Name: gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)
Uploaded: 2020-12-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes at JoVE.com

Die Autoren danken Frau Lourdes Carreon G Tan für ihre Unterstützung bei der Fischzucht. Diese Arbeit wurde von NMBU, Grants-in-Aid der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Grant-Nummer 18H04881 und 18K19323) und Zuschüssen für Grundlagenforschungsprojekte von der Sumitomo Foundation an S.K.

Alle Experimente und der Umgang mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen zum experimentellen Tierschutz an der Norwegian University of Life Sciences durchgeführt. Experimente mit Gonadeektomie wurden von der norwegischen Behörde für Lebensmittelsicherheit genehmigt (FOTS ID 24305).
HINWEIS: Die Experimente wurden mit erwachsenen männlichen und weiblichen (6-7 Monate alt, Gewicht ca. 0,35 g, Länge ca. 2,7 cm) japanischen Medaka durchgeführt. Das Geschlecht wurde durch Un...

Wie in früheren Literaturliteratur berichtet, werden Gonadektomie und Blutentnahme seit langem in anderen Modellarten verwendet, um Fragen im Zusammenhang mit der Rolle von Sexualsteroiden bei der Regulierung der BPG-Achse zu untersuchen. Diese Techniken scheinen jedoch nur für größere Tiere geeignet zu sein. In Anbetracht der geringen Größe des häufig verwendeten Teleostmodells, der japanischen Medaka, bieten wir ein detailliertes Protokoll für Gonadektomie und Blutentnahme, das für diese Spezies machbar ist.</...

Bei Wirbeltieren spielen Sexualsteroide, die hauptsächlich von den Gonaden produziert werden, eine wichtige Rolle bei der Regulation der Gehirn-Hypophysen-Gonaden-Achse (BPG) durch verschiedene Rückkopplungsmechanismen1,2,3,4,5. Darüber hinaus beeinflussen Sexualsteroide die Proliferation und Aktivität von Neuronen im Gehirn6,7,8 und endokrinen Zellen, einschließlich Gonadotropen, in der Hypophyse9,10und spielen somit eine entscheidende Rolle bei der Plastizität von Gehirn und Hypophyse. Trotz relativ guter Kenntnisse bei Säugetieren ist der Mechanismus der BPG-Achsenregulation, der durch Sexualsteroide vermittelt wird, bei Nicht-Säugetierarten weit davon entfernt, verstanden zu werden, was zu einem schlechten Verständnis der evolutionär konservierten Prinzipien führt11. Es gibt immer noch eine begrenzte Anzahl von Studien, die die Rolle von Sexualsteroiden auf die Plastizität von Gehirn und Hypophyse dokumentieren, was die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen der Rolle und der Auswirkungen von Sexualsteroiden auf verschiedene Wirbeltierarten erhöht.
Unter den Wirbeltieren sind Teleoste zu mächtigen Modelltieren geworden, die zahlreiche biologische und physiologische Fragen beantworten, einschließlich Stressreaktion12,13, Wachstum14,15, Ernährungsphysiologie16,17 und Fortpflanzung2. Teleosten, bei denen Sexualsteroide hauptsächlich durch Östradiol (E2) bei Weibchen und 11-Ketotestosteron (11-KT) bei Männchen18,19vertreten sind, sind seit langem zuverlässige experimentelle Modelle zur Untersuchung des allgemeinen Prinzips der Fortpflanzung über Arten hinweg. Teleoste zeigen Einzigartigkeit in ihrer Hypothalamus-Hypophysen-Verbindung20,21 und verschiedenen Gonadotropzellen22, die manchmal für die Aufklärung von Regulationsmechanismen geeignet sind. Darüber hinaus bieten Teleoste aufgrund ihrer Zugänglichkeit für Labor- und Feldexperimente viele Vorteile gegenüber anderen Organismen. Sie sind relativ kostengünstig in der Anschaffung und Wartung23,24. Insbesondere kleine Teleostmodelle wie Zebrafische (Danio rerio) und die japanische Medaka (Oryzias latipes) sind Arten mit sehr hoher Fruchtbarkeit und einem relativ kurzen Lebenszyklus, die eine schnelle Analyse der Genfunktion und Krankheitsmechanismen ermöglichen23, was angesichts der zahlreichen gut entwickelten Protokolle und des genetischen Toolkits, die für diese Arten verfügbar sind, noch größere Vorteile bei der Behandlung einer Vielzahl biologischer und physiologischer Fragen bietet25.
In zahlreichen Studien wurde die Entfernung von Gonaden (Gonadektomie) zusammen mit Blutentnahmetechniken als Methode zur Untersuchung vieler physiologischer Fragen verwendet, einschließlich ihrer Auswirkungen auf die Fortpflanzungsphysiologie von Wirbeltieren bei Säugetieren26,27,28,Vögeln 29 und Amphibien30. Obwohl die Gonadeektomie-Wirkung auf die Fortpflanzungsphysiologie alternativ von Sexualsteroidantagonisten wie Tamoxifen und Clomifen nachgeahmt werden kann, scheint die Wirkung der Medikamente aufgrund bimodaler Wirkungen inkonsistent zu sein31,32. Chronische Exposition gegenüber einem Sexualsteroidantagonisten kann zu einer Ovarialvergrößerung führen33,34, die die Beobachtung seiner Auswirkungen für langfristige Zwecke aufgrund eines ungesunden Phänotyps deaktivieren kann. Darüber hinaus ist es unmöglich, ein Erholungsexperiment nach der Behandlung mit Sexualsteroidantagonisten durchzuführen, um die spezifische Wirkung bestimmter Sexualsteroide zu gewährleisten. Zusammen mit diesen oben genannten Punkten wurden andere Kompromisse bei der Verwendung von Sexsteroid-Antagonisten ausführlich überprüft31,32. Daher erscheint die Gonadektomie auch heute noch als eine leistungsfähige Technik, um die Rolle von Sexualsteroiden zu untersuchen.
Während Gonadektomie- und Blutentnahmetechniken bei größeren Arten wie dem Europäischen Wolfsbarsch (Dicentrarchus labrax)35, Dem Blaukopflippfisch (Thalassoma bifasciatum)36, Dornhai (Scyliorhinus canicula)37 und Wels (Heteropneustes fossilis und Clarias bathracus)38,39) relativ einfach durchzuführen sind, stellen sie Herausforderungen dar, wenn sie bei kleinen Fischen als Medaka angewendet werden. Zum Beispiel ist die Verwendung von Fish Anesthesia Delivery System (FADS)40 weniger machbar und scheint anfällig für übermäßige körperliche Schäden für kleine Fische zu sein. Darüber hinaus ist ein Gonadektomieverfahren, das üblicherweise für größere Fische40 verwendet wird, nicht für kleine Fische geeignet, die eine hohe Präzision erfordern, um übermäßige Schäden zu vermeiden. Schließlich ist die Blutentnahme aufgrund des begrenzten Zugangs zu Blutgefäßen und der geringen Blutmenge bei diesen Tieren eine Herausforderung. Daher ist ein klares Protokoll, das jeden Schritt der Gonadeektomie und Blutentnahme in einem kleinen Teleost demonstriert, von Bedeutung.
Dieses Protokoll demonstriert die Schrittweisen Verfahren der Gonadektomie, gefolgt von Blutentnahmen in japanischen Medaka, einem kleinen Süßwasserfisch, der in Ostasien beheimatet ist. Japanische Medaka haben ein sequenziertes Genom, mehrere molekulare und genetische Werkzeuge zur Verfügung25und ein genetisches Geschlechtsbestimmungssystem, das die Untersuchung sexueller Unterschiede ermöglicht, bevor sekundäre Geschlechtsmerkmale oder Gonaden gut entwickelt sind41. Interessanterweise besitzen japanische Medaka verschmolzene Gonaden im Gegensatz zu vielen anderen Teleost-Arten42. Diese beiden Techniken zusammen dauern insgesamt nur 8 Minuten und vervollständigen die Liste der bereits für diese Spezies vorhandenen Videoprotokolle, darunter die Markierung von Blutgefäßen43,Patch-Clamp an Hypophysenabschnitten44 und Gehirnneuronen45und primäre Zellkultur46. Diese Techniken werden es der Forschungsgemeinschaft ermöglichen, die Rolle von Sexualsteroiden in Feedback-Mechanismen sowie die Plastizität von Gehirn und Hypophyse in Zukunft zu untersuchen und besser zu verstehen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass capilary</td>
			<td></td>
			<td>GD1</td>
			<td>Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td></td>
			<td>H4784-1G</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td></td>
			<td>P97</td>
			<td>Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon thread</td>
			<td></td>
			<td>N45VL</td>
			<td>Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube</td>
			<td></td>
			<td>T9661</td>
			<td>Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone capillary</td>
			<td></td>
			<td>a16090800ux0403</td>
			<td>Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td></td>
			<td>WXBC9102V</td>
			<td>Aldrich chemistry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)

Sexualsteroide, die von den Gonaden produziert werden, spielen eine wesentliche Rolle bei der Plastizität von Gehirn und Hypophysengewebe und bei der neuroendokrinen Kontrolle der Fortpflanzung bei allen Wirbeltieren, indem sie dem Gehirn und der Hypophyse Rückmeldung geben. Teleostfische besitzen im Vergleich zu Säugetieren einen höheren Grad an Gewebeplastizität und Variation der Fortpflanzungsstrategien und scheinen nützliche Modelle zu sein, um die Rolle von Sexualsteroiden und die Mechanismen, mit denen sie wirken, zu untersuchen. Die Entfernung der Hauptquelle der Sexualsteroidproduktion durch Gonadektomie zusammen mit Blutentnahme zur Messung des Steroidspiegels ist bei größeren Fischen gut etabliert und ziemlich machbar und ist eine leistungsstarke Technik, um die Rolle und Auswirkungen von Sexualsteroiden zu untersuchen. Diese Techniken werfen jedoch Herausforderungen auf, wenn sie in kleinen Teleostmodellen implementiert werden. Hier beschreiben wir die schrittweisen Verfahren der Gonadektomie sowohl bei Männern als auch bei weiblichen japanischen Medakas, gefolgt von Blutentnahmen. Diese Protokolle haben sich in Medaka als sehr praktikabel erwiesen, was durch eine hohe Überlebensrate, Sicherheit für die Lebensdauer und den Phänotyp der Fische und Reproduzierbarkeit in Bezug auf die Clearance von Sexualsteroiden angezeigt wird. Die Verwendung dieser Verfahren in Kombination mit den anderen Vorteilen der Verwendung dieses kleinen Teleostmodells wird das Verständnis der Rückkopplungsmechanismen bei der neuroendokrinen Kontrolle der Fortpflanzung und der Gewebeplastizität von Sexualsteroiden bei Wirbeltieren erheblich verbessern.

Dieses Protokoll beschreibt jeden Schritt zur Durchführung von Gonadeektomie und Blutentnahme in einem kleinen Modellteletost, dem japanischen Medaka. Die Überlebensrate der Fische nach Ovariektomie (OVX) bei Weibchen beträgt 100% (10 von 10 Fischen), während 94% (17 von 18 Fischen) der Männchen nach orchidektomie überlebten. In der Zwischenzeit, nachdem die Blutentnahme durchgeführt wurde, überlebten alle (38 Fische) Fische.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-pag...

Watch this Scientific Journal Video about Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes at JoVE.com

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

Der Artikel beschreibt ein schnelles Protokoll zur Gonadekttomisierung und Blutentnahme aus dem kleinen Teleostfisch, wobei japanische Medaka(Oryzias latipes)als Modell verwendet wird, um die Rolle von Sexualsteroiden in der Tierphysiologie zu untersuchen.

Gonadektomie und Blutentnahmeverfahren im Small Size Teleost Modell Japanische Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Seawater Sampling and Collection

Meerwasser Probenahme und Sammlung

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass ...

Forschung

Biologie

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Nichtinvasive In Vivo Small Animal MRI und MRS: Basic Experimentelle Verfahren

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

Mikroinjektion von Medaka Embryonen für die Verwendung als Modell Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Dechorionation von Medaka Embryonen und Zell-Transplantation für die Erzeugung von Chimären

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount Immunhistochemische Analyse für Embryonale Limb Haut Gefäßsystem: ein Modellsystem zur Vascular Branching Morphogenese in Embryo-Studie

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Ein nicht-invasives Haar Sampling-Technik, um High Quality DNA aus Elusive Kleinsäuger erhalten

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

Quantifizierung der Mikrogefäßdurchlässigkeit im Einzel isolierten Blutdurchbluteten Lungen Rat Vorbereitung

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Nicht-Terminal-Blut-Stichprobenverfahren bei Meerschweinchen

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Blutprobenentnahme aus der laterale Schwanzvene der Ratte

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Nicht-invasive Überwachung der Größe der Läsion in einer heterologen Mausmodell der Endometriose

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...