oocytter. Et sammenslått bilde av EGFP fluorescens og lyst felt vises. Svarte pilspisser indikerer runde flekker av intens EGFP-uttrykk etter injeksjon av intakte DKO-phaESCs, som bør unngås; skala bar = 50 μm. (E) Et differensialinterferenskontrastbilde av halv klonede embryoer 6 timer etter initiering av aktivering med strontiumklorid er vist. Hvite pilspisser indikerer embryoer med 3 polarlegemer, inkludert en pseudo polar kropp fra injisert DKO-phaESC; skala bar = 50 μm. Forkortelser: DKO = dobbel knockout; phaESC = parthogenetisk haploid embryonal stamcelle; EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig04.jpg"> Figur 4: Oppsett for intracytoplasmisk injeksjon av DKO-phaESCs i oocytter. (A) Arrangementet av en injeksjonspipette, en pipette og en oocyttt i injeksjonskammeret vises. α bøye vinkelen på mikroinjeksjonspipetten. (B) Oppsett av dråpene i mikromanipuleringsfatet for intracytoplasmatisk injeksjon. Forkortelser: DKO = dobbel knockout; phaESC = parthogenetisk haploid embryonal stamcelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig05.jpg"> Figur 5: Utvikling av halvkloste embryoer. (A) Preimplantasjon utvikling av semi-klonede embryoer in vitro. EGFP-uttrykk observeres i utgangspunktet i firecellede embryoer på dag 2 etter intracytoplasmatisk injeksjon. På dag 4 kan intens EGFP-uttrykk observeres i blastocytter; skala bar = 100 μm. (B) En halv klonet mus oppnådd etter 2-cellers embryo overføring til en mottaker kvinne. Ved 74 dpp leverte den halvklostede musen (pilspissen) sine første valper (stjerne) ved naturlig fødsel etter parring med en wildtype Swiss Webster-mann. Semi-klonede embryoer og den halv klonede musen vist i denne figuren er identiske med de som er rapportert i Aizawa et al.3. Forkortelser: EGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; .dpp, dager etter partum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">Gelatin løsning</td>
		</tr><tr><td>Komponent</td>
			<td>Lagerkonsentrasjon</td>
			<td>Volum/vekt</td>
			<td>Endelig konsentrasjon</td>
		</tr><tr><td>Vann</td>
			<td>-</td>
			<td>500 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Gelatin</td>
			<td>-</td>
			<td>1 g</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Haploid embryonal stamcelle (HaESC) medium</td>
		</tr><tr><td>Komponent</td>
			<td>Lagerkonsentrasjon</td>
			<td>Volum/vekt</td>
			<td>Endelig konsentrasjon</td>
		</tr><tr><td>NDiff 227</td>
			<td>-</td>
			<td>10 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>CHIR 99021</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>3 μL</td>
			<td>3 μM</td>
		</tr><tr><td>PD 0325901</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr><tr><td>LIF</td>
			<td>1 x 106 IE/ml</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>1 000 IE/ml</td>
		</tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>100x</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">HaESC-vedlikeholdsbuffer</td>
		</tr><tr><td>Komponent</td>
			<td>Lagerkonsentrasjon</td>
			<td>Volum/vekt</td>
			<td>Endelig konsentrasjon</td>
		</tr><tr><td>HaESC-medium</td>
			<td>-</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>HEPES-løsning</td>
			<td>1 M</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Vaskebuffer</td>
		</tr><tr><td>Komponent</td>
			<td>Lagerkonsentrasjon</td>
			<td>Volum/vekt</td>
			<td>Endelig konsentrasjon</td>
		</tr><tr><td>DMEM / F-12</td>
			<td>-</td>
			<td>100 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>BSA-brøk</td>
			<td>7.5%</td>
			<td>7,1 ml</td>
			<td>0.5%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">MEF-medium</td>
		</tr><tr><td>Komponent</td>
			<td>Lagerkonsentrasjon</td>
			<td>Volum/vekt</td>
			<td>Endelig konsentrasjon</td>
		</tr><tr><td>DMEM</td>
			<td>-</td>
			<td>500 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>FBS</td>
			<td>-</td>
			<td>56 ml</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>β-Mercaptoethanol</td>
			<td>14.3 mol/l</td>
			<td>3,9 μL</td>
			<td>100 μM</td>
		</tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>100x</td>
			<td>5,6 ml</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Lysis buffer</td>
		</tr><tr><td>Komponent</td>
			<td>Lagerkonsentrasjon</td>
			<td>Volum/vekt</td>
			<td>Endelig konsentrasjon</td>
		</tr><tr><td>Vann</td>
			<td>-</td>
			<td>8,25 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCl (pH 8,5)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr><tr><td>Edta</td>
			<td>0,5 M</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>SDS-løsning</td>
			<td>10%</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td>Nacl</td>
			<td>5 M</td>
			<td>400 μL</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr><tr><td>Proteinase K</td>
			<td>20 mg/ml</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>100 μg/ml</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Aktiveringsmedium</td>
		</tr><tr><td>Komponent</td>
			<td>Lagerkonsentrasjon</td>
			<td>Volum/vekt</td>
			<td>Endelig konsentrasjon</td>
		</tr><tr><td>KSOM</td>
			<td>-</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Strontiumklorid</td>
			<td>1 M</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>EGTA</td>
			<td>0,5 M, pH 8,0</td>
			<td>4 μL</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">PVP-løsning</td>
		</tr><tr><td>Komponent</td>
			<td>Lagerkonsentrasjon</td>
			<td>Volum/vekt</td>
			<td>Endelig konsentrasjon</td>
		</tr><tr><td>M2-medium</td>
			<td>-</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Pvp</td>
			<td>-</td>
			<td>0,6 g</td>
			<td>12%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG-løsning</td>
		</tr><tr><td>Komponent</td>
			<td>Lagerkonsentrasjon</td>
			<td>Volum/vekt</td>
			<td>Endelig konsentrasjon</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>PMSG</td>
			<td>500 IE/ml</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 IE/ml</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">hCG-løsning</td>
		</tr><tr><td>Komponent</td>
			<td>Lagerkonsentrasjon</td>
			<td>Volum/vekt</td>
			<td>Endelig konsentrasjon</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Hcg</td>
			<td>500 IE/ml</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 IE/ml</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Hyaluronidase medium</td>
		</tr><tr><td>Komponent</td>
			<td>Lagerkonsentrasjon</td>
			<td>Volum/vekt</td>
			<td>Endelig konsentrasjon</td>
		</tr><tr><td>M2-medium</td>
			<td>-</td>
			<td>380 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Hyaluronidase</td>
			<td>10 mg/ml</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>0,5 mg/ml</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Forkortelser: LIF = leukemi hemmende faktor; MEF = mus embryonal fibroblast;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">FBS = foster bovint serum; DMEM = Dulbeccos modifiserte ørnemedium; BSA = bovint serumalbumin;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">EDTA = etylendimintetraketisk syre; SDS = natriumddecylsulfat; EGTA = etylen-bis (oksyetylennitrilo)tetraedsyre;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PBS = fosfatbufret saltvann; PVP = polyvinylpyrrolidon; hCG = human choriongonadotropin;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG = gravid mare serum gonadotropin.</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Oppskrift av medium, buffer og løsning.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>navn</td>
			<td colspan="2">Sekvens (5 til 3')</td>
			<td>Programmet</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">AGA TGG GGT KATT TCT TTT CC</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCA GTC TCT TCT GAG TTC ATG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CAG GTG AGA ACC ACT GCT GAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCT GCT-KODE AGG TAC TAC GCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Liste over oligonukleotider.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm at JoVE.com

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Denne artikkelen tar sikte på å demonstrere bruken av parthenogenetiske haploide embryonale stamceller som erstatning for sæd for bygging av halvkloste embryoer.

Anvendelse av mus Parthenogenetic Haploid embryonale stamceller som en erstatning for sperm

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Avledning av Cardiac stamceller fra embryonale stamceller

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Neural Differensiering av mus embryonale stamceller i Serum-free enlagskultur

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Generering CRISPR / Cas9 mediert Monoallelic Slett å studere Enhancer funksjon i mus embryonale stamceller

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolering av Murine Embryonic Hemogenic endotelceller

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produksjonen av Pluripotent stamceller fra mus fostervann Cells Ved hjelp av en Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Struktur-funksjon studier i mus embryonale stamceller Bruke recombinase-mediert Cassette Veksling

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontal helmontering: En romanbehandlings- og bildeprotokoll for tykke, tredimensjonale vev Tverrsnitt av huden

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsorientert analyse av Caenorhabditis elegans Germline å studere distribusjon av kjerner, proteiner og Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Hemogenic endotelet differensiering fra Human Pluripotent stamceller i en mater-og Xeno-fri definert tilstand

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...