Name: chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo
Uploaded: 2021-02-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Forfatterne takker S. Prettin for ekspert teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Helmholtz Association of German Research Centers (HGF), der blev leveret som en del af Helmholtz Alliance ''Immunterapi af kræft" (HCC_WP2b).

Alle de beskrevne dyreforsøg blev godkendt af den lokale myndighed (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; sagsnummer 33.12-42502-04-10/0108) og blev udført i henhold til de nationale og institutionelle retningslinjer.
1. Produktion af αDEC-205 fra hybridoma cellelinjen NLDC-145
<ol><li>Til antistofproduktion optøs kryopreserverede NLDC-145-celler, der producerer αDEC-205 ved 37 °C i et vandbad. Udvide cellerne ved 37 °C og 5% CO2. T...

<ol>
	<li>Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+complete+repertoire+of+conventional+dendritic+cell+functions+for+cancer+immunotherapy.">Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy.</a> Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Wculek, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+cancer+immunology+and+immunotherapy.">Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy.</a> Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).</li><li>Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell-targeted+vaccines--hope+or+hype.">Dendritic cell-targeted vaccines--hope or hype.</a> Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).</li><li>Bonifaz, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+targeting+of+antigens+to+maturing+dendritic+cells+via+the+DEC-205+receptor+improves+T+cell+vaccination.">In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination.</a> Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).</li><li>Boscardin, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+targeting+to+dendritic+cells+elicits+long-lived+T+cell+help+for+antibody+responses.">Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses.</a> Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).</li><li>Hossain, M. K., Wall, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Dendritic+Cell+Receptors+as+Targets+for+Enhancing+Anti-Cancer+Immune+Responses.">Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses.</a> Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).</li><li>Johnson, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+melanoma+growth+by+targeting+of+antigen+to+dendritic+cells+via+an+anti-DEC-205+single-chain+fragment+variable+molecule.">Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule.</a> Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).</li><li>Trumpfheller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbial+mimic+poly+IC+induces+durable+and+protective+CD4++T+cell+immunity+together+with+a+dendritic+cell+targeted+vaccine.">The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).</li><li>Idoyaga, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparable+T+helper+1+(Th1)+and+CD8+T-cell+immunity+by+targeting+HIV+gag+p24+to+CD8+dendritic+cells+within+antibodies+to+Langerin,+DEC205,+and+Clec9A.">Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).</li><li>Sancho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+therapy+in+mice+via+antigen+targeting+to+a+novel,+DC-restricted+C-type+lectin.">Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+antigen+delivery+to+dendritic+cells+elicits+robust+antiviral+T+cell-mediated+immunity+in+the+liver.">Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver.</a> Scientific Reports. 7, 43985 (2017).</li><li>Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans'+cells,+veiled+cells,+and+interdigitating+cells+in+the+mouse+recognized+by+a+monoclonal+antibody.">Langerhans' cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STING+activator+c-di-AMP+exerts+superior+adjuvant+properties+than+the+formulation+poly(I:C)/CpG+after+subcutaneous+vaccination+with+soluble+protein+antigen+or+DEC-205-mediated+antigen+targeting+to+dendritic+cells.">The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells.</a> Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).</li></ol>

Kemisk konjugation af et endodotosereceptorspecifikt antistof og et proteinantigen giver en effektiv og, vigtigst af alt, også fleksibel tilgang til in vivo DC-målretning i prækliniske musemodeller. Med vores protokol giver vi en effektiv tilgang til en vellykket bøjning af modellen antigen OVA til et DEC-205-specifikt IgG-antistof.
I vores protokol renses αDEC-205 fra en hybridoma-cellelinje, og tidligere har vi renset antistoffet ved hjælp af protein G sepharose som beskrevet....

Dendritiske celler (DC) er centrale aktører i immunsystemet. De er en forskelligartet gruppe af celler specialiseret i antigen-præsentation og deres vigtigste funktion er at bygge bro medfødte og adaptive immunitet1,2. Det er vigtigt, at DC ikke kun spiller en vigtig rolle i effektive og specifikke patogenstyrede reaktioner, men er også involveret i mange aspekter af antitumorimmunitet1,3.
På grund af deres eksklusive rolle i værtsimmunitet kom DC i fokus som målceller til vaccination4. En tilgang er at målrette antigener til DC in vivo at fremkalde antigen-specifikke immunrespons og i løbet af de sidste år, et stort antal undersøgelser er blevet dedikeret til at definere egnede receptorer og målretning strategier1,4. Et eksempel er C-type lectin receptor DEC-205, som kan målrettes af DEC-205-specifikke antistoffer til at fremkalde endokytose. Det er vigtigt, dec-205 målretning i kombination med egnede adjuvanser har vist sig effektivt at fremkalde langlivede og beskyttende CD4+ og CD8+ T-celler, samt antistofresponser, også mod tumorantigener3,5,6,7,8,9.
Der er en række undersøgelser , der viser konjugeret antigener målrettet DC at være overlegen i forhold til gratis ukonjugeret antigen3,5,10,11,12. Dette gør bøjning af antigen til de respektive DC målretning moiety et centralt skridt i DC målretning tilgange. I tilfælde af DC-målretning via antistoffer eller antistoffragmenter kan antigener enten være kemisk eller genetisk forbundet, og begge strategier giver sine egne (dis)fordele1. På den ene side, i genetisk manipuleret antistof-antigen konstruktioner er der en kontrol over antigen dosis samt placeringen giver overlegen sammenlignelighed mellem parti1. Samtidig kræver kemisk bøjning imidlertid mindre forberedelse og giver mere fleksibilitet, især når man forsøger at teste og sammenligne forskellige antigener og/eller vaccinationsstrategier i eksperimentelle og prækliniske modeller.
Her præsenterer vi en protokol for effektiv og pålidelig kemisk bøjning af ovalbumin (OVA) som et modelproteinantigen til et DEC-205-specifikt IgG2a-antistof (αDEC-205), der er egnet til in vivo DC-målretning hos mus. Først renses αDEC-205 fra NLDC-145 hybridomaceller13. For kemisk bøjning anvendes den heterobiologiske crosslinker sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylat (sulfo-SMCC), som indeholder NHS (N-hydroxysuccinimid) ester- og maleimidegrupper, hvilket muliggør kovalent bøjning af amin- og sulfhydrylholdige molekyler. Specifikt reagerer de primære aminer af antistoffet i første omgang med sulfo-SMCC, og den resulterende maleimideaktiverede αDEC-205 reagerer derefter med det sulfhydrylholdige OVA-protein reduceret gennem TCEP-HCl (Tris(2-carboxyethyl) fosphinhydrochlorid). Det endelige produkt er kemisk konjugeret αDEC-205/OVA (Figur 1). Ud over kemisk bøjning selv beskriver vores protokol fjernelse af overskydende OVA fra konjugaten samt verifikation af vellykket bøjning gennem western blotanalyse og en specifik enzymrelateret immunosorbentanalyse. Vi har med succes anvendt denne tilgang i fortiden til kemisk konjugat OVA og andre proteiner eller immunogene peptider til αDEC-205. Vi demonstrerer effektiv binding til CD11c+ celler in vitro samt effektiv induktion af cellulær og humoristisk immunitet in vivo.
Bestemt, der er ulemper ved denne metode, såsom i lot-to-lot sammenlignelighed og i den nøjagtige dosering af antigen inden for den endelige konjugat. Ikke desto mindre giver kemisk bøjning eksperimentel fleksibilitet i valget af antistoffet og proteinantigen sammenlignet med genetisk manipulerede konstruktioner. Derfor mener vi, at denne tilgang er særlig værdifuld i evalueringen af forskellige antigener for deres effektivitet i DC målretning i prækliniske musemodeller, især også i forbindelse med specifikke antitumor immunresponser.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibody buffer 2 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody buffer 5 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % FBS in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 4 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 10 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T25</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>690175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T75</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR&#160; filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T175</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>661175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal concentrator MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2001</td>
			<td>Vivaspin 20 centrifugal concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88532</td>
			<td>Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>525-2314</td>
			<td>PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coating buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desalting columns MWCO 7 kDa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89891</td>
			<td>Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent ELISA (HRPO substrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>T8665-100ML</td>
			<td>3,3&#8242;,5,5&#8242;-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent western blot (HRPO substrate)</td>
			<td>Roche/Merck</td>
			<td>12 015 200 01</td>
			<td>Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa</td>
			<td>SERVA Electrophoresis</td>
			<td>44110</td>
			<td>Visking dialysis tubing, 16 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA 96-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td>MaxiSorp Nunc-Immuno Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum</td>
			<td>PAN-BIOtech</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>FBS Good forte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISF-1 medium</td>
			<td>Biochrom/bioswisstec</td>
			<td>F 9061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145.2</td>
			<td>powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLDC-145 hybridoma</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-290</td>
			<td>if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-reducing SDS sample buffer 4 x&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 &#181;l 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 &#181;l of 5 % Bromphenol Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ovalbumin</td>
			<td>Hyglos (via BioVendor)</td>
			<td>321000</td>
			<td>EndoGrade OVA ultrapure with &#60;0.1 EU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles</td>
			<td>Nunc In Vitro</td>
			<td>734-2394</td>
			<td>standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm&#178;, 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109535</td>
			<td>pH indicator strips 0-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG(H+L)-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-062</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG+IgM-HRPO antibody&#160; (ELISA)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-068</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rabbit-IgG-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>111-035-045&#160;</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA (ELISA)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181688</td>
			<td>used at 3 ng/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA antibody (western blot)</td>
			<td>OriGene</td>
			<td>R1101</td>
			<td>used at 1:3,000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose column</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>P3296</td>
			<td>5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td>PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber plug</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5230217</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN rubber stoppers (lower &#934; 17 mm; upper &#934; 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone tube</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5430925</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN (inside &#934; 1 mm; outer &#934; 3 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim-Fast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopping solution (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M H2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22322</td>
			<td>Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter unit 0.22 &#181;m&#160;</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe 10 ml</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Disposable syringes Injekt&#174; Solo B.Braun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican&#174; cannulas</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td></td>
			<td>Sterican&#174; G 20 x 1 1/2&#34;&#34;; 0.90 x 40 mm; yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A35349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing connector</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo

Målrettet antigen levering til cross-præsentere dendritiske celler (DC) in vivo effektivt inducerer T effektor celle svar og viser en værdifuld tilgang i vaccine design. Antigen leveres til DC via antistoffer, der er specifikke for endoytosereceptorer som DEC-205, der fremkalder optagelse, behandling og MHC-klasse I- og II-præsentation.
Effektiv og pålidelig bøjning af det ønskede antigen til et passende antistof er et kritisk skridt i DC-målretning og afhænger blandt andet af antigens format. Kemisk bøjning af protein i fuld længde til rensede antistoffer er en mulig strategi. Tidligere har vi med succes etableret krydsbinding af modellen antigen ovalbumin (OVA) og et DEC-205-specifikt IgG2a-antistof (αDEC-205) til in vivo DC-målretningsundersøgelser hos mus. Det første trin i protokollen er rensning af antistoffet fra supernatanten af NLDC (ikke-lymfoide dendritiske celler)-145 hybridoma ved affinitetskromatografi. Det rensede antistof aktiveres til kemisk bøjning ved sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylat), mens samtidig sulfhydryl-grupperne af OVA-proteinet eksponeres gennem inkubation med TCEP-HCl (tris (2-carboxyethyl) fosphinhydrochlorid). Overskydende TCEP-HCl og sulfo-SMCC fjernes, og antigen blandes med det aktiverede antistof til natkobling. Den resulterende αDEC-205/OVA konjugat er koncentreret og befriet fra ubundet OVA. Vellykket bøjning af OVA til αDEC-205 verificeres ved western blotanalyse og enzymrelateret immunosorbentanalyse (ELISA).
Vi har med succes brugt kemisk crosslinked αDEC-205/OVA til at fremkalde cytotoksiske T-celleresponser i leveren og til at sammenligne forskellige adjuvanser for deres potentielle inducerende humoristiske og cellulære immunitet efter in vivo målretning af DEC-205+ DC. Ud over, at sådanne kemisk koblet antistof / antigen konjugates tilbyde værdifulde værktøjer til effektiv induktion af vaccinen reaktioner på tumor antigener og har vist sig at være overlegen i forhold til klassisk immunisering tilgange vedrørende forebyggelse og behandling af forskellige typer af tumorer.

Kemisk konjugation af αDEC-205 til OVA-protein ved hjælp af denne protokol vil typisk muliggøre effektiv generering af αDEC-205/OVA til in vivo DC-målretningsmetoder. Der er forskellige strategier til at kontrollere selve teknikken og teste funktionaliteten af den udbyttede konjugat. Western blot-analyse og ELISA anvendes til at verificere vellykket bøjning og samtidig opdage potentielt venstre gratis OVA (figur 2). In vitro-bindende u...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Vi beskriver en protokol for den kemiske bøjning af modellen antigen ovalbumin til en endokytose receptor-specifikke antistof for in vivo dendritiske celle målretning. Protokollen omfatter rensning af antistoffet, kemisk bøjning af antigen, samt rensning af konjugaten og verifikation af effektiv bøjning.

Kemisk bøjning af et renset DEC-205-rettet antistof med protein i fuld længde til målretning af musededritiske celler In Vitro og In Vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

Denne protokol, for hvilken alle forsøgstilstanden er blevet omhyggeligt optimeret, kan bruges til at lette en vellykket og effektiv kemisk bøjning af DEC-205 antistoffet mod OVA-antigen. De vigtigste fordele ved denne teknik er, at den tillader et fleksibelt udvalg af proteinantigen og antistoffet, og at det ikke er afhængig af genetisk fusion af disse komponenter. Vi har også brugt denne protokol til at generere konjugere af hepatitis C-virusproteiner og anti-DEC-205 til in vivo DC-målretning.Dette kan ligeledes være værdifuldt for anti-tumor vaccination tilgange. For at starte anti-DEC-205 produktion, genbruge en en milliliter volumen på en til fem millioner optøet kryo-konserveret NLDC 145 celler i ni milliliter på 37 grader Celsius ISF-1 medium suppleret med 1% penicillin og streptomycin, og frø cellerne i en 25 kvadratcentimeter celle kultur kolbe til inkubation ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 24 til 48 timer. Når cellerne når 70% sammenløb, overføre hele celle suspension i en 15 milliliter konisk rør og indsamle cellerne ved centrifugering.Resuspend pellet i 12 milliliter frisk komplet 37 graders ISF-1 medium og re-plade cellerne i en 75 kvadratcentimeter kolbe. Efter 48 til 72 timers kultur, opdele 70% sammenløbskultur mellem hver af to nye 75 kvadratcentimeter kolber og tilsæt seks milliliter frisk komplet ISF-1 medium til hver kolbe. Når kulturerne når 70% sammenløb, skal du bruge en 10 milliliter pipette til at skylle cellekulturkolbebundene og kulturfladerne med celleaffjedringen for at samle alle cellerne og overføre 10 milliliter af hver udvidet NLDC 145 celleaffjedring til individuelle PETG-rulleflasker.Derefter tilsættes 140 milliliter af komplet ISF-1 medium til hver rulleflaske kultur og kultur rulleflasker på 37 grader Celsius, 5% kuldioxid og 25 runder i minuttet i tre dage. For antistofrensning fra NLDC 145 supernatant skal du placere enden af et siliciumrør i det supernatantfyldte bægerglas og tillade 800 milliliter supernatant at køre dropwise gennem en Protein G Sepharose kolonne. Til elution tilsættes 100 mikroliter af 1,5 molar Tris-HCL i hvert af tyve 1,5 milliliterrør og fjern gummistikket fra kolonnen.Der overføres en milliliter på 0,1 molarglycin til kolonnens øverste kammer og opsamles antistoffet, der indeholder eluent, i et af de forberedte 1,5 milliliterrør, og gentag for hvert rør. Når alle antistoffet er indsamlet, og de antistofholdige elutions er blevet samlet, skal du lukke bunden af en 20 centimeter lang dialyseslange med en passende dialyserørslukning og forsigtigt pipette antistofelutionen ind i slangen. Luk toppen af dialyseslangen med en anden klemme og fastgør den øverste klemme på dialyseslangen til et flydende stativ.Tilsæt en magnetisk omrøringsstang til et bæger pbs og læg bægeret på en magnetisk omrører. Efter natten dialyse ved fire grader Celsius, åbne en klemme til at tillade lastning af den komplette dialysate til en centrifugal koncentrator med en 10 kiloDalton molekylvægt cutoff, og centrifuge koncentratoren i 30 minutter ved 693 gange G og fire grader Celsius. Ved slutningen af spin, indlæse centrifugal koncentrator med 10 milliliter PBS for en anden centrifugering, indtil en sidste en til 1,5 milliliter volumen af antistofopløsning er opnået.For at konjugatere OVA til anti-DEC-205 antistoffet tilsættes 200 mikroliter PBS suppleret med 500 mikrogram OVA-protein, 240 mikrolitere af en frisklavet TCEP-HCL-opløsning og 560 mikroliters sterilt ultrapurt vand til et 1,5 milliliterrør til en 1,5 timers inkubation ved stuetemperatur. Samtidig tilsættes 2,5 milligram anti-DEC-205 i 900 mikroliter pbs og 100 mikroliter af frisklavet sulfo-SMCC til en anden 1,5 milliliter rør til en 30-minutters inkubation ved 37 grader Celsius ved 550 omdrejninger i minuttet i en varmeblok. I slutningen af inkubationerne placeres afsaltningskolonner med løsnede hætter og snoet bunde i individuelle 15 milliliter koniske rør og centrifugerer kolonnerne for at fjerne væsken.Efter centrifugering skal kolonnerne placeres i nye rør med hætterne fjernet og langsomt indlæse antistofsulffo-SMCC- og OVA TCEP-HCL-opløsningerne til midten af den kompakte harpiksbund med en kolonne pr. Opløsning. Efter centrifugering kasseres kolonnerne og straks antistof- og OVA-opløsningerne blandes med skånsom pipettering. Indlæs anti-DEC-205/OVA-opløsningen på en centrifugalproteinkoncentrator, og fyld koncentratoren med PBS til et volumen på 15 milliliter.Centrifugere koncentratoren i fem minutter ved 2.000 gange G og stuetemperatur og fylde koncentratoren med yderligere 10 milliliter PBS. Efter at have centrifugeret koncentrationen i mindst otte minutter under de samme centrifugebetingelser opsamles den koncentrerede prøve forsigtigt fra det øverste kammer. For at kontrollere succesen af bøjningen ved Western blot-analyse skal du indlæse en aliquot ud af hver prøve på en proteinstandard på en SDS-gel og køre gelen i henhold til standard SDS-PAGE-analyseprotokoller.Efter gel blotting, plette membranerne med peberrod peroxidase konjugerede antistoffer til at opdage anti-DEC-205 eller OVA i henhold til standard protokoller. Membranerne kan derefter analyseres for tilstedeværelsen af det respektive protein i hver prøve. For at kontrollere ELISA's succes skal elisaens bøjning belægges en passende 96-brønds ELISA-plade med 100 mikroliters anti-OVA-antistof pr. brønd og serielt fortyndet anti-DEC-205/OVA i et et til to-forhold og blokerende buffer for at opnå fortyndinger fra seks mikrogram pr. milliliter til 93,8 nanogram pr. milliliter.Der tilsættes 100 mikroliter af hver fortynding til de relevante brønde på den antistofbelagte plade for en times inkubation ved stuetemperatur. Ved inkubationens afslutning tilsættes 100 mikroliter peberrodsperoxidasekonjugeret antistof mod anti-DEC-205/OVA konjugat til pladen for en times inkubation ved stuetemperatur og tilsæt derefter 50 mikrolitere af peberrod peroxidasesubstrat til hver brønd for at tillade analyse af farvereaktionen ved spektrofotometri. Parallel Western blot analyse kan bruges til at opdage både konjugeret OVA samt konjugeret anti-DEC-205.Farvning for OVA ville gøre det muligt at opdage overskydende gratis OVA, hvis de er til stede, og farvning til anti-DEC-205 bekræfter konjugationens succes gennem en stigning i molekylvægten mellem nøgen anti-DEC-205 og konjugaten. ELISA kan også bruges til at vurdere bøjningens succes med en positiv sammenhæng mellem det fundne signal og den analyserede mængde protein, der indikerer den vellykkede generation af anti-DEC-205/OVA-konjugant. Flowcytometri og immunofluorescence analyse viser tydeligt, at anti-DEC-205 kernen effektivt binder knoglemarvs-afledte CD11c-positive celler.Vaccination med anti-DEC-205/OVA i forbindelse med adjuvans fremkalder en stigning i OVA-specifikke IgG-titere hos musemodtagere sammenlignet med vaccination med OVA og adjuvans alene. Desuden fremkalder anti-DEC-205/OVA effektivt overspecifikke CD4- og CD8-positive T-celleresponser med de anti-DEC-205/OVA-inducerede CD8-positive T-celleresponser, der i væsentlig grad overstiger den, der forårsages af OVA alene. For en vellykket bøjning af OVA antigen til anti-DEC-205 antistof er det vigtigt at forberede materialerne som demonstreret og udføre bøjningstrinene under ensartede forhold.Efter vellykket bøjning af antigen og antistoffet er mange efterfølgende tilgange mulige, herunder bindende analyse og induktion af patogen eller tumorrelateret immunitet in vivo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

In vitro Imaging og Kvantificering af Drug Targeting Effektivitet af fluorescens-mærkede GnRH-analoger

GnRH analogues are effective targeting moieties and able to deliver anticancer agents selectively into malignant tumor cells which highly express GnRH ...

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Oprettelse af dobbelt modstand mod EGFR-TKI og MØDTE TKI i lunge adenocarcinom celler In Vitro med en 2-trins dosis-eskalering Procedure

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Counting proteiner i enkelt celler med adresserbare Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Bevæger sig opad: En enkel og fleksibel In Vitro tredimensionale Invasion Assay protokol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR vurdering af pH, pO2, Redox Status, og koncentrationen af fosfat og glutathion i Tumor mikromiljø

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation protokol af musen monocyt-afledte dendritiske celler og deres efterfølgende In Vitro aktivering med Tumor immunkomplekser

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

En GPC3-målretning Bispecific antistof, GPC3-S-Fab med potente cytotoksicitet

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphopeptide berigelse kombineret med etiket-fri kvantitativ massespektrometri til at undersøge Phosphoproteome i Prostata Cancer

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

In vivo immunofluorescens lokalisering til vurdering af terapeutisk og diagnostisk antistof Biodistribution i kræftforskning

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

I Vivo Målretning af Xenografted humane kræftceller med funktionaliserede fluorescerende Silica nanopartikler i zebrafisk

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...