Name: gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)
Uploaded: 2020-12-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes at JoVE.com

Forfatterne takker Fru Lourdes Carreon G Tan for hennes hjelp i fiskeholdet. Dette arbeidet ble finansiert av NMBU, Grants-in-Aid fra Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Tilskuddsnummer 18H04881 og 18K19323), og tilskudd til grunnvitenskapelige forskningsprosjekter fra Sumitomo Foundation til S.K.

Alle eksperimenter og dyrehåndtering ble gjennomført i henhold til anbefalingene om eksperimentell dyrevelferd ved Norges biovitenskapelige universitet. Forsøk med gonadektomi ble godkjent av Mattilsynet (FOTS ID 24305).
MERK: Forsøkene ble utført med voksen mann og kvinne (6-7 måneder gammel, vekt ca. 0,35 g, lengde ca. 2,7 cm) japansk medaka. Kjønnet ble bestemt ved å skille de sekundære seksuelle egenskapene, for eksempel størrelsen og formen på dorsal og analfin, som beskrevet i...

Som rapportert i tidligere litteratur, gonadectomy og blodprøvetaking har lenge vært brukt i andre modellarter for å undersøke spørsmål knyttet til rollen som sex steroider i regulering av BPG-aksen. Imidlertid ser disse teknikkene ut til å være mottagelige bare for større dyr. Tatt i betraktning den lille størrelsen på den ofte brukte teleostmodellen, japansk medaka, gir vi en detaljert protokoll for gonadektomi og blodprøvetaking som er mulig for denne arten.
Det faktum at overle...

I vertebrater spiller sex steroider, som hovedsakelig produseres av gonadene, viktige roller i reguleringen av Brain-Pituitary-Gonadal (BPG) -aksen gjennom ulike tilbakemeldingsmekanismer1,2,3,4,5. I tillegg påvirker sex steroider spredning og aktivitet av nevroner i hjernen6,7,8 og endokrine celler, inkludert gonadotropes, i hypofysen9,10, og dermed tjene avgjørende roller i hjernen og hypofysen plastisitet. Til tross for relativt god kunnskap hos pattedyr, er mekanismen for BPG-akseregulering formidlet av sexsteroider langt fra å bli forstått i ikke-pattedyrarter, noe som fører til dårlig forståelse av evolusjonære bevarte prinsipper11. Det er fortsatt et begrenset antall studier som dokumenterer rollen som sex steroider på hjernen og hypofysen plastisitet, og dermed øke behovet for videre undersøkelser av rollen og effektene av sex steroider på ulike virveldyr arter.
Blant vertebrater har teleoster blitt kraftige modelldyr i å adressere mange biologiske og fysiologiske spørsmål, inkludert stressrespons12,13, vekst14,15, ernæringsfysiologi16,17 og reproduksjon2. Teleoster, der kjønnssteroider for det meste er representert av østradiol (E2) hos kvinner og 11-ketotestosteron (11-KT) hos menn18,19, har lenge vært pålitelige eksperimentelle modeller for å undersøke det generelle reproduksjonsprinsippet på tvers av arter. Teleoster viser unikhet i deres hypothalamus-hypofyseforbindelse20,21 og distinkte gonadotrope celler22, som noen ganger er praktiske for belysning av regulatoriske mekanismer. Videre, på grunn av deres manglende evne til både laboratorie- og feltforsøk, tilbyr teleoster mange fordeler sammenlignet med andre organismer. De er relativt billige å kjøpe og vedlikeholde23,24. Spesielt er små teleostmodeller som sebrafisk (Danio rerio) og den japanske medakaen (Oryzias latipes), arter med svært høy fecundity og en relativt kort livssyklus som muliggjør rask analyse av genfunksjon og sykdomsmekanismer23, og gir dermed enda større fordeler med å håndtere en mengde biologiske og fysiologiske spørsmål, med tanke på de mange velutviklede protokollene og genetisk verktøysett som er tilgjengelige for disse artene25.
I mange studier har fjerning av gonader (gonadektomi) sammen med blodprøvetakingsteknikker blitt brukt som en metode for å undersøke mange fysiologiske spørsmål, inkludert dens innvirkning i virveldyr reproduktiv fysiologi hos pattedyr26,27,28, fugler29 og amfibier30. Selv om gonadectomy effekten på reproduktiv fysiologi kan alternativt etterlignes av sex steroid antagonister, som tamoxifen og clomiphene, effekten av stoffene synes å være inkonsekvent på grunn av bimodale effekter31,32. Kronisk eksponering for en sex steroid antagonist kan føre til ovarial utvidelse33,34, som kan deaktivere observasjon av dens effekter for langsiktige formål på grunn av en usunn fenotype. I tillegg er det umulig å utføre en utvinning eksperiment etter sex steroid antagonist behandling, for å garantere den spesifikke effekten av visse sex steroider. Sammen med de nevnte punktene, andre avveininger av sex steroid antagonist bruk har blitt grundig gjennomgått31,32. Derfor, gonadectomy fortsatt vises i dag som en kraftig teknikk for å undersøke rollen som sex steroider.
Mens gonadektomi og blodprøvetakingsteknikker er relativt enkle å utføre i større arter, som europeisk havabbor (Dicentrarchus labrax)35, bluehead wrasse (Thalassoma bifasciatum)36, dogfish (Scyliorhinus canicula)37 og steinbit (Heteropneustes fossilis og Clarias bathracus)38,39, de reiser utfordringer når de brukes i liten fisk som medaka. For eksempel er bruken av Fish Anesthesia Delivery System (FADS)40 mindre mulig og ser ut til å være utsatt for overdreven fysisk skade for liten fisk. I tillegg er en gonadektomiprosedyre som ofte brukes til større fisk40 ikke egnet for liten fisk som krever høy presisjon for å unngå overdreven skade. Til slutt er blodprøvetaking utfordrende på grunn av begrenset tilgang til blodkar og den lille mengden blod i disse dyrene. Derfor er en klar protokoll som demonstrerer hvert trinn i gonadektomi og blodprøvetaking i en liten teleost av betydning.
Denne protokollen demonstrerer trinnvise prosedyrer for gonadektomi etterfulgt av blodprøvetaking i japansk medaka, en liten ferskvannsfisk innfødt til Øst-Asia. Japansk medaka har et sekvensert genom, flere molekylære og genetiske verktøy tilgjengelig25, og et genetisk kjønnsbestemmelsessystem som muliggjør undersøkelse av seksuelle forskjeller før sekundære seksuelle egenskaper eller gonader er godt utviklet41. Interessant nok har japansk medaka smeltet gonader i motsetning til mange andre teleostarter42. Disse to teknikkene til sammen tar bare 8 minutter totalt og vil fullføre listen over videoprotokoller som allerede eksisterer for denne arten som inkluderte merking av blodkar43, patch-clamp på hypofyse seksjoner44 og hjerne nevroner45, og primærcellekultur46. Disse teknikkene vil tillate forskningssamfunnet å undersøke og bedre forstå rollene til sex steroider i feedback mekanismer samt hjernen og hypofysen plastisitet i fremtiden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass capilary</td>
			<td></td>
			<td>GD1</td>
			<td>Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td></td>
			<td>H4784-1G</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td></td>
			<td>P97</td>
			<td>Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon thread</td>
			<td></td>
			<td>N45VL</td>
			<td>Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube</td>
			<td></td>
			<td>T9661</td>
			<td>Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone capillary</td>
			<td></td>
			<td>a16090800ux0403</td>
			<td>Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td></td>
			<td>WXBC9102V</td>
			<td>Aldrich chemistry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)

Sex steroider, produsert av gonads, spille en viktig rolle i hjernen og hypofysen vev plastisitet og i nevroendokrine kontroll av reproduksjon i alle vertebrater ved å gi tilbakemelding til hjernen og hypofysen. Teleostfisk har en høyere grad av vev plastisitet og variasjon i reproduktive strategier sammenlignet med pattedyr og synes å være nyttige modeller for å undersøke rollen som sex steroider og mekanismene som de handler. Fjerning av den viktigste kilden til sex steroid produksjon ved hjelp av gonadectomy sammen med blodprøvetaking for å måle steroid nivåer har vært veletablert og ganske gjennomførbart i større fisk og er en kraftig teknikk for å undersøke rollen og effektene av sex steroider. Disse teknikkene reiser imidlertid utfordringer når de implementeres i teleostmodeller i liten størrelse. Her beskriver vi trinnvise prosedyrer for gonadektomi hos både menn og kvinnelige japanske medaka etterfulgt av blodprøvetaking. Disse protokollene er vist å være svært mulig i medaka indikert av en høy overlevelsesrate, sikkerhet for fiskens levetid og fenotype, og reproduserbarhet når det gjelder sex steroid clearance. Bruken av disse prosedyrene kombinert med de andre fordelene ved å bruke denne lille teleost modellen vil i stor grad forbedre forståelsen av feedback mekanismer i nevroendokrine kontroll av reproduksjon og vev plastisitet levert av sex steroider i vertebrater.

Denne protokollen beskriver hvert trinn for å utføre gonadektomi og blodprøvetaking i en liten størrelse modell teleost, den japanske medaka. Fiskens overlevelsesrate etter ovariektomi (OVX) hos kvinner er 100% (10 av 10 fisk) mens 94% (17 av 18 fisk) av hannene overlevde etter orkidéektomi. I mellomtiden, etter at blodprøvetakingsprosedyren ble utført, overlevde all (38 fisk) fisk.
Sham-opererte kvinner viser oviposisjon...

Watch this Scientific Journal Video about Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes at JoVE.com

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

Artikkelen beskriver en rask protokoll for å gonadectomize og prøve blod fra den lille teleostfisken, ved hjelp av japansk medaka (Oryzias latipes) som modell, for å undersøke rollen som sexsteroider i dyrefysiologi.

Gonadectomy og blodprøvetaking prosedyrer i liten størrelse Teleost Modell Japansk Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Seawater Sampling and Collection

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass ...

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

Kvantifisering Enkeltmicrovessel Permeabilitet i Isolert Blood-perfundert Rat Lung Forberedelse

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Non-Terminal blodprøvetaking Teknikker i Guinea Pigs

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Prøvetaking Blod fra Lateral Tail Vein of the Rat

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Noninvasiv overvåking av lesjonen størrelse i en Heterologous musemodell av endometriose

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...