Name: gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)
Uploaded: 2020-12-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes at JoVE.com

Yazarlar Bayan Lourdes Carreon G Tan'a balık hayvanlığındaki yardımı için teşekkür ediyor. Bu çalışma NMBU, Japonya Bilimi Teşvik Derneği'nden (JSPS) Hibe-in-Aid (Hibe numarası 18H04881 ve 18K19323) ve Sumitomo Vakfı'ndan S.K.'ye Temel Bilim Araştırma Projeleri için hibe ile finanse edildi.

Tüm deneyler ve hayvan elleçleme, Norveç Yaşam Bilimleri Üniversitesi'ndeki deneysel hayvan refahı konusundaki önerilere uygun olarak gerçekleştirildi. Gonadektomi kullanılarak yapılan deneyler Norveç Gıda Güvenliği Kurumu (FOTS ID 24305) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Deneyler yetişkin erkek ve dişi (6-7 aylık, ağırlık yaklaşık 0,35 g, uzunluk yaklaşık 2,7 cm) Japon medaka kullanılarak gerçek gerçekleştirildi. Cinsiyet,42,<su...

Önceki literatürde bildirildiği gibi, gonadektomi ve kan örneklemesi uzun zamandır BPG ekseninin düzenlenmesinde seks steroidlerinin rolü ile ilgili soruları araştırmak için diğer model türlerde kullanılmaktadır. Ancak, bu teknikler sadece daha büyük hayvanlar için uygun görünüyor. Yaygın olarak kullanılan teleost modeli Japon medaka'nın küçük boyutunu göz önünde bulundurarak, bu tür için mümkün olan gonadektomi ve kan örneklemesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.
<p class=...

Omurgalılarda, esas olarak gonadlar tarafından üretilen seks steroidleri, çeşitli geri bildirim mekanizmaları 1 ,2,3,4,5aracılığıyla Beyin-Hipofiz-Gonadal (BPG) ekseninin düzenlenmesinde önemli roller oynar. Ek olarak, seks steroidleri beyin6, 7,8ve endokrin hücrelerde nöronların çoğalmasını ve aktivitesini etkiler, gonadotroplar da dahil olmak üzere, hipofiz9,10ve böylece beyin ve hipofiz plastisitesinde önemli rollere hizmet eder. Memelilerde nispeten iyi bilgiye rağmen, seks steroidlerinin aracılık ettiği BPG ekseni düzenleme mekanizması, memeli olmayan türlerde anlaşılmaktan çok uzaktır ve evrimsel olarak korunan ilkelerin zayıf anlaşılmasına yol açar11. Hala beyin ve hipofiz plastisite üzerinde seks steroidlerin rolünü belgeleyen çalışmaların sınırlı sayıda vardır, böylece cinsiyet steroidlerin çeşitli omurgalı türler üzerindeki rolü ve etkileri hakkında daha fazla araştırma ihtiyacını artırmaktadır.
Omurgalılar arasında, teleostlar stres yanıtı 12 , 13 , büyüme 14 , 15 , beslenmefizyolojisi16,17ve üreme 2 dahil olmak üzere çok sayıda biyolojik ve fizyolojik soruyu ele almada güçlü model hayvanlarhalinegelmiştir. Seks steroidlerinin çoğunlukla kadınlarda estradiol (E2) ve erkeklerde 11-ketotestosteron (11-KT) ile temsil edildiği teleostlar18,19, uzun zamandır türler arasında genel üreme ilkesini araştırmak için güvenilir deneysel modeller olmuştur. Teleostlar hipotalamik-hipofiz bağlantılarında benzersizlik gösterir20,21 ve farklı gonadotrop hücreleri22, bazen düzenleyici mekanizmaların aydınlatıcılığı için uygundur. Ayrıca, hem laboratuvar hem de saha deneylerine karşı saygınlıkları nedeniyle, teleostlar diğer organizmalara kıyasla birçok avantaj sunmaktadır. Satın almak ve korumak için nispetenucuzdurlar 23,24. Özellikle, zebra balığı (Danio rerio) ve Japon medaka (Oryzias latipes) gibi küçük teleost modelleri, çok yüksek doğurganlığa ve gen fonksiyonu ve hastalık mekanizmalarının hızlı analizini sağlayan nispeten kısa bir yaşam döngüsüne sahip türlerdir23, böylece bu türler için mevcut olan çok sayıda iyi gelişmiş protokol ve genetik araç seti göz önüne alındığında, çok sayıda biyolojik ve fizyolojik sorunun ele alınmasında daha da büyük avantajlarsağlar.
Çok sayıda çalışmada, kan örnekleme teknikleri ile birlikte gonadların (gonadektomi) çıkarılması,memelilerdeomurgalı üreme fizyolojislerindeki etkisi de dahil olmak üzere birçok fizyolojik soruyu araştırmak için bir yöntem olarak kullanılmıştır 26 ,27,28, kuşlar29 ve amfibiler30. Üreme fizyolojisi üzerindeki gonadektomi etkisi alternatif olarak tamoksifen ve klomifen gibi seks steroid antagonistleri tarafından taklit edilebilse de, ilaçların etkisi bimodal etkiler nedeniyle tutarsız görünüyor31,32. Bir seks steroid antagonist kronik maruz kalma yumurtalık büyütme yol açabilir33,34, hangi sağlıksız bir fenotip nedeniyle uzun vadeli amaçlar için etkilerinin gözlem devre dışı bırakabilir. Ek olarak, bazı seks steroidlerinin spesifik etkisini garanti etmek için seks steroid antagonist tedavisinden sonra bir kurtarma deneyi yapmak imkansızdır. Yukarıda belirtilen puanlarla birlikte, seks steroid antagonist kullanımının diğer takasları kapsamlı bir şekilde gözden geçirilmiştir31,32. Bu nedenle, gonadektomi bugün hala seks steroidlerinin rolünü araştırmak için güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmaktadır.
Gonadektomi ve kan örnekleme tekniklerinin daha büyük türlerde uygulanması nispeten kolay olsa da, Avrupa levreği (Dicentrarchus labrax)35, bluehead wrasse (Thalassoma bifasciatum)36, dogfish (Scyliorhinus canicula)37 ve yayın balığı (Heteropneustes fossilis ve Clarias bathracus)38,39, medaka olarak küçük balıklarda uygulandığında zorlukları gündeme getiriyorlar. Örneğin, Balık Anestezi Doğum Sistemi (FADS)40'ın kullanımı daha az uygulanabilir ve küçük balıklar için aşırı fiziksel hasara eğilimli görünmektedir. Ek olarak, daha büyükbalıklar 40 için yaygın olarak kullanılan bir gonadektomi prosedürü, aşırı hasarı önlemek için yüksek hassasiyet gerektiren küçük balıklar için uygun değildir. Son olarak, kan damarlarına sınırlı erişim ve bu hayvanlardaki az miktarda kan nedeniyle kan örneklemesi zordur. Bu nedenle, küçük bir teleostta gonadektomi ve kan örneklemenin her adımını gösteren açık bir protokol önemlidir.
Bu protokol, Doğu Asya'ya özgü küçük bir tatlı su balığı olan Japon medakasında kan örneklemesi ile takip edilen gonadektomi işlemlerinin adım adım prosedürlerini göstermektedir. Japon medaka sıralı bir genoma, mevcut birkaç moleküler ve genetik alete sahiptir25ve ikincil cinsel özellikler veya gonadlar iyi geliştirilmeden önce cinsel farklılıkların araştırılmasına izin sağlayan genetik bir cinsiyet belirleme sistemi41. İlginçtir ki, Japon medaka diğer birçok teleost türüne aksine kaynaşmış gonadlara sahiptir42. Bu iki teknik bir araya geldiğinde toplamda sadece 8 dakika sürer ve kan damarlarının etiketlenini içeren bu tür için zaten mevcut olan video protokollerinin listesinitamamlayacaktır 43, hipofiz bölümleri44 ve beyin nöronları45ve birincil hücre kültürü46. Bu teknikler araştırma topluluğunun geri bildirim mekanizmalarının yanı sıra gelecekte beyin ve hipofiz plastisitesinde seks steroidlerinin rollerini araştırmasını ve daha iyi anlamasını sağlayacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Glass capilary</td>
			<td></td>
			<td>GD1</td>
			<td>Glass Capillary with Filament GD-1; Narishige</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td></td>
			<td>H4784-1G</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td></td>
			<td>P97</td>
			<td>Flaming/Brown Micropipette puller Model P-97; Sutter Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon thread</td>
			<td></td>
			<td>N45VL</td>
			<td>Polyamide suture, 0.2 metric; Crownjun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tube</td>
			<td></td>
			<td>T9661</td>
			<td>Eppendorf Safe-lock microcentifuge tube 1.5 ml, Sigma-aldrich</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade</td>
			<td></td>
			<td>-</td>
			<td>Astra Superior Platinum Double Edge Razor Blades Green, salonwholesale.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone capillary</td>
			<td></td>
			<td>a16090800ux0403</td>
			<td>Uxcell Silicone Tube 1 mm ID x 2 mm OD, amazon.com&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td></td>
			<td>WXBC9102V</td>
			<td>Aldrich chemistry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gonadectomy and blood sampling procedures in the small size teleost model japanese medaka (oryzias latipes)

Gonadlar tarafından üretilen seks steroidleri, beyin ve hipofiz doku plastisitesinde ve beyin ve hipofiz geri bildirim sağlayarak tüm omurgalılarda üremenin nöroendokrin kontrolünde önemli bir rol oynar. Teleost balıkları, memeliler ile karşılaştırıldığında üreme stratejilerinde daha yüksek derecede doku plastisitesine ve varyasyona sahiptir ve seks steroidlerinin rolünü ve hareket ettikleri mekanizmaları araştırmak için yararlı modeller gibi görünmektedir. Steroid seviyelerini ölçmek için kan örneklemesi ile birlikte gonadektomi kullanarak seks steroid üretiminin ana kaynağının kaldırılması iyi kurulmuş ve daha büyük balık oldukça uygulanabilir olmuştur ve seks steroidlerin rolünü ve etkilerini araştırmak için güçlü bir tekniktir. Ancak, bu teknikler küçük boyutlu teleost modellerinde uygulandığında zorlukları gündeme getirmektedir. Burada, hem erkeklerde hem de dişi Japon medakasında gonadektomi ve ardından kan örneklemesi gibi adım adım yapılan işlemleri açıklıyoruz. Bu protokoller yüksek hayatta kalma oranı, balıkların yaşam süresi ve fenotip için güvenlik ve seks steroid boşluk açısından tekrarlanabilirlik ile belirtilen medaka son derece uygulanabilir olarak gösterilmiştir. Bu prosedürlerin kullanımı, bu küçük teleost modelini kullanmanın diğer avantajları ile birlikte, omurgalılarda cinsiyet steroidleri tarafından sağlanan üreme ve doku plastisitesinin nöroendokrin kontrolünde geri bildirim mekanizmalarının anlaşılmasını büyük ölçüde geliştirecektir.

Bu protokol, Japon medaka'sı olan küçük boyutlu bir model teleostunda gonadektomi ve kan örneklemesi yapmak için atılan her adımı açıklar. Kadınlarda ovaerektomi (OVX) sonrası balıkların hayatta kalma oranı %100'dür (10 balıktan 10'u), orkideektomi sonrası erkeklerin %94'ü (18 balıktan 17'si) hayatta kalmıştır. Bu arada, kan örnekleme işlemi yapıldıktan sonra, tüm (38 balık) balık hayatta kaldı.
S...

Watch this Scientific Journal Video about Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes at JoVE.com

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka Oryzias latipes

Makale, hayvan fizyolojisinde seks steroidlerinin rolünü araştırmak için model olarak Japon medaka (Oryzias latipes) kullanarak küçük teleost balıklarından kan gonadectomize ve örnek almak için hızlı bir protokol açıklar.

Küçük Boyutlu Teleost Model Japonca Medaka'da Gonadektomi ve Kan Örnekleme İşlemleri (Oryzias latipes)

Sex steroids, produced by the gonads, play an essential role in brain and pituitary tissue plasticity and in the neuroendocrine control of reproduction in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Gonadectomy and Blood Sampling Procedures in the Small Size Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

Seawater Sampling and Collection

Deniz suyu Örnekleme ve Tahsilat

This video documents methods for collecting coastal marine water samples and processing them for various downstream applications including biomass ...

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures

Noninvaziv In Vivo Küçük Hayvan MRG ve MRS: Temel Deneysel Prosedürler

Small animal Magnetic Resonance (MR) research has emerged as an important element of modern biomedical research due to its non-invasive nature and the ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

Model Genetik Organizma olarak kullanmak için Medaka Embriyolar, Mikroenjeksiyon

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Chimeras Üretim Medaka Embriyolar ve Hücre Nakli Dechorionation

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Embriyonik Ekstremite Cilt damarları Tüm montaj İmmünohistokimyasal Analizi: Embriyo vasküler dallanma Morphogenesis Eğitim Model Sistemi

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Elusive Küçük Memeliler Yüksek Kalite DNA Edinme Noninvaziv Saç Örnekleme Tekniği

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

İzole Kan-perfüze Sıçan Akciğer Hazırlık Tek Mikrodamar Geçirgenliği miktarının

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Non-Terminal Blood Sampling Techniques in Guinea Pigs

Kobaylardaki Sigara Terminal Kan Örnekleme Teknikleri

Guinea pigs possess several biological similarities to humans and are validated experimental animal models1-3. However, the use of guinea pigs currently ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

Rat Yanal Kuyruk Ven gelen Kan Örnekleme

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Lezyon boyutu endometriozis, kapaklı fare modeli noninvaziv izlenmesi

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...