Name: gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)
Uploaded: 2020-12-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes at JoVE.com

Forfatterne takker Fru Lourdes Carreon G Tan for hendes hjælp i fiskeopdræt. Dette arbejde blev finansieret af NMBU, Grants-in-Aid fra Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Grant nummer 18H04881 og 18K19323), og tilskud til Grundforskning Forskningsprojekter fra Sumitomo Foundation til S.K.

Alle forsøg og dyrehåndtering blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne om forsøgsdyr på Norges Biovidenskabelige Universitet. Forsøg med gonadektomi blev godkendt af den norske fødevaresikkerhedsautoritet (FOTS ID 24305).
BEMÆRK: Forsøgene blev udført ved hjælp af voksne mænd og kvinder (6-7 måneder gamle, vægt ca. 0,35 g, længde ca. 2,7 cm) japansk medaka. Kønnet blev bestemt ved at skelne mellem de sekundære seksuelle egenskaber, såsom størrelsen og formen af ryg-...

Som rapporteret i tidligere litteratur, gonadektomi og blodprøvetagning har længe været brugt i andre model arter til at undersøge spørgsmål i forbindelse med den rolle, sex steroider i regulering af BPG akse. Men disse teknikker synes at være modtagelige kun for større dyr. I betragtning af den lille størrelse af den almindeligt anvendte teleostmodel, japansk medaka, leverer vi en detaljeret protokol for gonadektomi og blodprøvetagning, der er mulig for denne art.
Det faktum, at ove...

I hvirveldyr, sex steroider, som hovedsagelig produceres af gonaderne, spiller vigtige roller i reguleringen af Brain-Pituitary-Gonadal (BPG) akse gennem forskellige feedback mekanismer1,2,3,4,5. Derudover påvirker sex steroider spredning og aktivitet af neuroner i hjernen6,7,8 og endokrine celler, herunder gonadotropes, i hypofysen9,10, og dermed tjene afgørende roller i hjernen og hypofysen plasticitet. På trods af relativt god viden hos pattedyr er mekanismen i BPG-aksereguleringen, der er medieret af sex steroider, langt fra at blive forstået hos ikke-pattedyrarter, hvilket fører til dårlig forståelse af evolutionære bevarede principper11. Der er stadig et begrænset antal undersøgelser, der dokumenterer den rolle, sex steroider på hjernen og hypofysen plasticitet, hvilket øger behovet for yderligere undersøgelser af rolle og virkninger af sex steroider på forskellige hvirveldyr arter.
Blandt hvirveldyr er teleosts blevet kraftfulde modeldyr til at løse mange biologiske og fysiologiske spørgsmål, herunder stressrespons12,13, vækst14,15, ernæringsmæssig fysiologi16,17 og reproduktion2. Teleosts, hvor sex steroider er for det meste repræsenteret ved estradiol (E2) hos kvinder og 11-ketotestosterone (11-KT) hos mænd18,19, har længe været pålidelige eksperimentelle modeller til undersøgelse af det generelle princip om reproduktion på tværs af arter. Teleosts viser unikhed i deres hypothalamic-hypofyseforbindelse20,21 og forskellige gonadotrope celler22, som undertiden er bekvemme til belyselse af reguleringsmekanismer. Desuden tilbyder teleosts mange fordele i forhold til andre organismer på grund af deres evne til både laboratorie- og feltforsøg. De er relativt billige at købe og vedligeholde23,24. Især små teleostmodeller som zebrafisk (Danio rerio) og den japanske medaka (Oryzias latipes), er arter med meget høj fecundity og en relativt kort livscyklus, der muliggør hurtig analyse af genfunktion og sygdomsmekanismer23,hvilket giver endnu større fordele ved at løse en overflod af biologiske og fysiologiske spørgsmål i betragtning af de mange veludviklede protokoller og genetiske værktøjskasse, der er tilgængelige for disse arter25.
I talrige undersøgelser er fjernelsen af gonader (gonadektomi) sammen med blodprøvetagningsteknikker blevet brugt som en metode til at undersøge mange fysiologiske spørgsmål, herunder dens indvirkning i hvirveldyr reproduktiv fysiologi hos pattedyr26,27,28, fugle29 og amfibier30. Selv om gonadektomi effekt på reproduktiv fysiologi kan alternativt efterlignes af sex steroid antagonister, såsom tamoxifen og clomiphene, effekten af narkotika synes at være inkonsekvent på grund af bimodale virkninger31,32. Kronisk eksponering for en sex steroid antagonist kan føre til ovarie udvidelsen33,34, som kan deaktivere observation af dens virkninger til langsigtede formål på grund af en usund fænotype. Derudover er det umuligt at udføre et opsving eksperiment efter sex steroid antagonistisk behandling, at berettige den specifikke effekt af visse køn steroider. Sammen med disse ovennævnte punkter, andre kompromiser af sex steroid antagonistisk brug er blevet grundigt gennemgået31,32. Derfor, gonadectomy stadig vises i dag som en kraftfuld teknik til at undersøge den rolle, sex steroider.
Mens gonadektomi og blodprøvetagning teknikker er relativt let at udføre i større arter, såsom europæisk havabbor (Dicentrarchus labrax)35, bluehead wrasse (Thalassoma bifasciatum)36, dogfish (Scyliorhinus canicula)37 og havkat (Heteropneustes fossilis og Clarias bathracus)38,39, de rejserudfordringer,når de anvendes i små fisk som medaka. For eksempel er brugen af Fish Anesthesia Delivery System (FADS)40 mindre mulig og synes at være tilbøjelig til overdreven fysisk skade for små fisk. Derudover er en gonadektomiprocedure, der almindeligvis anvendes til større fisk40, ikke egnet til små fisk, der kræver høj præcision for at undgå overdreven skade. Endelig er blodprøvetagning udfordrende på grund af den begrænsede adgang til blodkar og den lille mængde blod i disse dyr. Derfor er en klar protokol, der demonstrerer hvert trin af gonadektomi og blodprøvetagning i en lille teleost, af betydning.
Denne protokol viser de trinvise procedurer for gonadektomi efterfulgt af blodprøvetagning i japansk medaka, en lille ferskvandsfisk hjemmehørende i Østasien. Japansk medaka har et sekventeret genom, flere molekylære og genetiske værktøjer til rådighed25, og en genetisk kønsbestemmelse system giver mulighed for undersøgelse af seksuelle forskelle, før sekundære seksuelle egenskaber eller gonader er veludviklede41. Interessant nok besidder japansk medaka smeltede gonader i modsætning til mange andre teleostarter42. Disse to teknikker tilsammen tager kun 8 minutter i alt og vil fuldføre listen over videoprotokoller, der allerede findes for denne art, der omfattede mærkning af blodkar43, patch-klemme på hypofyse sektioner44 og hjernen neuroner45,og primær celle kultur46. Disse teknikker vil gøre det muligt for forskersamfundet at undersøge og bedre forstå roller sex steroider i feedback mekanismer samt hjerne og hypofyse plasticitet i fremtiden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass capilary</td>
			<td></td>
			<td>GD1</td>
			<td>Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td></td>
			<td>H4784-1G</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td></td>
			<td>P97</td>
			<td>Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon thread</td>
			<td></td>
			<td>N45VL</td>
			<td>Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube</td>
			<td></td>
			<td>T9661</td>
			<td>Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone capillary</td>
			<td></td>
			<td>a16090800ux0403</td>
			<td>Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td></td>
			<td>WXBC9102V</td>
			<td>Aldrich chemistry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)

Sex steroider, produceret af gonaderne, spiller en væsentlig rolle i hjernen og hypofysen væv plasticitet og i neuroendokrine kontrol af reproduktion i alle hvirveldyr ved at give feedback til hjernen og hypofysen. Teleost fisk besidder en højere grad af væv plasticitet og variation i reproduktive strategier i forhold til pattedyr og synes at være nyttige modeller til at undersøge den rolle, sex steroider og de mekanismer, som de virker. Fjernelsen af den vigtigste kilde til sex steroid produktion ved hjælp af gonadektomi sammen med blodprøvetagning til at måle steroid niveauer har været veletableret og temmelig muligt i større fisk og er en kraftfuld teknik til at undersøge rolle og virkninger af sex steroider. Men disse teknikker rejser udfordringer, når de gennemføres i små størrelse teleost modeller. Her beskriver vi de trinvise procedurer for gonadektomi hos både mænd og kvindelig japansk medaka efterfulgt af blodprøvetagning. Disse protokoller er vist sig at være meget muligt i medaka angivet ved en høj overlevelsesrate, sikkerhed for levetiden og fænotypen af fisken, og reproducerbarhed i form af sex steroid clearance. Brugen af disse procedurer kombineret med de andre fordele ved at bruge denne lille teleost model vil i høj grad forbedre forståelsen af feedback mekanismer i neuroendokrine kontrol af reproduktion og væv plasticitet fra sex steroider i hvirveldyr.

Denne protokol beskriver hvert skridt for at udføre gonadektomi og blodprøvetagning i en lille størrelse model teleost, den japanske medaka. Overlevelsesraten for fisken efter ovariektomi (OVX) hos kvinder er 100% (10 ud af 10 fisk), mens 94% (17 ud af 18 fisk) af mændene overlevede efter orkidéektomi. I mellemtiden, efter blodprøvetagningsproceduren blev udført, overlevede alle (38 fisk) fisk.
Sham-opererede hunner viser...

Watch this Scientific Journal Video about Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes at JoVE.com

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

Artiklen beskriver en hurtig protokol til gonadectomize og prøve blod fra den lille teleost fisk, ved hjælp af japansk medaka (Oryzias latipes) som en model, at undersøge den rolle, sex steroider i dyr fysiologi.

Gonadektomi og blodprøvetagning procedurer i den lille størrelse Teleost Model japanske Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Seawater Sampling and Collection

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass ...

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

Kvantificering Single mikrokardannelse Permeability i Isoleret Blood-perfunderet rottelunge Forberedelse

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Ikke-Terminal blodprøvetagning teknikker i marsvin

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blodprøvetagning fra den laterale halevene af Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Noninvasiv overvågning af læsion størrelse i en heterolog musemodel af endometriose

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...