Name: chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo
Uploaded: 2021-02-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo at JoVE.com

يشكر المؤلفان س. بريتين على المساعدة التقنية الخبيرة. وقد تم دعم هذا العمل بمنحة من جمعية هيلمهولتز لمراكز البحوث الألمانية (HGF) التي تم توفيرها كجزء من تحالف هيلمهولتز "العلاج المناعي للسرطان" (HCC_WP2b).

وقد وافقت وكالة الحكم المحلي على جميع التجارب الحيوانية الموصوفة (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit؛ الملف رقم 33.12-42502-04-10/0108) وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية الوطنية والمؤسسية.
1. إنتاج αDEC-205 من خط الخلية الهجين NLDC-145
<ol><li>لإنتاج الأجسام المضادة، إذابة cryopreserved NLDC-145 ال?...

<ol>
	<li>Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+complete+repertoire+of+conventional+dendritic+cell+functions+for+cancer+immunotherapy.">Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy.</a> Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Wculek, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+cancer+immunology+and+immunotherapy.">Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy.</a> Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).</li><li>Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell-targeted+vaccines--hope+or+hype.">Dendritic cell-targeted vaccines--hope or hype.</a> Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).</li><li>Bonifaz, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+targeting+of+antigens+to+maturing+dendritic+cells+via+the+DEC-205+receptor+improves+T+cell+vaccination.">In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination.</a> Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).</li><li>Boscardin, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+targeting+to+dendritic+cells+elicits+long-lived+T+cell+help+for+antibody+responses.">Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses.</a> Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).</li><li>Hossain, M. K., Wall, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Dendritic+Cell+Receptors+as+Targets+for+Enhancing+Anti-Cancer+Immune+Responses.">Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses.</a> Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).</li><li>Johnson, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+melanoma+growth+by+targeting+of+antigen+to+dendritic+cells+via+an+anti-DEC-205+single-chain+fragment+variable+molecule.">Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule.</a> Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).</li><li>Trumpfheller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbial+mimic+poly+IC+induces+durable+and+protective+CD4++T+cell+immunity+together+with+a+dendritic+cell+targeted+vaccine.">The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).</li><li>Idoyaga, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparable+T+helper+1+(Th1)+and+CD8+T-cell+immunity+by+targeting+HIV+gag+p24+to+CD8+dendritic+cells+within+antibodies+to+Langerin,+DEC205,+and+Clec9A.">Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).</li><li>Sancho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+therapy+in+mice+via+antigen+targeting+to+a+novel,+DC-restricted+C-type+lectin.">Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+antigen+delivery+to+dendritic+cells+elicits+robust+antiviral+T+cell-mediated+immunity+in+the+liver.">Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver.</a> Scientific Reports. 7, 43985 (2017).</li><li>Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans'+cells,+veiled+cells,+and+interdigitating+cells+in+the+mouse+recognized+by+a+monoclonal+antibody.">Langerhans' cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STING+activator+c-di-AMP+exerts+superior+adjuvant+properties+than+the+formulation+poly(I:C)/CpG+after+subcutaneous+vaccination+with+soluble+protein+antigen+or+DEC-205-mediated+antigen+targeting+to+dendritic+cells.">The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells.</a> Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).</li></ol>

يوفر التلازم الكيميائي للأجسام المضادة الخاصة بمستقبلات الغدد الصماء ومستضد البروتين نهجا فعالا ، والأهم من ذلك ، مرنا أيضا لاستهداف vivo DC في نماذج الماوس قبل السريرية. مع بروتوكولنا نقدم نهجا فعالا لنجاح اقتران نموذج مستضد OVA إلى الأجسام المضادة IgG DEC-205 محددة.
في بروتو?...

الخلايا التشجرية (DC) هي لاعبين مركزيين في الجهاز المناعي. فهي مجموعة متنوعة من الخلايا المتخصصة في عرض المستضد ووظيفتها الرئيسية هي جسر المناعة الفطرية والتكيفية1،2. الأهم من ذلك، العاصمة لا تلعب دورا هاما في الاستجابات الموجهة مسببات الأمراض كفاءة ومحددة ولكن تشارك أيضا في العديد من جوانب مناعة مضادة للورم1،3.
نظرا لدورها الحصري في مناعة المضيف ، ظهرت DC في التركيز كخلايا مستهدفة للتطعيم4. نهج واحد هو استهداف المستضدات إلى العاصمة في الجسم الحي للحث على الاستجابات المناعية الخاصة بالمستضد وعلى مدى السنوات الماضية ، تم تخصيص عدد كبير من الدراسات لتحديد المستقبلات المناسبة واستراتيجيات الاستهداف1،4. مثال واحد هو مستقبلات الليكتين من النوع C DEC-205 ، والتي يمكن استهدافها من قبل الأجسام المضادة الخاصة ب DEC-205 للحث على الإصابة بداء الغدد الصماء. الأهم من ذلك، DEC-205 استهداف في تركيبة مع المساعدين مناسبة وقد ثبت أن تحفز بكفاءة CD4 طويلة الأمد وحامية+ وCD8+ الخلايا التائية، فضلا عن استجابات الأجسام المضادة، وأيضا ضد مستضدات الورم3،5،6،7،8،9.
هناك عدد من الدراسات التي تبين مستضدات مترافقة تستهدف العاصمة لتكون متفوقة على مستضد غير مترافق الحرة3،5،10،11،12. وهذا يجعل من اقتران مستضد العاصمة المعنية استهداف moiety خطوة مركزية في العاصمة نهج الاستهداف. في حالة استهداف DC عن طريق الأجسام المضادة أو شظايا الأجسام المضادة ، يمكن ربط المستضدات إما كيميائيا أو وراثيا ، وتوفر أي من الاستراتيجيتين مزاياها الخاصة (dis)1. من ناحية، في الأجسام المضادة المعدلة وراثيا-مستضد يبني هناك سيطرة على جرعة مستضد، فضلا عن موقع توفير مقارنة متفوقة بين الكثير1. ومع ذلك، في الوقت نفسه، يحتاج التقارن الكيميائي إلى إعداد أقل ويوفر مرونة أكبر خاصة عند محاولة اختبار ومقارنة المستضدات المختلفة و/ أو استراتيجيات التطعيم في النماذج التجريبية وما قبل السريرية.
هنا، نقدم بروتوكولا للتاؤم الكيميائي الفعال والموثوق به لل ovalbumin (OVA) كمضاد بروتين نموذجي لأجسام IgG2a المضادة الخاصة ب DEC-205 (αDEC-205) المناسبة لاستهداف في الجسم الحي DC في الفئران. أولا، يتم تنقية αDEC-205 من NLDC-145 خلايا الورم الهجين13. بالنسبة للترابط الكيميائي، يتم استخدام السيكلوهيكسان-1-كاربوكسيلات (sulfo-SMCC)، الذي يحتوي على مجموعات إستر وماليميد (N-hydroxysuccinimide) NHS (N-hydroxysuccinimide)، مما يسمح بالارتقاق التساهمي للجزيئات المحتوية على الأمين والسولفيدريل. على وجه التحديد ، فإن الأمينات الأولية للأجسام المضادة تتفاعل في البداية مع sulfo-SMCC وما ينتج عن ذلك من ماليميد تنشيط αDEC-205 ثم يتفاعل مع بروتين OVA المحتوي على سلفدريل خفضت من خلال TCEP-HCl (تريس (2-carboxyethyl) فوسفين هيدروكلوريد). المنتج النهائي هو αDEC-205/OVA(الشكل 1). وإلى جانب التضمين الكيميائي نفسه، يصف بروتوكولنا إزالة OVA الزائدة من المترافقة وكذلك التحقق من التوازج الناجح من خلال تحليل البقع الغربية واختبار معين للمناعة مرتبط بالإنزيم. لقد نجحنا في استخدام هذا النهج في الماضي لإقتران OVA كيميائيا والبروتينات الأخرى أو الببتيدات المناعية إلى αDEC-205. نحن نظهر كفاءة ملزمة لCD11c+ الخلايا في المختبر، فضلا عن التعريفي كفاءة المناعة الخلوية والفكاهية في الجسم الحي.
بالتأكيد ، هناك عيوب في هذه الطريقة مثل قابلية المقارنة بين الكثير والكثير وفي ال دوسينج الدقيق للمضاد داخل المترافق النهائي. ومع ذلك ، يوفر التقارن الكيميائي مرونة تجريبية في اختيار الجسم المضاد واستضاد البروتين بالمقارنة مع البنى المعدلة وراثيا. لذلك ، نعتقد أن هذا النهج ذو قيمة خاصة في تقييم المستضدات المختلفة لكفاءتها في استهداف DC في نماذج الماوس قبل السريرية ، والأهم من ذلك أيضا في سياق استجابات مناعية محددة مضادة للورم.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibody buffer 2 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody buffer 5 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % FBS in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 4 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 10 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T25</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>690175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T75</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR&#160; filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T175</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>661175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal concentrator MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2001</td>
			<td>Vivaspin 20 centrifugal concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88532</td>
			<td>Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>525-2314</td>
			<td>PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coating buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desalting columns MWCO 7 kDa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89891</td>
			<td>Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent ELISA (HRPO substrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>T8665-100ML</td>
			<td>3,3&#8242;,5,5&#8242;-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent western blot (HRPO substrate)</td>
			<td>Roche/Merck</td>
			<td>12 015 200 01</td>
			<td>Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa</td>
			<td>SERVA Electrophoresis</td>
			<td>44110</td>
			<td>Visking dialysis tubing, 16 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA 96-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td>MaxiSorp Nunc-Immuno Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum</td>
			<td>PAN-BIOtech</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>FBS Good forte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISF-1 medium</td>
			<td>Biochrom/bioswisstec</td>
			<td>F 9061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145.2</td>
			<td>powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLDC-145 hybridoma</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-290</td>
			<td>if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-reducing SDS sample buffer 4 x&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 &#181;l 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 &#181;l of 5 % Bromphenol Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ovalbumin</td>
			<td>Hyglos (via BioVendor)</td>
			<td>321000</td>
			<td>EndoGrade OVA ultrapure with &#60;0.1 EU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles</td>
			<td>Nunc In Vitro</td>
			<td>734-2394</td>
			<td>standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm&#178;, 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109535</td>
			<td>pH indicator strips 0-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG(H+L)-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-062</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG+IgM-HRPO antibody&#160; (ELISA)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-068</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rabbit-IgG-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>111-035-045&#160;</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA (ELISA)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181688</td>
			<td>used at 3 ng/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA antibody (western blot)</td>
			<td>OriGene</td>
			<td>R1101</td>
			<td>used at 1:3,000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose column</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>P3296</td>
			<td>5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td>PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber plug</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5230217</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN rubber stoppers (lower &#934; 17 mm; upper &#934; 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone tube</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5430925</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN (inside &#934; 1 mm; outer &#934; 3 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim-Fast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopping solution (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M H2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22322</td>
			<td>Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter unit 0.22 &#181;m&#160;</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe 10 ml</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Disposable syringes Injekt&#174; Solo B.Braun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican&#174; cannulas</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td></td>
			<td>Sterican&#174; G 20 x 1 1/2&#34;&#34;; 0.90 x 40 mm; yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A35349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing connector</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo

يؤدي تسليم المستضد المستهدف إلى الخلايا التغصنية المتقاطعة في الجسم الحي بكفاءة إلى تحفيز استجابات الخلايا التأثيرية T ويعرض نهجا قيما في تصميم اللقاح. يتم تسليم مستضد إلى العاصمة عن طريق الأجسام المضادة محددة لمستقبلات الغدد الصماء مثل DEC-205 التي تحفز امتصاص, تجهيز, وMHC فئة I- و II-العرض.
يعد اقتران المستضد المطلوب بكفاءة وموثوقية بأجسام مضادة مناسبة خطوة حاسمة في استهداف DC ، ومن بين عوامل أخرى يعتمد على شكل المستضد. يعد اقتران البروتين الكامل الطول بالأجسام المضادة النقية استراتيجية ممكنة. في الماضي، أنشأنا بنجاح الربط المتبادل بين نموذج مستضد ovalbumin (OVA) والأجسام المضادة IgG2a DEC-205 محددة (αDEC-205) لدراسات استهداف في الجسم الحي DC في الفئران. الخطوة الأولى من البروتوكول هي تنقية الجسم المضاد من الناتات من NLDC (الخلايا التشعبية غير اللمفاوية)-145 الورم الهجين عن طريق الكروماتوغرافيا تقارب. يتم تنشيط الأجسام المضادة المنقى للتضمين الكيميائي بواسطة sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] سيكلوهيكسان-1-كاربوكسيلات) وفي الوقت نفسه تتعرض مجموعات سلفهيدريل من بروتين OVA من خلال الحضانة مع TCEP-HCl (ثلاثيات (2-carboxyethyl) فوسفين هيدروكلوريد). تتم إزالة فائض TCEP-HCl وs sulfo-SMCC ويتم خلط المستضد مع الأجسام المضادة المنشطة للاقتران بين عشية وضحاها. ويتركز الناتج αDEC-205/OVA اقتران وتحريرها من OVA غير منضم. يتم التحقق من نجاح اقتران OVA إلى αDEC-205 من خلال تحليل البقع الغربية واختصاص المناعة المرتبط بالإنزيم (ELISA).
لقد استخدمنا بنجاح αDEC-205/OVA المترابط كيميائيا للحث على استجابات الخلايا التائية السامة للخلايا في الكبد ومقارنة المساعدين المختلفين لإمكاناتهم في تحفيز المناعة الفكاهية والخلوية التالية في استهداف الجسم الحي ل DEC-205+ DC. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الأجسام المضادة/المستضدات المقترنة كيميائيا توفر أدوات قيمة لتحريض استجابات اللقاح الفعالة على مستضدات الأورام، وقد ثبت أنها متفوقة على نهج التحصين الكلاسيكية فيما يتعلق بالوقاية والعلاج من مختلف أنواع الأورام.

اقتران الكيميائية من البروتين αDEC-205 إلى OVA باستخدام هذا البروتوكول سوف تسمح عادة كفاءة توليد αDEC-205/OVA لنهج استهداف في الجسم الحي DC. هناك استراتيجيات مختلفة للتحقق من هذه التقنية نفسها واختبار وظائف المترافق المسفر عنها. وتستخدم تحليل لطخة الغربية و ELISA للتحقق من اقتر?...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

نحن نصف بروتوكولا للتلازم الكيميائي لنموذج مستضد ovalbumin إلى الأجسام المضادة مستقبلات الغدد الصماء محددة لاستهداف الخلايا في الجسم الحي التغصني. ويشمل البروتوكول تنقية الأجسام المضادة، والتحواز الكيميائي للمضاد، فضلا عن تنقية المترافق والتحقق من كفاءة التواؤم.

اقتران كيميائي لأجسام مضادة منقية DEC-205 موجهة مع بروتين كامل الطول لاستهداف الخلايا التشجرية الماوس في المختبر وفي فيفو

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

يمكن استخدام هذا البروتوكول الذي تم تحسين جميع الحالات التجريبية بعناية لتسهيل اقتران كيميائي ناجح وفعال للأجسام المضادة DEC-205 مستضد OVA. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح باختيار مرن لمضاد البروتين والأجسام المضادة ، وأنها لا تعتمد على الاندماج الجيني لهذه المكونات. كما استخدمنا هذا البروتوكول لتوليد مترافقات من بروتينات فيروس التهاب الكبد C ومضادات DEC-205 لاستهداف في الجسم الحي DC.وبالمثل، يمكن أن يكون هذا قيما لنهج التطعيم المضاد للورم. لبدء إنتاج مضاد DEC-205 ، أعيد إنفاق حجم ملليلتر واحد من 1 إلى 5 ملايين خلية NLDC 145 المحفوظة بالتبريد المذاب في تسع ملليلترات من 37 درجة مئوية ISF-1 متوسطة تكملها 1٪ البنسلين والستريبتوميسين ، وزرع الخلايا في قارورة زراعة خلايا مساحتها 25 سنتيمترا مربعا لاحتضانها عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 إلى 48 ساعة. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 70٪، نقل تعليق الخلية بأكمله إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.Resuspend بيليه في 12 ملليلتر من الطازجة كاملة 37 درجة ISF-1 المتوسطة وإعادة لوحة الخلايا في قارورة 75 سنتيمترا مربعا. بعد 48 إلى 72 ساعة من الثقافة، تقسيم ثقافة التقاء 70٪ بين كل من اثنين من قوارير جديدة 75 سم مربع وإضافة ستة ملليلتر من ISF-1 كاملة جديدة المتوسطة إلى كل قارورة. عندما تصل الثقافات إلى التقاء 70٪، استخدم ماصة 10 ملليلتر لطرد قيعان قارورة ثقافة الخلية وأسطح الثقافة مع تعليق الخلية لجمع جميع الخلايا ونقل 10 ملليلتر من كل تعليق خلية NLDC 145 الموسع إلى زجاجات بكرة PETG الفردية.ثم أضف 140 ملليلتر من ISF-1 المتوسطة كاملة لكل ثقافة زجاجة الأسطوانة والثقافة زجاجات الأسطوانة في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 25 طلقة في الدقيقة الواحدة لمدة ثلاثة أيام. لتنقية الأجسام المضادة من NLDC 145 supernatant، ضع نهاية أنبوب السيليكون في الكأس المليئة بالناطقة والسماح 800 ملليلتر من supernatant لتشغيل dropwise من خلال عمود البروتين G Sepharose. ل elution، إضافة 100 ميكرولتر من 1.5 الضرس تريس-HCL في كل من أنابيب 1.5 ملليلتر وعشرين وإزالة المكونات المطاطية من العمود.نقل ملليلتر واحد من 0.1 الجليسين المولاري إلى الغرفة العليا من العمود وجمع الأجسام المضادة التي تحتوي على eluent في واحدة من أنابيب 1.5 ملليلتر المعدة وكرر لكل أنبوب. عندما يتم جمع جميع الأجسام المضادة وتم تجميع الوضوء المحتوي على الأجسام المضادة ، أغلق الجزء السفلي من أنابيب غسيل الكلى بطول 20 سنتيمترا مع إغلاق أنابيب غسيل الكلى المناسب ، وماصة الوضوء المضاد بعناية في الأنابيب. أغلق الجزء العلوي من أنابيب غسيل الكلى بمشبك ثان وقم بإصلاح المشبك العلوي لأنابيب غسيل الكلى إلى حامل عائم.إضافة شريط ضجة المغناطيسي إلى كوب من برنامج تلفزيوني ووضع الكأس على stirrer المغناطيسي. بعد غسيل الكلى بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية، فتح المشبك واحد للسماح بتحميل dialysate كاملة إلى مكثف الطرد المركزي مع قطع الوزن الجزيئي 10 كيلودالتون، والطرد المركزي المكثف لمدة 30 دقيقة في 693 مرة G وأربع درجات مئوية. في نهاية الدوران، قم بتحميل المكثف الطرد المركزي مع 10 ملليلتر من PBS للطرد المركزي الثاني حتى يتم الحصول على حجم نهائي واحد إلى 1.5 ملليلتر من محلول الأجسام المضادة.لإقران OVA بالأجسام المضادة ل DEC-205، أضف 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مكمل ب 500 ميكروغرام من بروتين OVA، و240 ميكرولتر من محلول TCEP-HCL الذي تم إعداده حديثا، و560 ميكرولتر من المياه فائقة الشراء العقيمة إلى أنبوب 1.5 ملليلتر لمدة 1.5 ساعة حضانة في درجة حرارة الغرفة. في الوقت نفسه ، أضف 2.5 ملليغرام من مضاد DEC-205 في 900 ميكرولتر من PBS و 100 ميكرولتر من sulfo-SMCC المعدة حديثا إلى أنبوب ثاني 1.5 ملليلتر لاحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 550 ثورة في الدقيقة في كتلة التدفئة. في نهاية الحضانات، ضع أعمدة تحلية مع قبعات خففت والملتوية قبالة قيعان في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر الفردية، والطرد المركزي الأعمدة لإزالة السائل.بعد الطرد المركزي، ضع الأعمدة في أنابيب جديدة مع إزالة القبعات، ثم قم بتحميل حلول sulfo-SMCC وOVA TCEP-HCL للأجسام المضادة ببطء إلى مركز سرير الراتنج المضغوط لعمود واحد لكل حل. بعد الطرد المركزي، تجاهل الأعمدة ومزج فورا الأجسام المضادة وحلول OVA مع pipetting لطيف. قم بتحميل محلول مضاد DEC-205/OVA على مركز بروتين طرد مركزي وملء المكثف مع PBS إلى حجم 15 ملليلتر.الطرد المركزي المكثف لمدة خمس دقائق في 2000 مرة G ودرجة حرارة الغرفة وملء المكثف مع 10 ملليلتر إضافية من برنامج تلفزيوني. بعد الطرد المركزي التركيز لمدة ثماني دقائق على الأقل في ظل ظروف الطرد المركزي نفسه، وجمع بلطف العينة المركزة من الغرفة العليا. للتحقق من نجاح اقتران من قبل تحليل لطخة الغربية، تحميل aaliquot من كل عينة على معيار البروتين على هلام SDS وتشغيل هلام وفقا لبروتوكولات تحليل SDS-PAGE القياسية.بعد النشاف هلام، وصمة عار الأغشية مع الأجسام المضادة المقترنة الفجل peroxidase للكشف عن المضادة DEC-205 أو OVA وفقا للبروتوكولات القياسية. ويمكن بعد ذلك تحليل الأغشية لوجود البروتين المعني في كل عينة. للتحقق من نجاح اقتران ELISA ، قم بتغليف لوحة ELISA مناسبة من 96 جيدا مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة OVA لكل بئر وتمييع مضاد DEC-205/OVA بشكل متسلسل بنسبة 1 إلى 2 ومنع العازلة للحصول على المخففات من ستة ميكروغرام لكل ملليلتر إلى 93.8 نانوغرام لكل ملليلتر.أضف 100 ميكرولتر من كل تمييع إلى الآبار المناسبة للوح المغلف بالأجسام المضادة لاحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة المترافقة الفجل peroxidase ضد المضادة DEC-205/OVA المصاحبة إلى لوحة لاحتضان ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، ثم إضافة 50 ميكرولتر من ركيزة البيروكسيديز الفجل إلى كل بئر للسماح بتحليل رد فعل اللون عن طريق قياس الطيف. يمكن استخدام تحليل لطخة الغربية الموازية للكشف عن كل من OVA المترافقة وكذلك مكافحة DEC-205 المترافقة.تلطيخ لOVA من شأنه أن يسمح للكشف عن OVA الحرة الزائدة إذا كان موجودا، وتلطيخ لمكافحة DEC-205 يتحقق من نجاح اقتران من خلال زيادة في الوزن الجزيئي بين عارية المضادة DEC-205 والموازية. ويمكن أيضا أن تستخدم ELISA لتقييم نجاح الاقتران مع وجود علاقة إيجابية بين إشارة الكشف عن وكمية تحليل البروتين مما يدل على نجاح جيل المضادة DEC-205/OVA المترافق. تدفق قياس الخلايا وتحليل immunofluorescence تظهر بوضوح أن الأساسية المضادة DEC-205 يربط بكفاءة خلايا CD11c إيجابية المشتقة من نخاع العظام.التطعيم مع المضادة DEC-205/OVA بالتزامن مع المساعد يؤدي إلى زيادة في OVA محددة IgG titers في المتلقين الماوس مقارنة مع التطعيم مع OVA وم المساعدة وحدها. وعلاوة على ذلك، فإن مضادات DEC-205/OVA تحفز بكفاءة استجابات الخلايا التائية الإيجابية CD4 وCD8 مع استجابات الخلايا التائية الإيجابية CD8 المضادة DEC-205/OVA التي تتجاوز إلى حد كبير تلك الناجمة عن OVA وحدها. من أجل نجاح اقتران مستضد OVA بالأجسام المضادة المضادة DEC-205 ، من المهم إعداد المواد كما هو موضح وتنفيذ خطوات التواؤم في ظل ظروف متسقة.بعد اقتران ناجح للمضاد والأجسام المضادة ، من الممكن اتباع العديد من النهج اللاحقة ، بما في ذلك التحليل الملزم وتحريض المناعة الممرضة أو المرتبطة بالورم في الجسم الحي.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

في المختبر التصوير والكمي لاستهداف الكفاءة المخدرات من النظائر نره Fluorescently إعتبر

GnRH analogues are effective targeting moieties and able to deliver anticancer agents selectively into malignant tumor cells which highly express GnRH ...

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

إنشاء المقاومة المزدوج EGFR TKI واجتمع TKI في الرئة غدية الخلايا في المختبر بإجراء الخطوة 2-تصعيد للجرعة

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

عد البروتينات في الخلايا المفردة مع الحبرية عنونة [ميكروارس]

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

تتحرك صعودا: بسيطة ومرنة في المختبر غزو ثلاثية الأبعاد مقايسة بروتوكول

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

في فيفو تقييم الجيش الشعبي الثوري لدرجة الحموضة، فس2، حالة الأكسدة والاختزال، وتركيزات الفوسفات والجلوتاثيون في "ورم المكروية"

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

بروتوكول عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات الماوس ومن تفعيل اللاحقة في المختبر مع مجمعات محصنة ضد الورم

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

GPC3--استهداف جسم بيسبيسيفيك، GPC3-S-القوات المسلحة البوروندية، مع سيتوتوكسيسيتي قوية

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

تخصيب فوسفوبيبتيدي مقترنة بكمية خالية من تسمية الطيف الكتلي للتحقيق في فوسفوبروتيومي في سرطان البروستاتا

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

في فيفو الفلورة المناعية توطين لتقييم التوزيع الحيوي للجسم المضاد العلاجي والتشخيصي في أبحاث السرطان

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

في فيفو استهداف الخلايا السرطانية البشرية Xenografted مع وظيفية السيليكا النانوية في حمار وحشي

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...