Name: application of mouse parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute of sperm
Uploaded: 2020-11-19T15:00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm at JoVE.com

Agradecemos ao Dr. Giulio Di Minin pela derivação das linhas phaESC e dr. Remo Freimann pela operação de citometria de fluxo. Também reconhecemos a Sra. Michèle Schaffner e o Sr. Thomas M. Hennek por apoio técnico com transferência de embriões. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência da Suíça (bolsa 31003A_152814/1).

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Os autores não têm nada a revelar.

A clonagem de mamíferos por transferência nuclear de células somáticas (SCNT) foi pioneira na década de 1990,20,21. Esses desenvolvimentos seguiram estudos de clonagem realizados 30 anos antes em anfíbios22. O atraso considerável reflete a dificuldade da embriologia e da impressão genômica em mamíferos. O desenvolvimento do SCNT mamífero é a base para a aplicação do haESC para substituição de espermatozoides, que está detalhado neste protocolo.
A sincronização do ciclo celular é um fator importante para o sucesso do SCNT23. Este também é o caso da injeção de haESC neste protocolo. A introdução de um genoma doador em um receptor requer que as fases do ciclo celular sejam combinadas para evitar quebras cromossômicas ou aneuploidies que revogariam o desenvolvimento de embriões. A semi-clonagem tem a complexidade adicional que dois genomas e um citoplasto precisam ser compatíveis. Um relatório anterior demonstrou que a injeção de haESCs androgenéticos presos em fase M produziu melhores taxas de desenvolvimento de embriões semi-clonados do que a injeção de haESCs em fase G1 em oócitos7. Este relatório sugere a fase M como um ponto de sincronização adequado para a semi-clonagem. Assim, os phaESCs foram mitoticamente presos em metafase com demecolcina e injetados no ooplasma dos oócitos MII, que foram naturalmente presos em metafase II da meiose. É importante ressaltar que a detenção em fase M pode ser alcançada em ESCs de camundongos com alta eficiência, proporcionando excelente sincronização entre ciclos de células doadoras e receptoras.
Durante a mitose, a membrana nuclear se rompe e um fuso se forma a que os cromossomos replicados se conectam. Após a injeção de DKO-phaESCs de fase M, os cromátides irmãos são segregados em um corpo pseudo polar e o zigoto7 (Figura 3E). Consequentemente, um único conjunto de cromossomos de um DKO-phaESC contribui para o embrião semi-clonado. É fundamental que os cromátides irmãs dos cromossomos DKO-phaESC possam ser corretamente segregados após a injeção. A membrana plasmática de um DKO-phaESC intacto impede a segregação em um corpo pseudo polar. Observamos casos raros em que a membrana plasmática de DKO-phaESCs não foi rompida, e os embriões apresentaram DKO-phaESCs intactos no ooplasma após a injeção(Figura 3D). Portanto, deve-se tomar cuidado para remover a membrana plasmática de DKO-phaESCs por pipetação. Durante a injeção, é igualmente importante evitar a interrupção do fuso meiotico do oócito, o que poderia levar a defeitos de segregação do cromossomo e induzir aneuploidia também.
Em mamíferos, a impressão genômica limita a aplicação de phaESCs como substituição de espermatozoides. HaESCs partenogenéticas possuem uma configuração materna de impressões genômicas, enquanto os espermatozoides possuem uma configuração paternal. Portanto, a geração de filhotes a termo não ocorreu após a injeção de phaESCs de tipo selvagem como substituição de espermatozoides. Para superar essa limitação, as exclusões dos IG- e H19-DMRs são projetadas em phaESCs. A modificação da expressão impressa no Igf2-H19 materno e gtl2-dlk1 loci é suficiente para alterar a configuração de impressões genômicas para permitir a geração de camundongos semi-clonados com uma frequência de mais de 5,1%, com base em embriões transferidos de 2 células. Essas observações sugerem que o alvo de dois genes impressos muda o genoma dos phaESCs para uma configuração paternal funcional que pode substituir o esperma em camundongos. No entanto, é necessária uma modificação genética permanente dos phaESCs para essa estratégia. Como estratégia alternativa, pode-se considerar haESC androgenético. HaESCs androgenéticos são derivados do genoma do esperma e possuem impressões paternas. Há relatos de que os haESCs androgenéticos selvagens contribuíram como reposição de esperma para gerar filhotes a termo em uma frequência entre 1,3% e 1,9% dos embriões transferidos4,7,24. Os filhotes a termo também foram obtidos injetando haESCs androgenéticos com exclusões do IG- e H19-DMRs a uma frequência de 20,2% dos embriões de 2 células transferidos24. O aumento da eficiência da semi-clonagem usando haESCs androgenéticos modificados é provável porque as impressões podem se tornar instáveis na cultura. Os defeitos de impressão são corrigidos pelas exclusões genéticas das DMRs críticas.
Considerando a dificuldade em introduzir modificações genéticas diretamente nos genomas oócitos ou espermatozoides, os haESCs são uma ferramenta valiosa para manipular os genomas parentais separadamente. O uso de haESCs como substituto do esperma fornece uma vantagem notável para a edição de genomas na germe do rato. Um estudo recente combinou a edição de genoma baseada em CRISPR/Cas9 com a aplicação de haESCs para a caracterização de regiões de impressão que são fundamentais para o desenvolvimento embrionário12. Este estudo analisou o papel do Rasgrf1-DMR em combinação com os H19-e IG-DMRsno desenvolvimento de camundongos bimaternais, e a função de 7 DMRs diferentes no desenvolvimento de camundongos bipaternos. O método de substituição de haESCs por espermatozoides formou a base para abordagens de triagem genética para identificar aminoácidos-chave dentro da proteína DND1 no desenvolvimento de células germinativas primordiais e para a identificação de genes no desenvolvimento ósseo24,25,26. Estudos sobre impressão genômica e triagem genética para identificar fatores-chave no desenvolvimento embrionário são abordagens consideráveis para a aplicação de haESCs como genomas gameticos.

Nos mamíferos, os gametas são as únicas células que transmitem informações genéticas para a próxima geração. A fusão de um oócito e um espermatozoide forma um zigoto diploide que se desenvolve em um animal adulto. Mutações em genomas gameticos são, assim, herdadas pela prole e impulsionam a variação genética na espécie1. A introdução de mutações na linha germinal tem sido aplicada para produzir animais geneticamente modificados para diversos estudos biológicos, incluindo a caracterização da função genética e modelagem de doenças. Tanto os oócitos quanto os espermatozoides são células terminais diferenciadas e altamente especializadas que cessaram a proliferação. Portanto, a modificação direta dos gametas é tecnicamente difícil, e abordagens especializadas foram desenvolvidas. Modificações genéticas podem ser introduzidas na germeina do camundongo pela injeção de ESCs geneticamente modificados em blastocistos, onde eles se integram ao embrião em desenvolvimento e colonizam a linha germinal. Além disso, a modificação genética de zigotos usando abordagens de edição de genomas, incluindo o sistema CRISPR/Cas9, tornou-se amplamente adotada2.
Recentemente, foi relatada uma abordagem excepcional, que aplica haESCs como substituto de um genoma gametico3,4,5,6,7,8. HaESCs são linhas de células-tronco derivadas da massa celular interna de blastocistos haploíides partehenogenéticos ou androgenéticos e possuem um único conjunto de cromossomos4,7,9,10. Foi demonstrado que tanto haESCs partehenogenéticas quanto androgenéticas podem contribuir para o genoma de camundongos semi-clonados após injeção intracytoplasmática em oócitos. Em contraste com outras abordagens, os genomas dos haESCs podem ser diretamente modificados na cultura devido à sua capacidade de auto-renovação. Introduzir modificações genéticas na linha germinal substituindo o esperma por haESCs é um método importante para estudos biológicos. Prevê a possibilidade de cultura separada e manipulação do genoma materno ou paterno, derivado de haESCs partenogenéticas ou androgenéticas, respectivamente. Os HaESCs podem então ser usados como substituição de genoma gametico, o que é especialmente vantajoso para estudos de impressão genômica, expressão específica de alelo e processos específicos dos pais.
Em camundongos, informações genômicas maternas e paternas são necessárias para o desenvolvimento normal de embriões11. Portanto, os filhotes a termo não puderam ser obtidos quando haESCs (phaESCs) do tipo selvagem foram injetados para substituir o genoma do esperma5,8. Para superar o bloco de desenvolvimento, a impressão genômica do genoma materno das haESCs partehenogenéticas precisa ser corrigida para uma configuração paterna. Isso pode ser conseguido através da manipulação das regiões diferencialmente metiladas (DMRs). Até o momento, foram estudadas supressões direcionadas dos H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR e Rasgrf1-DMR para reprimir genes expressos maternamente nos phaESCs3,5,8,12. Estes estudos demonstraram que as exclusões tanto do H19-DMR quanto do IG-DMR são suficientes para converter uma mãe em uma configuração de impressão paterna que pode substituir os cromossomos do esperma. A injeção intracytoplasmática de phaESCs que transportam as duas exclusões de DMR em oócitos produziu filhotes semi-clonados com uma frequência entre 5,1% e 15,5% dos embriões transferidos de 2 células.
Este protocolo baseia-se na aplicação de phaESCs com exclusões tanto de H19-DMR quanto IG-DMR, que chamamos de phaESCs duplo-knockout (DKO-phaESCs). Fornecemos instruções detalhadas para a modificação da impressão genômica em phaESCs para estabelecer linhas DKO-phaESC, para a injeção de DKO-phaESCs em oócitos como um substituto para um genoma de espermatozoides, para a cultura de embriões semi-clonados para blastocistos, e para a obtenção de camundongos semi-clonados. Este protocolo é uma referência para pesquisadores que requerem manipulação precisa e direta do genoma paterno e geração de embriões e camundongos semi-clonados.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mLTube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.150</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150628</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M6250</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA fraction</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR 99021</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1386</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Demecolcine solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D1925</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM / F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DR4 mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>3208</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E5134</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>biowest</td>
			<td>S1810-500</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium</td>
			<td>amsbio</td>
			<td>11897</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G1890</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irradiated MEF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A34966</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF (Leukemia inhibitory factor)</td>
			<td>(Homemade)</td>
			<td>-</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDiff 227</td>
			<td>Takara</td>
			<td>Y40002</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 0325901</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1408</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#40973</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piggyBac transposase plasmid</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>PB210PA-1</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX330 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#42230</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX458 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#48138</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F549S</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0192</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100317</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109634</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Axon</td>
			<td>A3830</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71729</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Epeendorf</td>
			<td>5384000012</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Tube with cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios EQ</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.1640</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-gauge 1/2 inch needle</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z192362-100EA</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6D2F1 mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>100006</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG</td>
			<td>MSD animal health</td>
			<td>49451</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010015</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG</td>
			<td>Avivasysbio</td>
			<td>OPPA1037 5000 IU</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179830</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Center-well dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3260</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital rocker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880020</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0878</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H4272</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MR-020P-5F</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M16 medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7292</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7167</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P1049-1PAK</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strontium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>13909</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.5607</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass cappilary</td>
			<td>Science product</td>
			<td>GB100T-8P</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram 4r Oil</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5196000030</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorinert FC-770</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F3556</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipette</td>
			<td>BioMedical Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-U</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-900</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pipette</td>
			<td>BioMedical Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlaoder tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252 956.003</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulaor arms</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>NT-88-V3</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PiezoXpert</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5194000016</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVP (Polyvinylpyrrolidine)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PVP360</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of mouse parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute of sperm

Em organismos com reprodução sexual, as células germinativas são a fonte de células totipotentes que se desenvolvem em novos indivíduos. Em camundongos, a fertilização de um oócito por um espermatozoide cria um zigoto totipotent. Recentemente, várias publicações relataram que células-tronco embrionárias haploides (haESCs) podem ser um substituto para genomas gameticos e contribuir para embriões, que se desenvolvem em camundongos. Aqui, apresentamos um protocolo para aplicar haESCs partenogenética como um substituto do esperma para construir embriões por injeção intracytoplasmática em oócitos. Este protocolo consiste em etapas para preparar haESCs como substituição de espermatozoides, para injeção de cromossomos haESC em oócitos, e para a cultura de embriões semi-clonados. Os embriões podem produzir camundongos semi-clonados férteis após a transferência de embriões. O uso de haESCs como substituição de esperma facilita a edição de genomas na linha germinal, estudos de desenvolvimento embrionário e investigação de impressão genômica.

O objetivo deste protocolo é aplicar haESCs como substituto de espermatozoides para obter embriões e camundongos semi-clonados. Para isso, foi gerada e utilizada uma linha DKO-phaESC que transportava o transgene CAG-EGFP para injeção intracytoplasmática em oócitos MII. Para obter uma linha phaESC adequada com uma configuração de impressão paterna, realizamos engenharia genética utilizando núcleos Cas9. Uma linha ESC haploide contém células haploides e diploides que surgem devido a uma tendência inerente de ESCs haploides para diploidização10. Um conjunto de cromossomos haploides é um pré-requisito para a substituição bem sucedida do genoma do esperma. A análise do conteúdo de DNA por citometria de fluxo mostra a distribuição de células haploides e diploides nas fases G0/G1-, S e G2/M(Figura 2A).
Para estabelecer as linhas DKO-phaESC, as linhas phaESC do tipo selvagem foram transfeinadas com construções transposon piggyBac para expressão transgênica estável e com plasmídeos CRISPR/Cas9 para obtenção de exclusões do H19- e IG-DMRs. Para excluir ESCs diploides e isolar apenas ESCs haploides expressando EGFP, foi definido um portão de tipo específico(Figura 2A). Células eGFP-positivas haploides únicas foram então emplacar em poços individuais de placas de 96 poços para obter sub-clones. Os alimentadores MEF foram utilizados para aumentar a eficiência do revestimento e a sobrevivência dos phaESCs transfectados. Após a expansão das culturas, uma rodada inicial de genotipagem foi realizada pelo PCR para identificar sub-clones que carregam exclusões de ambas as DMRs. Após a retirada dos alimentadores mef das culturas, um segundo genotipo foi realizado para confirmar a ausência de alelos do tipo selvagem no H19- e IG-DMRs(Figura 2B). De um total de 135 sub-clones, obtivemos 5 linhas haploid DKO-phESC que carregavam os alelos excluídos e estavam livres de alelos wildtype tanto do H19-DMR quanto do IG-DMR.
Um transgene CAG-EGFP foi introduzido em DKO-phaESCs para estudar sua contribuição para embriões semi-clonados por visualização de fluorescência verde sob um microscópio(Figura 3A). Para a injeção intracytoplasmática, dko-phaESCs foram tratados com demecolcina para prendê-los em fase M. Assim, o ciclo celular de DKO-phaESCs foi sincronizado com o dos oócitos MII. A análise da citometria de fluxo mostrou 2 populações correspondentes à fase G2/M presas em células haploides (2n) e diploides (4n) após o tratamento com demecolcina (Figura 3B). A ausência do pico haploide de 1n indicou que a prisão do ciclo celular estava em grande parte completa. Os ESCs haploides da fase M foram então classificados e injetados em oócitos. Para isso, um único DKO-phaESC foi carregado na pipeta de microinjeção e injetado no citoplasma de um oócito MII(Figura 3C). A membrana plasmática do DKO-phaESC foi rompida por tubulação na ponta da pipeta de microinjeção.
Após a injeção, a expressão EGFP raramente foi detectada nos embriões semi-clonados construídos, pois o citoplasma dos DKO-phaESCs havia se dispersado no grande citoplasma do oócito (Figura 3D). Em casos raros, uma mancha redonda de intensa expressão EGFP poderia ser observada dentro do ooplasma. Esta observação foi provavelmente causada pela injeção inadvertida de DKO-phaESCs intactos. A falha na ruptura da membrana celular DKO-phaESC provavelmente não é compatível com o desenvolvimento de embriões e deve ser evitada. Uma hora após a injeção, os embriões foram ativados pelo tratamento com cloreto de estrôncio18. Seis horas após o início da ativação, até 3 corpos polares foram observados sob o microscópio (Figura 3E). Estes corpos polares correspondem ao primeiro e segundo corpos polares do oócito e a um corpo pseudo polar do DKO-phaESC7. Além disso, dois pronucleis foram observados sob um microscópio de contraste de interferência diferencial, que se assemelhava ao estágio pronuclear de zigotos após fertilização normal com espermatozoides.
Para demonstrar competência de desenvolvimento, embriões semi-clonados foram cultivados até o estágio blastocisto(Figura 5A). Além disso, um camundongo a termo foi obtido após a transferência de embriões semi-clonados de estágio de 2 células para os ovidutos de uma fêmea receptora(Figura 5B). Como esperado, o rato derivado de um embrião semi-clonado era uma fêmea, pois nem oócitos nem phaESCs derivados de oócitos carregam um cromossomo Y. O rato semi-clonado era excessivamente normal e produzia descendentes saudáveis quando acasalado com um macho webster suíço selvagem. Até agora, o rato semi-clonado está vivo há mais de 600 dias sem problemas de saúde aparentes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig01v3.jpg"> Figura 1: Visão geral da aplicação de DKO-phaESCs como substituição de espermatozoides. (A) Um período de tempo dos procedimentos do protocolo. (B) O esquema mostra as etapas para estabelecer linhas DKO-phaESC (etapas 1-6). (C) O esquema mostra os passos para construir embriões semi-clonados por injeção intracytoplasmática de um DKO-phaESC em um oócito MII (passos 7-14). Abreviaturas: DKO = duplo nocaute; phaESC = célula-tronco embrionária haploide parthogenética; FACS = classificação celular ativada por fluorescência; MEF = fibroblasto embrionário de camundongos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig02v2.jpg"> Figura 2: Estabelecimento de linhas DKO-phaESC por exclusões mediadas por CRISPR/Cas9 de H19- e IG-DMRs. (A) Análise da citometria de fluxo de phaESCs após a transfecção com plasmídeos piggyBac para expressão estável EGFP e com 4 plasmídeos CRISPR/Cas9. Os phaESCs não transfectados são mostrados como controle. O perfil de DNA (topo) mostra a distribuição do ciclo celular das células haploides e diploides. As células haploides da fase G1/S expressando EGFP são indicadas pelo portão verde (inferior, à direita). (B) Genotipagem de sub-clones phaESC que foram cultivados em MEFs (primeiro genotipagem) e após a remoção de MEFs (segunda genotipagem). As linhas phaESC sub clonadas 1, 2, 3 e 4 representam células do tipo selvagem, células com exclusão H19-DMR, com exclusão IG-DMR, e com exclusões combinadas de H19- e IG-DMR,respectivamente. As linhas DKO-phaESC 5-8 possuem exclusões H19-DMR e IG-DMRe estão livres de alelos do tipo selvagem. Abreviaturas: DKO = duplo nocaute; phaESC = célula-tronco embrionária haploide parthogenética; DMR = região diferencialmente metilada; MEF = fibroblasto embrionário de camundongo; EGFP = proteína fluorescente verde aprimorada; WT = tipo selvagem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig03v3.jpg"> Figura 3: Injeção de DKO-phaESCs presos mitoticamente em oócitos MII. (A) Morfologia de uma cultura DKO-phaESC que carrega um transgene CAG-EGFP e exclusões dos DMRs H19 e IG; barra de escala = 50 μm. (B) Análise representativa da citometria de fluxo de DKO-phaESCs após a detenção com demecolcina por 8 h. DKO-phaESCs sem tratamento demecolcina são mostrados como controle. (C) Morfologia de DKO-phaESCs na pipeta de microinjeção. Um único DKO-phaESC intacto antes (esquerda) e depois (direita) rompendo a membrana plasmática por tubulação é mostrado; barra de escala = 20 μm. (D) Embriões construídos a 1 h após a injeção de DKO-phaESCs em oócitos MII. Uma imagem mesclada de fluorescência EGFP e campo brilhante é mostrada. Pontas de flecha pretas indicam pontos redondos de intensa expressão EGFP após a injeção de DKO-phaESCs intactos, que devem ser evitados; barra de escala = 50 μm. (E) Uma imagem de contraste de interferência diferencial de embriões semi-clonados 6 h após o início da ativação com cloreto de estrôncio é mostrada. Pontas de flechas brancas indicam embriões com 3 corpos polares, incluindo um corpo pseudo polar do DKO-phaESC injetado; barra de escala = 50 μm. Abreviaturas: DKO = duplo nocaute; phaESC = célula-tronco embrionária haploide parthogenética; EGFP = proteína fluorescente verde aprimorada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig04.jpg"> Figura 4: Esquema da configuração para injeção intracytoplasmática de DKO-phaESCs em oócitos. (A) O arranjo de uma pipeta de injeção, uma pipeta de retenção e um oócito na câmara de injeção é mostrado. α, ângulo de dobra da pipeta de microinjeção. (B) Layout das gotas na antena de micromanipulação para injeção intracytoplasmática. Abreviaturas: DKO = duplo nocaute; phaESC = célula-tronco embrionária haploide parthogenética. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig05.jpg"> Figura 5: Desenvolvimento de embriões semi-clonados. (A) Desenvolvimento de pré-implantação de embriões semi-clonados in vitro. A expressão EGFP é inicialmente observada em embriões de quatro células no dia 2 após injeção intracytoplasmática. No dia 4, a expressão intensa do EGFP pode ser observada em blastocistos; barra de escala = 100 μm. (B) Um rato semi-clonado obtido após a transferência de embrião de 2 células para uma fêmea receptora. Aos 74 dpp, o rato semi-clonado (ponta de flecha) entregou seus primeiros filhotes (asterisco) por nascimento natural após o acasalamento com um macho suíço webster selvagem. Embriões semi-clonados e o camundongo semi-clonado mostrado nesta figura são idênticos aos relatados em Aizawa et al.3. Abreviaturas: EGFP = proteína fluorescente verde aprimorada; .dpp, dias pós-parto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">Solução de gelatina</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentração de estoque</td>
			<td>Volume / peso</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr><tr><td>Água</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>gelatina</td>
			<td>-</td>
			<td>1 g</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Célula-tronco embrionária haploide (HaESC) média</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentração de estoque</td>
			<td>Volume / peso</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr><tr><td>NDiff 227</td>
			<td>-</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>CHIR 99021</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>3 μL</td>
			<td>3 μM</td>
		</tr><tr><td>PD 0325901</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr><tr><td>Lif</td>
			<td>1 x 106 UI/mL</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>1.000 UI/mL</td>
		</tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td>
			<td>100x</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Tampão de manutenção HaESC</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentração de estoque</td>
			<td>Volume / peso</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr><tr><td>Meio HaESC</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Solução HEPES</td>
			<td>1 M</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Tampão de lavagem</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentração de estoque</td>
			<td>Volume / peso</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr><tr><td>DMEM / F-12</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Fração BSA</td>
			<td>7.5%</td>
			<td>7,1 mL</td>
			<td>0.5%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Meio MEF</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentração de estoque</td>
			<td>Volume / peso</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr><tr><td>DMEM</td>
			<td>-</td>
			<td>500 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>FBS</td>
			<td>-</td>
			<td>56 mL</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>β-Mercaptoetanol</td>
			<td>14.3 mol/L</td>
			<td>3,9 μL</td>
			<td>100 μM</td>
		</tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td>
			<td>100x</td>
			<td>5,6 mL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Tampão de lise</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentração de estoque</td>
			<td>Volume / peso</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr><tr><td>Água</td>
			<td>-</td>
			<td>8,25 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td>1 M</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr><tr><td>Edta</td>
			<td>0,5 M</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>Solução SDS</td>
			<td>10%</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td>NaCl</td>
			<td>5 M</td>
			<td>400 μL</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr><tr><td>Proteinase K</td>
			<td>20 mg/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>100 μg/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Meio de ativação</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentração de estoque</td>
			<td>Volume / peso</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr><tr><td>Rio KSOM</td>
			<td>-</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Cloreto de estrôncio</td>
			<td>1 M</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>EGTA</td>
			<td>0,5 M, pH 8.0</td>
			<td>4 μL</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Solução PVP</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentração de estoque</td>
			<td>Volume / peso</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr><tr><td>Meio M2</td>
			<td>-</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Pvp</td>
			<td>-</td>
			<td>0,6 g</td>
			<td>12%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Solução PMSG</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentração de estoque</td>
			<td>Volume / peso</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>PMSG</td>
			<td>500 UI/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 UI/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">solução hCG</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentração de estoque</td>
			<td>Volume / peso</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>hCG</td>
			<td>500 UI/mL</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 UI/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Meio de hialuronidase</td>
		</tr><tr><td>componente</td>
			<td>Concentração de estoque</td>
			<td>Volume / peso</td>
			<td>Concentração final</td>
		</tr><tr><td>Meio M2</td>
			<td>-</td>
			<td>380 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Hialuronidase</td>
			<td>10 mg/mL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>0,5 mg/mL</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Abreviaturas: LIF = fator inibidor da leucemia; MEF = fibroblasto embrionário de camundongo;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">FBS = soro bovino fetal; DMEM = Meio águia modificada de Dulbecco; BSA = albumina de soro bovino;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">EDTA = ácido etilenodiaminetetraacético; SDS = dodecylsulfato de sódio; EGTA = ácido tetraacético e egta = etileno-bis (oxyethylenenitrilo)tetraacético;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PBS = soro fisiológico tamponado com fosfato; PVP = polivinylpyrrolidone; hCG = gonadotropina coriônica humana;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG = égua grávida gonadotropina.</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Receita de meio, tampão e solução.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>nome</td>
			<td colspan="2">Sequência (5' a 3')</td>
			<td>aplicação</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">AGA TGG GGT CAT TCT TTT CC</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCA GTC TCT TCT GAG TTC ATG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CAG GTG AGA ACC ACT GCT GAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCT GCT TAG AGG TAC TAC GCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Lista de oligonucleotídeos.

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Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

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Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Estudos de estrutura e função em células-tronco embrionárias de camundongos usando troca de cassete mediada por recombinase

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horizontal Whole Mount: um protocolo de processamento e imagem de Novel para secções transversais grossas de tecidos tridimensionais

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Análise computacional do Germline Caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Diferenciação do endotélio hemogênico de células-tronco pluripotentes humanas em um alimentador-e condição definida livre de Xeno

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...