Name: gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)
Uploaded: 2020-12-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes at JoVE.com

Los autores agradecen a la Sra. Lourdes Carreon G Tan su ayuda en la cría de peces. Este trabajo fue financiado por NMBU, Grants-in-Aid de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) (número de subvención 18H04881 y 18K19323), y subvención para Proyectos de Investigación en Ciencias Básicas de la Fundación Sumitomo a S.K.

Todas las experimentaciones y el manejo de animales se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones sobre el bienestar animal experimental en la Universidad Noruega de Ciencias de la Vida. Los experimentos con gonadectomía fueron aprobados por la Autoridad Noruega de Seguridad Alimentaria (FOTS ID 24305).
NOTA: Los experimentos se realizaron utilizando machos y hembras adultos (6-7 meses de edad, peso aprox. 0,35 g, longitud aprox. 2,7 cm) medaka japonés. El sexo se determinó distingu...

Como se informó en la literatura anterior, la gonadectomía y el muestreo de sangre se han utilizado durante mucho tiempo en otras especies modelo para investigar cuestiones relacionadas con el papel de los esteroides sexuales en la regulación del eje BPG. Sin embargo, estas técnicas parecen ser susceptibles sólo para animales más grandes. Teniendo en cuenta el pequeño tamaño del modelo de teleósto comúnmente utilizado, el medaka japonés, proporcionamos un protocolo detallado para la gonadectomía y el muestreo...

En los vertebrados, los esteroides sexuales, que son producidos principalmente por las gónadas, juegan un papel importante en la regulación del eje Cerebro-Hipófisis-Gonadal (BPG) a través de varios mecanismos de retroalimentación1,2,3,4,5. Además, los esteroides sexuales afectan la proliferación y la actividad de las neuronas en el cerebro6,7,8 y las células endocrinas, incluidos los gonadotropos, en la hipófisis9,10,y por lo tanto cumplen funciones cruciales en el cerebro y la plasticidad pituitaria. A pesar de un conocimiento relativamente bueno en mamíferos, el mecanismo de regulación del eje BPG mediado por esteroides sexuales está lejos de ser entendido en especies no mamíferas, lo que lleva a una comprensión deficiente de los principios conservados evolutivamente11. Todavía hay un número limitado de estudios que documentan el papel de los esteroides sexuales en el cerebro y la plasticidad pituitaria, lo que plantea la necesidad de más investigaciones sobre el papel y los efectos de los esteroides sexuales en diversas especies de vertebrados.
Entre los vertebrados, los teleóstos se han convertido en poderosos animales modelo para abordar numerosas preguntas biológicas y fisiológicas, incluida la respuesta al estrés12,13,el crecimiento14,15,la fisiología nutricional16,17 y la reproducción2. Los teleóstomos, en los que los esteroides sexuales están representados principalmente por estradiol (E2) en las hembras y 11-cetotestosterona (11-KT) en los machos18,19,han sido durante mucho tiempo modelos experimentales confiables para investigar el principio general de reproducción en todas las especies. Los teleóstomos muestran singularidad en su conexión hipotalámico-hipofisaria20,21 y distintas células gonadotropas22,que a veces son convenientes para la elucidación de los mecanismos reguladores. Además, debido a su capacidad para experimentos de laboratorio y de campo, los teleóstodos ofrecen muchas ventajas en comparación con otros organismos. Son relativamente baratos de comprar y mantener23,24. En particular, los pequeños modelos de teleósto como el pez cebra(Danio rerio)y el medaka japonés(Oryzias latipes),son especies con una fecundidad muy alta y un ciclo de vida relativamente corto que permite un análisis rápido de la función génica y los mecanismos de la enfermedad23,proporcionando así ventajas aún mayores al abordar una gran cantidad de preguntas biológicas y fisiológicas, teniendo en cuenta los numerosos protocolos bien desarrollados y el conjunto de herramientas genéticas disponibles para estas especies25.
En numerosos estudios, la eliminación de gónadas (gonadectomía) junto con técnicas de muestreo de sangre se han utilizado como método para investigar muchas cuestiones fisiológicas, incluido su impacto en la fisiología reproductiva de vertebrados en mamíferos26,27,28,aves29 y anfibios30. Aunque el efecto de la gonadectomía sobre la fisiología reproductiva puede ser imitado alternativamente por antagonistas de esteroides sexuales, como el tamoxifeno y el clomifeno, el efecto de los fármacos parece ser inconsistente debido a los efectos bimodales31,32. La exposición crónica a un antagonista de esteroides sexuales puede conducir a un agrandamiento ovárico33,34, lo que puede deshabilitar la observación de sus efectos para fines a largo plazo debido a un fenotipo poco saludable. Además, es imposible realizar un experimento de recuperación después del tratamiento con antagonistas de esteroides sexuales, para garantizar el efecto específico de ciertos esteroides sexuales. Junto con esos puntos antes mencionados, otras compensaciones del uso de antagonistas de esteroides sexuales han sido ampliamente revisadas31,32. Por lo tanto, la gonadectomía todavía aparece hoy en día como una técnica poderosa para investigar el papel de los esteroides sexuales.
Si bien las técnicas de gonadectomía y muestreo de sangre son relativamente fáciles de realizar en especies más grandes, como la lubina europea(Dicentrarchus labrax)35,el pez cabeza azul(Thalassoma bifasciatum)36,el cazón(Scyliorhinus canicula)37 y el bagre(Heteropneustes fossilis y Clarias bathracus)38,39,plantean desafíos cuando se aplican en peces pequeños como medaka. Por ejemplo, el uso del Sistema de Administración de Anestesia de Peces (FADS)40 es menos factible y parece ser propenso a daños físicos excesivos para los peces pequeños. Además, un procedimiento de gonadectomía que se usa comúnmente para peces más grandes40 no es adecuado para peces pequeños que requieren alta precisión para evitar daños excesivos. Finalmente, el muestreo de sangre es un desafío debido al acceso limitado a los vasos sanguíneos y la pequeña cantidad de sangre en esos animales. Por lo tanto, es importante un protocolo claro que demuestre cada paso de la gonadectomía y el muestreo de sangre en un pequeño teleósto.
Este protocolo demuestra los procedimientos paso a paso de la gonadectomía seguidos de la toma de muestras de sangre en la medaka japonesa, un pequeño pez de agua dulce nativo del este de Asia. Los medaka japoneses tienen un genoma secuenciado, varias herramientas moleculares y genéticas disponibles25,y un sistema genético de determinación del sexo que permite la investigación de las diferencias sexuales antes de que las características sexuales secundarias o gónadas estén bien desarrolladas41. Curiosamente, los medaka japoneses poseen gónadas fusionadas contrariamente a muchas otras especies de teleóstos42. Estas dos técnicas combinadas toman solo 8 minutos en total y completarán la lista de protocolos de video ya existentes para esta especie que incluyeron el etiquetado de los vasos sanguíneos43,patch-clamp en las secciones hipofisarias44 y neuronas cerebrales45,y el cultivo celular primario46. Estas técnicas permitirán a la comunidad de investigación investigar y comprender mejor los roles de los esteroides sexuales en los mecanismos de retroalimentación, así como la plasticidad cerebral y pituitaria en el futuro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass capilary</td>
			<td></td>
			<td>GD1</td>
			<td>Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td></td>
			<td>H4784-1G</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td></td>
			<td>P97</td>
			<td>Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon thread</td>
			<td></td>
			<td>N45VL</td>
			<td>Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube</td>
			<td></td>
			<td>T9661</td>
			<td>Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone capillary</td>
			<td></td>
			<td>a16090800ux0403</td>
			<td>Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td></td>
			<td>WXBC9102V</td>
			<td>Aldrich chemistry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)

Los esteroides sexuales, producidos por las gónadas, juegan un papel esencial en la plasticidad del cerebro y el tejido pituitario y en el control neuroendocrino de la reproducción en todos los vertebrados al proporcionar retroalimentación al cerebro y la hipófisis. Los peces teleóstos poseen un mayor grado de plasticidad tisular y variación en las estrategias reproductivas en comparación con los mamíferos y parecen ser modelos útiles para investigar el papel de los esteroides sexuales y los mecanismos por los que actúan. La eliminación de la principal fuente de producción de esteroides sexuales mediante gonadectomía junto con el muestreo de sangre para medir los niveles de esteroides ha sido bien establecida y bastante factible en peces más grandes y es una técnica poderosa para investigar el papel y los efectos de los esteroides sexuales. Sin embargo, estas técnicas plantean desafíos cuando se implementan en modelos de teleósto de tamaño pequeño. Aquí, describimos los procedimientos paso a paso de la gonadectomía en medaka japonés masculino y femenino seguido de un muestreo de sangre. Estos protocolos han demostrado ser altamente factibles en medaka indicados por una alta tasa de supervivencia, seguridad para la vida útil y el fenotipo de los peces, y reproducibilidad en términos de eliminación de esteroides sexuales. El uso de estos procedimientos combinado con las otras ventajas de usar este pequeño modelo de teleósto mejorará en gran medida la comprensión de los mecanismos de retroalimentación en el control neuroendocrino de la reproducción y la plasticidad tisular proporcionada por los esteroides sexuales en vertebrados.

Este protocolo describe cada paso para realizar gonadectomía y muestreo de sangre en un teleósto modelo de tamaño pequeño, el medaka japonés. La tasa de supervivencia de los peces después de la ovariectomía (OVX) en las hembras es del 100% (10 de cada 10 peces), mientras que el 94% (17 de 18 peces) de los machos sobrevivieron después de la orquidectomía. Mientras tanto, después de que se realizó el procedimiento de muestreo de sangre, todos los peces (38 peces) sobrevivieron.</...

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Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

El artículo describe un protocolo rápido para gonadectomizar y tomar muestras de sangre de los pequeños peces teleóseos, utilizando medaka japonés(Oryzias latipes)como modelo, para investigar el papel de los esteroides sexuales en la fisiología animal.

Procedimientos de gonadectomía y muestreo de sangre en el modelo de teleósto de tamaño pequeño japonés Medaka (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

Research

JoVE Journal

Biology

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