Name: application of mouse parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute of sperm
Uploaded: 2020-11-19T15:00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm at JoVE.com

Vi tackar Dr. Giulio Di Minin för härledning av phaESC linjer och Dr. Remo Freimann för flöde cytometri operation. Vi erkänner också Ms. Michèle Schaffner och Thomas M. Hennek för teknisk support med embryoöverföring. Detta arbete stöddes av Swiss National Science Foundation (grant 31003A_152814/1).

<ol>
	<li>Ellegren, H., Galtier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+genetic+diversity.">Determinants of genetic diversity.</a> Nature Reviews: Genetics. 17 (7), 422-433 (2016).</li><li>Huijbers, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+genetically+modified+mice:+A+decision+guide.">Generating genetically modified mice: A decision guide.</a> Methods in Molecular Biology. 1642, 1-19 (2017).</li><li>Aizawa, E., Dumeau, C. E., Freimann, R., Di Minin, G., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyploidy+of+semi-cloned+embryos+generated+from+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells.">Polyploidy of semi-cloned embryos generated from parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> PloS One. 15 (9), 0233072 (2020).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+live+transgenic+mice.">Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice.</a> Nature. 490 (7420), 407-411 (2012).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birth+of+fertile+bimaternal+offspring+following+intracytoplasmic+injection+of+parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells.">Birth of fertile bimaternal offspring following intracytoplasmic injection of parthenogenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell Research. 26 (1), 135-138 (2016).</li><li>Wan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+produce+fertile+mice.">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells produce fertile mice.</a> Cell Research. 23 (11), 1330-1333 (2013).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+genetically+modified+mice+by+oocyte+injection+of+androgenetic+haploid+embryonic+stem+cells.">Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells.</a> Cell. 149 (3), 605-617 (2012).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parthenogenetic+haploid+embryonic+stem+cells+efficiently+support+mouse+generation+by+oocyte+injection.">Parthenogenetic haploid embryonic stem cells efficiently support mouse generation by oocyte injection.</a> Cell Research. 26 (1), 131-134 (2016).</li><li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forward+and+reverse+genetics+through+derivation+of+haploid+mouse+embryonic+stem+cells.">Forward and reverse genetics through derivation of haploid mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 563-574 (2011).</li><li>Leeb, M., Wutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+haploid+embryonic+stem+cells+from+mouse+embryos.">Derivation of haploid embryonic stem cells from mouse embryos.</a> Nature. 479 (7371), 131-134 (2011).</li><li>Surani, M. A., Barton, S. C., Norris, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+reconstituted+mouse+eggs+suggests+imprinting+of+the+genome+during+gametogenesis.">Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis.</a> Nature. 308 (5959), 548-550 (1984).</li><li>Li, Z. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bimaternal+and+bipaternal+mice+from+hypomethylated+haploid+ESCs+with+imprinting+region+deletions.">Generation of bimaternal and bipaternal mice from hypomethylated haploid ESCs with imprinting region deletions.</a> Cell Stem Cell. 23 (5), 665-676 (2018).</li><li>Elling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+maintenance+of+mouse+haploid+embryonic+stem+cells.">Derivation and maintenance of mouse haploid embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 14 (7), 1991-2014 (2019).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Shuai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+mammalian+offspring+by+haploid+embryonic+stem+cells+microinjection.">Generation of mammalian offspring by haploid embryonic stem cells microinjection.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 31, 1-15 (2014).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3923 (2012).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).</li><li>O'Neill, G. T., Rolfe, L. R., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+potential+and+chromosome+constitution+of+strontium-induced+mouse+parthenogenones.">Developmental potential and chromosome constitution of strontium-induced mouse parthenogenones.</a> Molecular Reproduction and Development. 30 (3), 214-219 (1991).</li><li>Campbell, K. H., McWhir, J., Ritchie, W. A., Wilmut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sheep+cloned+by+nuclear+transfer+from+a+cultured+cell+line.">Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line.</a> Nature. 380 (6569), 64-66 (1996).</li><li>Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-term+development+of+mice+from+enucleated+oocytes+injected+with+cumulus+cell+nuclei.">Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.</a> Nature. 394 (6691), 369-374 (1998).</li><li>Wilmut, I., Schnieke, A. E., McWhir, J., Kind, A. J., Campbell, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viable+offspring+derived+from+fetal+and+adult+mammalian+cells.">Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.</a> Nature. 385 (6619), 810-813 (1997).</li><li>Gurdon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+frogs+derived+from+the+nuclei+of+single+somatic+cells.">Adult frogs derived from the nuclei of single somatic cells.</a> Developmental Biology. 4, 256-273 (1962).</li><li>Campbell, K. H., Alberio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+the+genome:+role+of+the+cell+cycle.">Reprogramming the genome: role of the cell cycle.</a> Reproduction Supplement. 61, 477-494 (2003).</li><li>Zhong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-mediated+genetic+screening+in+mice+with+haploid+embryonic+stem+cells+carrying+a+guide+RNA+library.">CRISPR-Cas9-mediated genetic screening in mice with haploid embryonic stem cells carrying a guide RNA library.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 221-232 (2015).</li><li>Bai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genetic+screening+in+mice+through+haploid+embryonic+stem+cells+identifies+critical+genes+in+bone+development.">Targeted genetic screening in mice through haploid embryonic stem cells identifies critical genes in bone development.</a> PLoS Biology. 17 (7), 3000350 (2019).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-mediated+base-editing+screening+in+mice+identifies+DND1+amino+acids+that+are+critical+for+primordial+germ+cell+development.">CRISPR-Cas9-mediated base-editing screening in mice identifies DND1 amino acids that are critical for primordial germ cell development.</a> Nature Cell Biology. 20 (11), 1315-1325 (2018).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Kloning av däggdjur genom somatisk cell nukleär överföring (SCNT) har varit banbrytande på 1990-talet19,20,21. Denna utveckling följde kloning studier som genomförts 30 år tidigare i amfibier22. Den avsevärda förseningen återspeglar svårigheten med embryologi och genomisk prägling hos däggdjur. Utvecklingen av däggdjur SCNT är grunden för tillämpningen av haESC för att ersätta spermier, vilket beskrivs i detta protokoll.
Cellcykelsynkronisering är en viktig faktor för framgången för SCNT23. Detta är också fallet för injektion av haESC i detta protokoll. Att införa ett donatorgenom i en mottagare kräver att cellcykelfaserna matchas för att undvika kromosombrott eller aneuploidier som skulle upphäva embryoutvecklingen. Halvkloning har den extra komplexiteten att två genom och en cytoplast måste vara kompatibla. En tidigare rapport har visat att injektion av M-fas-arresterade androgenetiska haESCs gav bättre utvecklingshastigheter av halvklonerade embryon än injektion av G1-fas haESCs i oocyter7. Detta betänkande föreslår M-fas som en lämplig synkronisering punkt för halvkloning. Följaktligen arresterades phaESCs mitotically i metafas med demecolcine och injiceras i ooplasm av MII äggceller, som arresterades naturligt i metafas II av meios. Viktigt är att M-fas arrestering kan uppnås i mus EIC med hög effektivitet, vilket ger utmärkt synkronisering mellan givare och mottagare cellcykler.
Under mitos bryts kärnmembranet ner och en spindel bildas som de replikerade kromosomerna fäster vid. Efter injektion av M-fas DKO-phaESCs, syster chromatids separeras i en pseudo polar kropp och zygote7 (Figur 3E). Följaktligen bidrar en enda uppsättning kromosomer från en DKO-phaESC till det halvklonerade embryot. Det är viktigt att systerkromatider av DKO-phaESC-kromosomer kan separeras korrekt efter injektionen. Plasma membranet i en intakt DKO-phaESC förhindrar segregering i en pseudo polar kropp. Vi observerade verkligen sällsynta fall där plasmamembranet av DKO-phaESCs inte spruckit, och embryon uppvisade intaktA DKO-phaESCs i ooplasm efter injektion (Figur 3D). Därför måste man vara noga med att ta bort plasmamembranet i DKO-phaESCs genom pipetting. Under injektionen är det lika viktigt att undvika störningar i oocytens meiotiska spindel, vilket kan leda till kromosomsegregeringsdefekter och inducera aneuploidi också.
Hos däggdjur begränsar genomisk prägling tillämpningen av phaESCs som spermieersättning. Parthenogenetic haESCs har en moderns konfiguration av genomiska avtryck, medan spermier har en faderlig konfiguration. Därför har generering av heltidsvalpar inte inträffat efter injektionen av wildtype phaESCs som spermieersättning. För att övervinna denna begränsning är borttagningar av IG- och H19-DMR konstruerade i phaESCs. Modifiering av präglade uttryck vid moderns Igf2-H19 och Gtl2-Dlk1 lokus är tillräckligt för att ändra konfigurationen av genomiska avtryck för att tillåta generering av halvklonerade möss med en frekvens av över 5,1%, baserat på överförda 2-cells embryon. Dessa observationer tyder på att inriktning på två präglade gener växlar genomet av phaESCs till en funktionell faderlig konfiguration som kan ersätta spermier hos möss. Det krävs dock en permanent genetisk modifiering av phaESCs för denna strategi. Som en alternativ strategi kan androgenetisk haESC övervägas. Androgenetiska haESCs härleds från spermiegenomet och har faderliga avtryck. Det har förekommit rapporter om att vildtyp androgenetiska haESCs bidragit som spermieersättning för att generera full-term valpar med en frekvens mellan 1,3% och 1,9% av överförda embryon4,7,24. Full-term valpar har också erhållits genom att injicera androgenetiska haESCs med borttagningar av IG- och H19-DMRs med en frekvens av 20,2% av överförda 2-cells embryon24. Den ökade effektiviteten av halvkloning med modifierade androgenetiska haESCs är sannolikt eftersom avtryck kan bli instabila i kulturen. Prägling defekter korrigeras av genetiska borttagningar av kritiska DMR.
Med tanke på svårigheten att införa genetiska modifieringar direkt i oocyt- eller spermiegenomen är haESCs ett värdefullt verktyg för att manipulera föräldragenomen separat. Att använda haESCs som ersättning för spermier ger en anmärkningsvärd fördel för genomredigering i musen. En ny studie har kombinerat CRISPR/Cas9-baserad genomredigering med tillämpning av haESCs för karakterisering av präglande regioner som är kritiska för embryonal utveckling12. Denna studie analyserade rasgrf1-DMR:s roll i kombination med H19-och IG-DMR i utvecklingen av bimaternal möss och funktionen hos 7 olika DMR i utvecklingen av bipaternal möss. Metoden för att ersätta haESCs för spermier utgjorde grunden för genetiska screeningmetoder för att identifiera viktiga aminosyror inom DND1-proteinet i primordial bakteriecellutveckling och för att identifiera gener i benutveckling24,25,26. Studier om genomisk prägling och genetisk screening för att identifiera nyckelfaktorer i embryonal utveckling är betydande metoder för tillämpning av haESCs som gametic genom.

Hos däggdjur är gameter de enda cellerna som överför genetisk information till nästa generation. Fusion av en oocyt och en spermatozoon bildar en diploid zygot som utvecklas till ett vuxendjur. Mutationer i gametic genom ärvs därmed av avkomman och driver genetisk variation i art1. Införande av mutationer i könscellen har tillämpats för att producera genetiskt modifierade djur för olika biologiska studier, inklusive karakterisering av genfunktion och sjukdomsmodellering. Både äggceller och spermatozoer är terminalt differentierade och högspecialiserade celler som har upphört med spridningen. Därför är direkt modifiering av gameter tekniskt svårt, och specialiserade tillvägagångssätt har utvecklats. Genetiska modifieringar kan införas i musen genom injektion av genetiskt modifierade EIC i blastocyster, där de integreras i det utvecklande embryot och koloniserar könscellen. Dessutom har genetisk modifiering av zygoter med hjälp av genomredigeringsmetoder, inklusive CRISPR / Cas9-systemet, blivit allmänt antagen2.
Nyligen har ett enastående tillvägagångssätt rapporterats, som tillämpar haESCs som ersättning för ett gametic genom3,4,5,6,7,8. HaESCs är stamcellslinjer som härrör från den inre cellmassan hos parthenogenetiska eller androgenetiska haploida blastocyster och har en enda uppsättning kromosomer4,7,9,10. Det har visat sig att både parthenogenetiska och androgenetiska haESCs kan bidra till arvsmassan hos halvklonerade möss efter intracytoplasmisk injektion i äggceller. I motsats till andra tillvägagångssätt kan haESCs genom direkt modifieras i kulturen på grund av deras självförnyelsekapacitet. Att införa genetiska modifieringar i bakterien genom att ersätta spermier med haESCs är en viktig metod för biologiska studier. Det ger en möjlighet att separat odla och manipulera moderns eller faderliga genomet, som härrör från parthenogenetiska respektive androgenetiska haESCs. HaESCs kan sedan användas som gametic genomersättning, vilket är särskilt fördelaktigt för studier av genomisk prägling, allelspecifika uttryck och föräldraspecifika processer.
Hos möss krävs både moderns och faderliga genomisk information för normal embryoutveckling11. Därför kunde full-term valpar inte erhållas när vilda typ parthenogenetic haESCs (phaESCs) injicerades för att ersätta spermiegenomet5,8. För att övervinna utvecklingsblocket måste genomisk prägling av moderns genom av parthenogenetiska haESCs korrigeras till en faderlig konfiguration. Detta kan uppnås genom manipulering av de differentiellt metylerade regionerna (DMR). Hittills har riktade borttagningar av H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR och Rasgrf1-DMR studerats för att undertrycka moderligt uttryckta gener i phaESCs3,5,8,12. Dessa studier visade att borttagningar av både H19-DMR och IG-DMR är tillräckliga för att omvandla en moderns till en faderlig avtryckskonfiguration som kan ersätta spermier kromosomer. Intracytoplasmic injektion av phaESCs som bär de två DMR borttagningar i äggceller gav halvklonerade valpar med en frekvens mellan 5,1% och 15,5% av överförda 2-cells embryon.
Detta protokoll är baserat på tillämpningen av phaESCs med borttagningar av både H19-DMR och IG-DMR, som vi kallas dubbel-knockout phaESCs (DKO-phaESCs). Vi ger detaljerade instruktioner för modifiering av genomisk prägling i phaESCs för att upprätta DKO-phaESC linjer, för injektion av DKO-phaESCs i äggceller som ersättning för en spermier genom, för odling av halvklotade embryon till blastocyster, och för att erhålla halvklonerade möss. Detta protokoll är en referens för forskare som kräver exakt och direkt manipulering av det faderliga genomet och genereringen av halvklonerade embryon och möss.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mLTube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 125.150</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150628</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>167008</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M6250</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA fraction</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR 99021</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1386</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Demecolcine solution</td>
			<td>Merck</td>
			<td>D1925</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41965-039</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM / F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DR4 mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>3208</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>E5134</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>biowest</td>
			<td>S1810-500</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium</td>
			<td>amsbio</td>
			<td>11897</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Merck</td>
			<td>G1890</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-056</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irradiated MEF</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A34966</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF (Leukemia inhibitory factor)</td>
			<td>(Homemade)</td>
			<td>-</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofection reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NDiff 227</td>
			<td>Takara</td>
			<td>Y40002</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD 0325901</td>
			<td>Axon</td>
			<td>1408</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#40973</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piggyBac transposase plasmid</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>PB210PA-1</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX330 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#42230</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pX458 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>#48138</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td>haESC culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F549S</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0192</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100317</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109634</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Axon</td>
			<td>A3830</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Merck</td>
			<td>71729</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106404</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer</td>
			<td>Epeendorf</td>
			<td>5384000012</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T1503</td>
			<td>Genotyping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Tube with cell strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo Astrios EQ</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B25982</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.1640</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-gauge 1/2 inch needle</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Z192362-100EA</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6D2F1 mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>100006</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hCG</td>
			<td>MSD animal health</td>
			<td>49451</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010015</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG</td>
			<td>Avivasysbio</td>
			<td>OPPA1037 5000 IU</td>
			<td>Superovulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-cm dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>179830</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Center-well dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3260</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital rocker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>88880020</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A0878</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>Merck</td>
			<td>H4272</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MR-020P-5F</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M16 medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7292</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M7167</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Merck</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>Merck</td>
			<td>P1049-1PAK</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strontium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>13909</td>
			<td>Embryo manipulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringe</td>
			<td>Codan</td>
			<td>62.5607</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass cappilary</td>
			<td>Science product</td>
			<td>GB100T-8P</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTram 4r Oil</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5196000030</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorinert FC-770</td>
			<td>Merck</td>
			<td>F3556</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding pipette</td>
			<td>BioMedical Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti-U</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-900</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection pipette</td>
			<td>BioMedical Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlaoder tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252 956.003</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulaor arms</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>NT-88-V3</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-1000</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PiezoXpert</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5194000016</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVP (Polyvinylpyrrolidine)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>PVP360</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td>Microinjection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of mouse parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute of sperm

I organismer med sexuell reproduktion är könsceller källan till totipotenta celler som utvecklas till nya individer. Hos möss skapar befruktning av en oocyt av en spermatozoon en totipotent zygot. Nyligen har flera publikationer rapporterat att haploida embryonala stamceller (haESCs) kan ersätta gametiska genom och bidra till embryon, som utvecklas till möss. Här presenterar vi ett protokoll för att tillämpa parthenogenetic haESCs som en ersättning av spermier för att konstruera embryon genom intracytoplasmic injektion i äggceller. Detta protokoll består av steg för att förbereda haESCs som spermieersättning, för injektion av haESC-kromosomer i äggceller och för odling av halvklonerade embryon. Embryona kan ge bördiga halvklonerade möss efter embryoöverföring. Att använda haESCs som spermieersättning underlättar genomredigering i könscellen, studier av embryonal utveckling och undersökning av genomisk prägling.

Syftet med detta protokoll är att tillämpa haESCs som ersättning för spermier för att erhålla halvklonerade embryon och möss. För detta ändamål genererades och användes en DKO- phaESC-linje som transporterar CAG-EGFP-transgenen för intracytoplasmisk injektion i MII-äggceller. För att få en lämplig phaESC-linje med en faderlig avtryckskonfiguration utförde vi genteknik med Cas9-kärnor. En haploid ESC-linje innehåller haploid- och diploidceller som uppstår på grund av en inneboende tendens hos haploid-EIC för diploidisering10. En haploid kromosomuppsättning är en förutsättning för framgångsrik ersättning av spermiegenomet. DNA-innehållsanalys genom flödescytometri visar fördelningen av haploid- och diploida celler vid G0/G1-, S- och G2/M-faser (figur 2A).
För att fastställa DKO-phaESC linjer, wildtype phaESC linjer var transfected med piggyBac transposon konstruktioner för stabil transgenic EGFP uttryck och med CRISPR/Cas9 plasmider för att erhålla borttagningar av H19- och IG-DMRs. För att utesluta diploid-EIC och isolera endast haploid-EIC som uttrycker EGFP definierades en specifik sorteringsport (figur 2A). Enstaka haploid EGFP-positiva celler pläterades sedan till enskilda brunnar av 96-brunnsplattor för att erhålla subkloner. MEF-matare användes för att öka pläteringseffektiviteten och överlevnaden hos de transfekterade phaESCs. Efter expansion av kulturerna genomfördes en första omgång genotypning av PCR för att identifiera subkloner som bär borttagningar av båda DMR. Efter det att MEF-matare hade avlägsnats från kulturerna utfördes en andra genotypning för att bekräfta frånvaron av vildtyps alleler vid H19- och IG-DMRs (Figur 2B). Från totalt 135 delkloner erhöll vi 5 haploid DKO-phESC-linjer som bar de raderade allelerna och var fria från wildtype alleler av både H19-DMR och IG-DMR.
En CAG-EGFP-transgen introducerades i DKO-phaESCs för att studera deras bidrag till halvklonerade embryon genom visualisering av grön fluorescens under ett mikroskop (figur 3A). För intracytoplasmic injektion, DKO-phaESCs behandlades med demecolcine att arrestera dem i M-fas. Således synkroniserades cell cykeln av DKO-phaESCs med MII oocytes. Flöde cytometri analys visade 2 populationer som motsvarar G2/M fas arresterade haploid (2n) och diploid celler (4n) efter behandling med demecolcine (Figur 3B). Avsaknaden av 1n haploid topp anges att cell cykel gripandet var i stort sett fullständig. M-fas haploid ESCs sorterades sedan och injiceras i äggceller. För detta laddades en enda DKO-phaESC i mikroinjektionspipetten och injicerades i cytoplasman hos en MII-oocyt (figur 3C). Plasmamembranet i DKO-phaESC spruckit genom pipetting i spetsen av microinjection pipetten.
Efter injektionen upptäcktes EGFP-uttrycket sällan i de konstruerade halvklonerade embryona eftersom cytoplasman hos DKO- phaESCs hade spridit sig i den stora cytoplasman i äggcellen (figur 3D). I sällsynta fall kunde en rund plats av intensiv EGFP uttryck observeras inom ooplasm. Denna iakttagelse orsakades sannolikt av oavsiktlig injektion av intakta DKO- phaESCs. Underlåtenhet att brista DKO- phaESC-cellmembranet är sannolikt inte kompatibelt med ytterligare embryoutveckling och bör undvikas. En timme efter injektionen aktiverades embryon genom behandling med strontiumklorid18. Sex timmar efter aktiveringen observerades upp till 3 polära kroppar under mikroskopet(figur 3E). Dessa polära kroppar motsvarar de första och andra polära kropparna i äggcellen och en pseudopolär kropp från DKO-phaESC7. Dessutom observerades två pronuclei under en differential interferens kontrast mikroskop, som liknade pronuclear scenen av zygotes efter normala befruktning med spermier.
För att påvisa utvecklingskompetens odlades halvklotade embryon till blastocyststadiet (figur 5A). Dessutom erhölls en hel terminsmus efter överföring av halvklonerade 2-cellsembryon till äggledare hos en mottagande hona (figur 5B). Som förväntat var musen som härrörde från ett halvklonerat embryo en hona eftersom varken äggceller eller oocyt-härledda phaESCs bär en Y-kromosom. Den halvklonerade musen var alltför normal och producerade friska avkommor när de parades med en vildtyp schweizisk Webster-hane. Hittills har den halvklonerade musen levt i över 600 dagar utan några uppenbara hälsoproblem.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig01v3.jpg"> Figur 1: Översikt över tillämpningen av DKO-phaESCs som spermieersättning. A)En tidsram för protokollets förfaranden. (B) Systemet visar stegen för att upprätta DKO-phaESC-linjer (steg 1–6). C)Systemet visar stegen för att konstruera halvklonerade embryon genom intracytoplasmisk injektion av en DKO-phaESC till en MII-oocyt (steg 7–14). Förkortningar: DKO = dubbel knockout; phaESC = delhogenetisk haploid embryonal stamcell; FACS = fluorescensaktiverad cellsortering; MEF = mus embryonal fibroblast. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig02v2.jpg"> Figur 2: Fastställande av DKO-phaESC-linjer genom CRISPR/Cas9-medierade borttagningar av H19- och IG-DMR. ( A) Flöde cytometri analys av phaESCs efter transfection med piggyBac plasmider för stabila EGFP uttryck och med 4 CRISPR/Cas9 plasmider. Icke-transfecterade phaESCs visas som kontroll. DNA-profilen (överst) visar cellcykelfördelningen av haploid- och diploidceller. G1/S-fas haploidceller som uttrycker EGFP indikeras av den gröna porten (botten, höger). B)Genotypning av phaESC-underkloner som odlades på MEF (första genotypningen) och efter avlägsnande av mef-fonder (andra genotypningen). Subklonerade phaESC-linjer 1, 2, 3 och 4 representerar wildtype-celler, celler med en H19-DMR-borttagning, med en IG-DMR-radering och med kombinerade H19- respektive IG-DMR-borttagningar. DKO-phaESC linjer 5-8 har både H19-DMR och IG-DMR borttagningar och är fria från wildtype alleler. Förkortningar: DKO = dubbel knockout; phaESC = delhogenetisk haploid embryonal stamcell; DMR = differentiellt metylerad region; MEF = mus embryonal fibroblast; EGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein; WT = vildtyp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig03v3.jpg"> Figur 3: Injektion av mitotiskt arresterade DKO- phaESCs i MII-äggceller. a)Morfologi av en DKO-phaESC-kultur som bär en CAG-EGFP-transgen och borttagningar av H19- och IG-DMR. skala bommar för = 50 μm. (B) Representativ flöde cytometry analys av DKO-phaESCs efter gripande med demecolcine för 8 h. DKO-phaESCs utan demecolcine behandling visas som kontroll. C)Morfologi av DKO-phaESCs i mikroinjektionspipetten. En enda intakt DKO-phaESC före (vänster) och efter (höger) spräckning av plasmamembranet genom pipetting visas; skala bar = 20 μm. (D) Konstruerade embryon vid 1 h efter injektion av DKO-phaESCs i MII oocyter. En sammanslagen bild av EGFP fluorescens och ljust fält visas. Svarta pilspetsar indikerar runda fläckar av intensivt EGFP-uttryck efter injektion av intakta DKO-phaESCs, vilket bör undvikas. skalstång = 50 μm. (E) En differential interferenskontrastbild av halvklonerade embryon 6 h efter aktivering med strontiumklorid visas. Vita pilspetsar indikerar embryon med 3 polära kroppar, inklusive en pseudopolär kropp från den injicerade DKO-phaESC. skalstång = 50 μm. Förkortningar: DKO = dubbel knockout; phaESC = delhogenetisk haploid embryonal stamcell; EGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig04.jpg"> Figur 4: Inställningsschema för intracytoplasmisk injektion av DKO- phaESCs i äggceller. a)Arrangemanget av en injektionspipett, en hållrörett och en äggcell i injektionskammaren visas. α, böj vinkeln på mikroinjektionspipeetten. B)Uppställning av dropparna i mikromanipulationsskålen för intracytoplasmisk injektion. Förkortningar: DKO = dubbel knockout; phaESC = delhogenetisk haploid embryonal stamcell. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61999/61999fig05.jpg"> Figur 5: Utveckling av halvklonerade embryon. A)Utveckling före implantation av halvklonerade embryon in vitro. EGFP uttryck observeras ursprungligen i fyra-cells embryon dag 2 efter intracytoplasmic injektion. Vid dag 4 kan intensiva EGFP-uttryck observeras i blastocyster; skalstång = 100 μm. (B) En halvklonerad mus som erhållits efter 2-cells embryoöverföring till en mottagande hona. Vid 74 dpp levererade den halvklonerade musen (pilspetsen) sina första valpar (asterisk) genom naturlig födsel efter parning med en vildtyp schweizisk Webster-hane. Halvklonerade embryon och den halvklonerade musen som visas i denna siffra är identiska med de som rapporteras i Aizawa et al.3. Förkortningar: EGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein; .dpp, dagar efter partum. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61999/61999fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">Gelatinlösning</td>
		</tr><tr><td>Komponent</td>
			<td>Lagerkoncentration</td>
			<td>Volym/vikt</td>
			<td>Slutlig koncentration</td>
		</tr><tr><td>Vatten</td>
			<td>-</td>
			<td>500 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Gelatin</td>
			<td>-</td>
			<td>1 g</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Haploid embryonal stamcell (HaESC) medium</td>
		</tr><tr><td>Komponent</td>
			<td>Lagerkoncentration</td>
			<td>Volym/vikt</td>
			<td>Slutlig koncentration</td>
		</tr><tr><td>NDiff 227</td>
			<td>-</td>
			<td>10 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>CHIR 99021</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>3 μL</td>
			<td>3 μM</td>
		</tr><tr><td>PD 0325901</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>1 μM</td>
		</tr><tr><td>Lif</td>
			<td>1 x 106 IE/ml</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>1 000 IE/ml</td>
		</tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>100x</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">HaESC underhållsbuffert</td>
		</tr><tr><td>Komponent</td>
			<td>Lagerkoncentration</td>
			<td>Volym/vikt</td>
			<td>Slutlig koncentration</td>
		</tr><tr><td>HaESC-medium</td>
			<td>-</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>HEPES-lösning</td>
			<td>2 .</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Tvätta buffert</td>
		</tr><tr><td>Komponent</td>
			<td>Lagerkoncentration</td>
			<td>Volym/vikt</td>
			<td>Slutlig koncentration</td>
		</tr><tr><td>DMEM / F-12</td>
			<td>-</td>
			<td>100 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>BSA-fraktion</td>
			<td>7.5%</td>
			<td>7,1 ml</td>
			<td>0.5%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">MEF-medium</td>
		</tr><tr><td>Komponent</td>
			<td>Lagerkoncentration</td>
			<td>Volym/vikt</td>
			<td>Slutlig koncentration</td>
		</tr><tr><td>DMEM (dmem)</td>
			<td>-</td>
			<td>500 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Fbs</td>
			<td>-</td>
			<td>56 ml</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>β-Mercaptoethanol</td>
			<td>14.3 mol/L</td>
			<td>3,9 μL</td>
			<td>100 μM</td>
		</tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>100x</td>
			<td>5,6 ml</td>
			<td>1x</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Lysis buffert</td>
		</tr><tr><td>Komponent</td>
			<td>Lagerkoncentration</td>
			<td>Volym/vikt</td>
			<td>Slutlig koncentration</td>
		</tr><tr><td>Vatten</td>
			<td>-</td>
			<td>8,25 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCl (pH 8.5)</td>
			<td>2 .</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr><tr><td>Edta</td>
			<td>0,5 M</td>
			<td>100 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>SDS-lösning</td>
			<td>10%</td>
			<td>200 μL</td>
			<td>0.2%</td>
		</tr><tr><td>Nacl</td>
			<td>5 M</td>
			<td>400 μL</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr><tr><td>Proteinas K</td>
			<td>20 mg/ml</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>100 μg/ml</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Aktiveringsmedium</td>
		</tr><tr><td>Komponent</td>
			<td>Lagerkoncentration</td>
			<td>Volym/vikt</td>
			<td>Slutlig koncentration</td>
		</tr><tr><td>KSOM (KSOM)</td>
			<td>-</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Strontiumklorid</td>
			<td>2 .</td>
			<td>5 μL</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr><tr><td>EGTA (egta)</td>
			<td>0,5 M, pH 8,0</td>
			<td>4 μL</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">PVP-lösning</td>
		</tr><tr><td>Komponent</td>
			<td>Lagerkoncentration</td>
			<td>Volym/vikt</td>
			<td>Slutlig koncentration</td>
		</tr><tr><td>M2 medium</td>
			<td>-</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Pvp</td>
			<td>-</td>
			<td>0,6 g</td>
			<td>12%</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG-lösning</td>
		</tr><tr><td>Komponent</td>
			<td>Lagerkoncentration</td>
			<td>Volym/vikt</td>
			<td>Slutlig koncentration</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>PMSG (pmsg)</td>
			<td>500 IE/ml</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 IE/ml</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">hCG-lösning</td>
		</tr><tr><td>Komponent</td>
			<td>Lagerkoncentration</td>
			<td>Volym/vikt</td>
			<td>Slutlig koncentration</td>
		</tr><tr><td>Pbs</td>
			<td>-</td>
			<td>450 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Hcg</td>
			<td>500 IE/ml</td>
			<td>50 μL</td>
			<td>50 IE/ml</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Hyaluronidase medium</td>
		</tr><tr><td>Komponent</td>
			<td>Lagerkoncentration</td>
			<td>Volym/vikt</td>
			<td>Slutlig koncentration</td>
		</tr><tr><td>M2 medium</td>
			<td>-</td>
			<td>380 μL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Hyaluronidase</td>
			<td>10 mg/ml</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>0,5 mg/ml</td>
		</tr><tr><td colspan="4"></td>
		</tr><tr><td colspan="4">Förkortningar: LIF = leukemihämmande faktor; MEF = mus embryonal fibroblast;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">FBS = fetala nötkreatur serum; DMEM = Dulbeccos modifierade örnmedium; BSA = bovint serumalbumin;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">EDTA = etylendiaminetetraacetsyra; SDS = natriumdcylsulfat; EGTA = etylen-bis(oxyetylennitrilo)tetraättiksyra;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PBS = fosfatbuffrad saltlösning. PVP = polyvinylpyrrolidon; hCG = humant chorionic gonadotropin;</td>
		</tr><tr><td colspan="4">PMSG = gravid mare serum gonadotropin.</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Recept på medium, buffert och lösning.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Namn</td>
			<td colspan="2">Sekvens (5'till 3')</td>
			<td>Program</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG</td>
			<td>Genotypning</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">AGA TGG GGT CAT TCT TTT CC</td>
			<td>Genotypning</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT</td>
			<td>Genotypning</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P1</td>
			<td colspan="2">TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG</td>
			<td>Genotypning</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P2</td>
			<td colspan="2">CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA</td>
			<td>Genotypning</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-P3</td>
			<td colspan="2">ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG</td>
			<td>Genotypning</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCA GTC TCT TCT GAG TTC ATG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CAG GTG AGA ACC ACT GCT GAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>H19-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA1-R</td>
			<td colspan="2">AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-F</td>
			<td colspan="2">CAC CCT GCT-TAGG AGG TAC TAC GCT</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
<tr>
<td>IG-DMR-gRNA2-R</td>
			<td colspan="2">AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG</td>
			<td>gRNA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: Förteckning över oligonukleotider.

Watch this Scientific Journal Video about Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm at JoVE.com

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

Denna artikel syftar till att demonstrera användningen av parthenogenetic haploid embryonala stamceller som ersättning för spermier för konstruktion av halvklonerade embryon.

Applicering av musen parthenogenetiska haploida embryonala stamceller som ersättning för spermier

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Härledning av Cardiac progenitorceller från embryonala stamceller

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

Neural differentiering av Mouse embryonala stamceller i Serumfri enskiktskultur

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Generera crispr / Cas9 medierad monoallel Strykningar att studera Enhancer Funktion i mus embryonala stamceller

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolering av murina embryonala Hemogenic endotelceller

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produktionen av pluripotenta stamceller från mus fostervatten celler med användning av en transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Structure-function Studies in Mouse Embryonic Stem Cells Using Recombinase-mediated Cassette Exchange

Struktur-funktionsstudier i mus embryonala stamceller Använda Recombinase-medierad kassett Exchange

Gene engineering in mouse embryos or embryonic stem cells (mESCs) allows for the study of the function of a given protein. Proteins are the workhorses of ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Horisontell helmontering: Ett nytt bearbetnings- och bildprotokoll för tjocka, tredimensionella vävnads tvärsnitt av huden

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational analys av den Caenorhabditis elegans könsceller att studera fördelningen av atomkärnor, proteiner och cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Hemogena Endotelium differentiering från mänskliga pluripotenta stamceller i en feeder-och Xeno-fritt definierade villkor

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...