Name: chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo
Uploaded: 2021-02-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo at JoVE.com

De auteurs bedanken S. Prettin voor deskundige technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Helmholtz Association of German Research Centers (HGF) die werd verstrekt als onderdeel van de Helmholtz Alliance ''Immunotherapy of Cancers" (HCC_WP2b).

Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door de lokale overheidsinstantie (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; dossiernummer 33.12-42502-04-10/0108) en werden uitgevoerd volgens de nationale en institutionele richtlijnen.
1. Productie van αDEC-205 uit de hybridoma cellijn NLDC-145
<ol><li>Voor de productie van antilichamen ontdooien gecryopreserveerde NLDC-145-cellen die αDEC-205 produceren bij 37 °C in een waterbad. Zet de cellen uit bij...

<ol>
	<li>Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+complete+repertoire+of+conventional+dendritic+cell+functions+for+cancer+immunotherapy.">Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy.</a> Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Wculek, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+cancer+immunology+and+immunotherapy.">Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy.</a> Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).</li><li>Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell-targeted+vaccines--hope+or+hype.">Dendritic cell-targeted vaccines--hope or hype.</a> Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).</li><li>Bonifaz, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+targeting+of+antigens+to+maturing+dendritic+cells+via+the+DEC-205+receptor+improves+T+cell+vaccination.">In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination.</a> Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).</li><li>Boscardin, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+targeting+to+dendritic+cells+elicits+long-lived+T+cell+help+for+antibody+responses.">Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses.</a> Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).</li><li>Hossain, M. K., Wall, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Dendritic+Cell+Receptors+as+Targets+for+Enhancing+Anti-Cancer+Immune+Responses.">Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses.</a> Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).</li><li>Johnson, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+melanoma+growth+by+targeting+of+antigen+to+dendritic+cells+via+an+anti-DEC-205+single-chain+fragment+variable+molecule.">Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule.</a> Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).</li><li>Trumpfheller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbial+mimic+poly+IC+induces+durable+and+protective+CD4++T+cell+immunity+together+with+a+dendritic+cell+targeted+vaccine.">The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).</li><li>Idoyaga, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparable+T+helper+1+(Th1)+and+CD8+T-cell+immunity+by+targeting+HIV+gag+p24+to+CD8+dendritic+cells+within+antibodies+to+Langerin,+DEC205,+and+Clec9A.">Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).</li><li>Sancho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+therapy+in+mice+via+antigen+targeting+to+a+novel,+DC-restricted+C-type+lectin.">Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+antigen+delivery+to+dendritic+cells+elicits+robust+antiviral+T+cell-mediated+immunity+in+the+liver.">Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver.</a> Scientific Reports. 7, 43985 (2017).</li><li>Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans'+cells,+veiled+cells,+and+interdigitating+cells+in+the+mouse+recognized+by+a+monoclonal+antibody.">Langerhans' cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STING+activator+c-di-AMP+exerts+superior+adjuvant+properties+than+the+formulation+poly(I:C)/CpG+after+subcutaneous+vaccination+with+soluble+protein+antigen+or+DEC-205-mediated+antigen+targeting+to+dendritic+cells.">The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells.</a> Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).</li></ol>

Chemische conjugatie van een endocytosereceptorspecifiek antilichaam en een eiwitantigeen biedt een efficiënte en, belangrijker nog, ook flexibele aanpak voor in vivo DC-targeting in preklinische muismodellen. Met ons protocol bieden we een efficiënte aanpak voor de succesvolle conjugatie van het modelantigeen OVA naar een DEC-205-specifiek IgG-antilichaam.
In ons protocol wordt αDEC-205 gezuiverd uit een hybridoma cellline en in het verleden hebben we het antilichaam gezuiverd met...

Dendritische cellen (DC) zijn centrale spelers van het immuunsysteem. Ze zijn een diverse groep cellen gespecialiseerd in antigeen-presentatie en hun belangrijkste functie is het overbruggen van aangeboren en adaptieve immuniteit1,2. Belangrijk is dat DC niet alleen een belangrijke rol speelt bij efficiënte en specifieke pathogeengerichte reacties, maar ook betrokken is bij vele aspecten van antitumorimmuniteit1,3.
Vanwege hun exclusieve rol in gastheerimmuniteit kwam DC in beeld als doelcellen voor vaccinatie4. Een benadering is om antigenen in vivo op DC te richten om antigeenspecifieke immuunresponsen te induceren en in de afgelopen jaren is een groot aantal studies gewijd aan het definiëren van geschikte receptoren en targetingstrategieën1,4. Een voorbeeld is de C-type lectinereceptor DEC-205, die kan worden aangevallen door DEC-205-specifieke antilichamen om endocytose te induceren. Belangrijk is dat dec-205-targeting in combinatie met geschikte adjuvantia efficiënt langlevende en beschermende CD4+ en CD8+ T-cellen induceert, evenals antilichaamresponsen, ook tegen tumorantigenen3,5,6,7,8,9.
Er zijn een aantal studies die aantonen dat geconjugeerde antigenen gericht op DC superieur zijn aan vrij niet-geconjugeerd antigeen3,5,10,11,12. Dit maakt de vervoeging van het antigeen met het respectieve DC-targetinggedeelte een centrale stap in DC-targetingbenaderingen. In het geval van DC-targeting via antilichamen of antilichaamfragmenten kunnen antigenen chemisch of genetisch verbonden zijn en beide strategieën bieden hun eigen (dis)voordelen1. Aan de ene kant is er in genetisch gemanipuleerde antilichaam-antigeenconstructies een controle over de antigeendosis en de locatie die superieure vergelijkbaarheid tussen loten1biedt . Tegelijkertijd heeft chemische conjugatie echter minder voorbereiding nodig en biedt het meer flexibiliteit, vooral bij het testen en vergelijken van verschillende antigenen en / of vaccinatiestrategieën in experimentele en preklinische modellen.
Hier presenteren we een protocol voor de efficiënte en betrouwbare chemische conjugatie van ovalbumine (OVA) als modeleiwitantigeen tegen een DEC-205-specifiek IgG2a-antilichaam (αDEC-205) geschikt voor in vivo DC-targeting bij muizen. Ten eerste wordt αDEC-205 gezuiverd uit NLDC-145 hybridomacellen13. Voor chemische conjugatie wordt de heterobifunctionele crosslinker sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexaan-1-carboxylaat (sulfo-SMCC), die NHS (N-hydroxysuccinimide) ester- en maleimidegroepen bevat, gebruikt, waardoor covalente conjugatie van amine- en sulhydrylbevattende moleculen mogelijk is. In het bijzonder reageren de primaire amines van het antilichaam in eerste instantie met sulfo-SMCC en de resulterende maleimide-geactiveerde αDEC-205 reageert vervolgens met het sulfhydryl-bevattende OVA-eiwit gereduceerd door TCEP-HCl (Tris (2-carboxyethyl) fosfinehydrochloride). Het eindproduct is chemisch geconjugeerd αDEC-205/OVA(figuur 1). Naast chemische conjugatie zelf, beschrijft ons protocol de verwijdering van overtollige OVA uit het conjugaat, evenals de verificatie van succesvolle conjugatie door middel van western blot-analyse en een specifieke enzymgebonden immunosorbent-assay. We hebben deze aanpak in het verleden met succes toegepast om OVA en andere eiwitten of immunogene peptiden chemisch te conjugeren aan αDEC-205. We tonen efficiënte binding aan CD11c+ cellen in vitro, evenals de efficiënte inductie van cellulaire en humorale immuniteit in vivo.
Zeker, er zijn nadelen aan deze methode, zoals in lot-to-lot vergelijkbaarheid en in de exacte dosering van het antigeen binnen het uiteindelijke geconjugeerde. Niettemin biedt chemische conjugatie experimentele flexibiliteit in de keuze van het antilichaam en het eiwitantigeen in vergelijking met genetisch gemanipuleerde constructies. Daarom geloven we dat deze aanpak vooral waardevol is bij het evalueren van verschillende antigenen voor hun efficiëntie in DC-targeting in preklinische muismodellen, belangrijk ook in de context van specifieke antitumor immuunresponsen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibody buffer 2 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody buffer 5 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % FBS in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 4 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 10 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T25</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>690175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T75</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR&#160; filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T175</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>661175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal concentrator MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2001</td>
			<td>Vivaspin 20 centrifugal concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88532</td>
			<td>Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>525-2314</td>
			<td>PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coating buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desalting columns MWCO 7 kDa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89891</td>
			<td>Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent ELISA (HRPO substrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>T8665-100ML</td>
			<td>3,3&#8242;,5,5&#8242;-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent western blot (HRPO substrate)</td>
			<td>Roche/Merck</td>
			<td>12 015 200 01</td>
			<td>Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa</td>
			<td>SERVA Electrophoresis</td>
			<td>44110</td>
			<td>Visking dialysis tubing, 16 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA 96-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td>MaxiSorp Nunc-Immuno Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum</td>
			<td>PAN-BIOtech</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>FBS Good forte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISF-1 medium</td>
			<td>Biochrom/bioswisstec</td>
			<td>F 9061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145.2</td>
			<td>powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLDC-145 hybridoma</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-290</td>
			<td>if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-reducing SDS sample buffer 4 x&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 &#181;l 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 &#181;l of 5 % Bromphenol Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ovalbumin</td>
			<td>Hyglos (via BioVendor)</td>
			<td>321000</td>
			<td>EndoGrade OVA ultrapure with &#60;0.1 EU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles</td>
			<td>Nunc In Vitro</td>
			<td>734-2394</td>
			<td>standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm&#178;, 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109535</td>
			<td>pH indicator strips 0-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG(H+L)-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-062</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG+IgM-HRPO antibody&#160; (ELISA)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-068</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rabbit-IgG-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>111-035-045&#160;</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA (ELISA)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181688</td>
			<td>used at 3 ng/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA antibody (western blot)</td>
			<td>OriGene</td>
			<td>R1101</td>
			<td>used at 1:3,000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose column</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>P3296</td>
			<td>5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td>PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber plug</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5230217</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN rubber stoppers (lower &#934; 17 mm; upper &#934; 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone tube</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5430925</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN (inside &#934; 1 mm; outer &#934; 3 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim-Fast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopping solution (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M H2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22322</td>
			<td>Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter unit 0.22 &#181;m&#160;</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe 10 ml</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Disposable syringes Injekt&#174; Solo B.Braun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican&#174; cannulas</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td></td>
			<td>Sterican&#174; G 20 x 1 1/2&#34;&#34;; 0.90 x 40 mm; yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A35349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing connector</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo

Gerichte antigeenafgifte aan cross-presenterende dendritische cellen (DC) in vivo induceert efficiënt T-effectorcelresponsen en toont een waardevolle benadering in vaccinontwerp. Antigeen wordt aan DC geleverd via antilichamen die specifiek zijn voor endocytosereceptoren zoals DEC-205 die opname, verwerking en MHC klasse I- en II-presentatie induceren.
Efficiënte en betrouwbare conjugatie van het gewenste antigeen naar een geschikt antilichaam is een cruciale stap in DC-targeting en hangt onder andere af van het formaat van het antigeen. Chemische conjugatie van eiwit over de volledige lengte naar gezuiverde antilichamen is een mogelijke strategie. In het verleden hebben we met succes cross-linking vastgesteld van het modelantigeen ovalbumine (OVA) en een DEC-205-specifiek IgG2a-antilichaam (αDEC-205) voor in vivo DC-targetingstudies bij muizen. De eerste stap van het protocol is de zuivering van het antilichaam uit het supernatant van de NLDC (non-lymphoid dendrittic cells)-145 hybridoma door affiniteitschromatografie. Het gezuiverde antilichaam wordt geactiveerd voor chemische conjugatie door sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexaan-1-carboxylaat) terwijl tegelijkertijd de sulfhydryl-groepen van het OVA-eiwit worden blootgesteld door incubatie met TCEP-HCl (tris (2-carboxyethyl) fosfinehydrochloride). Overtollige TCEP-HCl en sulfo-SMCC worden verwijderd en het antigeen wordt gemengd met het geactiveerde antilichaam voor nachtelijke koppeling. Het resulterende αDEC-205/OVA-conjugaat is geconcentreerd en bevrijd van ongebonden OVA. Succesvolle conjugatie van OVA naar αDEC-205 wordt geverifieerd door western blot-analyse en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
We hebben met succes chemisch gekruist αDEC-205/OVA gebruikt om cytotoxische T-celresponsen in de lever te induceren en om verschillende adjuvantia te vergelijken op hun potentieel bij het induceren van humorale en cellulaire immuniteit na in vivo targeting van DEC-205+ DC. Daarnaast bieden dergelijke chemisch gekoppelde antilichaam / antigeenconjugaten waardevolle hulpmiddelen voor de efficiënte inductie van vaccinresponsen op tumorantigenen en is bewezen superieur te zijn aan klassieke immunisatiebenaderingen met betrekking tot de preventie en therapie van verschillende soorten tumoren.

Chemische conjugatie van αDEC-205 naar OVA-eiwit met behulp van dit protocol zal doorgaans een efficiënte generatie van αDEC-205/OVA mogelijk maken voor in vivo DC-targetingbenaderingen. Er zijn verschillende strategieën om de techniek zelf te verifiëren en de functionaliteit van het opbrengstconjugaat te testen. Western blot-analyse en ELISA worden gebruikt om succesvolle conjugatie te verifiëren en tegelijkertijd potentieel achtergebleven OVA te detecteren<strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

We beschrijven een protocol voor de chemische conjugatie van het modelantigeen ovalbumine naar een endocytosereceptorspecifiek antilichaam voor in vivo dendritische celtargeting. Het protocol omvat zuivering van het antilichaam, chemische conjugatie van het antigeen, evenals zuivering van het conjugaat en de verificatie van efficiënte conjugatie.

Chemische conjugatie van een gezuiverd DEC-205-gericht antilichaam met eiwit over de volledige lengte voor het richten van dendritische cellen van muizen in vitro en in vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

Dit protocol waarvoor alle experimentele condities zorgvuldig zijn geoptimaliseerd, kan worden gebruikt om een succesvolle en efficiënte chemische conjugatie van het DEC-205-antilichaam tegen OVA-antigeen te vergemakkelijken. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het een flexibele selectie van het eiwitantigeen en antilichaam mogelijk maakt en dat het niet afhankelijk is van genetische fusie van deze componenten. We hebben dit protocol ook gebruikt om conjugaten van hepatitis C-viruseiwitten en anti-DEC-205 te genereren voor in vivo DC-targeting.Dit kan ook waardevol zijn voor anti-tumor vaccinatie benaderingen. Om de anti-DEC-205-productie te starten, resuspendeert u een volume van één tot vijf miljoen ontdooide cryo-geconserveerde NLDC 145-cellen in negen milliliter isf-1-medium van 37 graden Celsius aangevuld met 1% penicilline en streptomycine, en zaait u de cellen in een celkweekkolf van 25 vierkante centimeter voor incubatie bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 24 tot 48 uur. Wanneer de cellen 70% confluentie bereiken, breng dan de hele celsuspensie over in een conische buis van 15 milliliter en verzamel de cellen door centrifugering.Resuspend de pellet in 12 milliliter vers compleet 37 graden ISF-1 medium en verdeel de cellen opnieuw in een kolf van 75 vierkante centimeter. Verdeel na 48 tot 72 uur cultuur de 70% confluentcultuur over elk van de twee nieuwe kolven van 75 vierkante centimeter en voeg zes milliliter vers compleet ISF-1-medium toe aan elke kolf. Wanneer de culturen 70% confluïteit bereiken, gebruikt u een pipet van 10 milliliter om de bodems en kweekoppervlakken van de celkweek te spoelen met de celsuspensie om alle cellen te verzamelen en 10 milliliter van elke uitgebreide NLDC 145-celsuspensie over te brengen in individuele PETG-rolflessen.Voeg vervolgens 140 milliliter compleet ISF-1 medium toe aan elke rolflescultuur en kweek de rolflessen op 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide en 25 rondes per minuut gedurende drie dagen. Voor antilichaamzuivering uit het NLDC 145 supernatant plaats je het uiteinde van een siliciumbuis in het met supernatant gevulde bekerglas en laat je 800 milliliter supernatant druppelsgewijs door een Eiwit G Sepharose kolom lopen. Voeg voor de elutie 100 microliter van 1,5 molaire Tris-HCL toe aan elk van de twintig buizen van 1,5 milliliter en verwijder de rubberen plug uit de kolom.Breng één milliliter 0,1 molaire glycine over naar de bovenste kamer van de kolom en verzamel het antilichaam dat eluent bevat in een van de voorbereide 1,5 milliliterbuizen en herhaal dit voor elke buis. Wanneer al het antilichaam is verzameld en de antilichaambevattende ellutions zijn samengevoegd, sluit u de bodem van een dialysebuis van 20 centimeter lengte met een geschikte dialyseslangsluiting en pipetteert u de antilichaamelutie zorgvuldig in de buis. Sluit de bovenkant van de dialysebuis met een tweede klem en bevestig de bovenste klem van de dialysebuis op een zwevende standaard.Voeg een magneetroerstaaf toe aan een beker PBS en plaats het bekerglas op een magneetroerder. Na nachtelijke dialyse bij vier graden Celsius, open één klem om het volledige dialysaat te kunnen laden naar een centrifugaalconcentrator met een 10 kiloDalton moleculaire gewichtsafsnijding en centrifugeer de concentrator gedurende 30 minuten bij 693 keer G en vier graden Celsius. Aan het einde van de spin laadt u de centrifugaalconcentrator met 10 milliliter PBS voor een tweede centrifugatie totdat een laatste tot 1,5 milliliter volume antilichaamoplossing is verkregen.Om OVA te conjugeren aan het anti-DEC-205-antilichaam, voegt u 200 microliter PBS aangevuld met 500 microgram OVA-eiwit, 240 microliter van een vers bereide TCEP-HCL-oplossing en 560 microliter steriel ultrapuur water toe aan een buis van 1,5 milliliter voor een incubatie van 1,5 uur bij kamertemperatuur. Voeg tegelijkertijd 2,5 milligram anti-DEC-205 toe in 900 microliter PBS en 100 microliter vers bereide sulfo-SMCC aan een tweede buis van 1,5 milliliter voor een incubatie van 30 minuten bij 37 graden Celsius bij 550 omwentelingen per minuut in een verwarmingsblok. Plaats aan het einde van de incubaties ontzoutingskolommen met losgemaakte doppen en gedraaide bodems in individuele conische buizen van 15 milliliter en centrifugeer de kolommen om de vloeistof te verwijderen.Plaats na het centrifugeren de kolommen in nieuwe buizen met de doppen verwijderd en laad de antilichaam sulfo-SMCC en OVA TCEP-HCL-oplossingen langzaam naar het midden van het compacte harsbed van één kolom per oplossing. Gooi na het centrifugeren de kolommen weg en meng onmiddellijk het antilichaam en de OVA-oplossingen met zacht pipetteren. Laad de anti-DEC-205/OVA-oplossing op een centrifugale eiwitconcentrator en vul de concentrator met PBS tot een volume van 15 milliliter.Centrifugeer de concentrator gedurende vijf minuten bij 2.000 maal G en kamertemperatuur en vul de concentrator met nog eens 10 milliliter PBS. Nadat u de concentratie gedurende ten minste acht minuten onder dezelfde centrifugeomstandigheden hebt gecentrifugeerd, verzamelt u het geconcentreerde monster voorzichtig uit de bovenste kamer. Om het succes van de conjugatie door Western blot-analyse te verifiëren, laadt u een aliquot uit elk monster op een eiwitstandaard op een SDS-gel en voert u de gel uit volgens standaard SDS-PAGE-analyseprotocollen.Na gel blotting, kleur de membranen met mierikswortelperoxidase geconjugeerde antilichamen om anti-DEC-205 of OVA te detecteren volgens standaardprotocollen. De membranen kunnen vervolgens worden geanalyseerd op de aanwezigheid van het respectieve eiwit in elk monster. Om het succes van de conjugatie door ELISA te verifiëren, coat u een geschikte 96-well ELISA-plaat met 100 microliter van het anti-OVA-antilichaam per put en serieel verdunde anti-DEC-205 / OVA in een verhouding van één tot twee en blokkerende buffer om verdunningen te verkrijgen van zes microgram per milliliter tot 93,8 nanogram per milliliter.Voeg 100 microliter van elke verdunning toe aan de juiste putjes van de met antilichamen bedekte plaat gedurende een incubatietijd van één uur bij kamertemperatuur. Voeg aan het einde van de incubatie 100 microliter mierikswortelperoxidase geconjugeerd antilichaam tegen het anti-DEC-205 / OVA-conjugaat toe aan de plaat gedurende een incubatie van een uur bij kamertemperatuur en voeg vervolgens 50 microliter mierikswortelperoxidasesubstraat toe aan elke put om analyse van de kleurreactie door spectrofotometrie mogelijk te maken. Parallelle Western blot-analyse kan worden gebruikt om zowel geconjugeerde OVA als geconjugeerde anti-DEC-205 te detecteren.Kleuring voor OVA zou de detectie van overtollige vrije OVA mogelijk maken indien aanwezig, en kleuring voor anti-DEC-205 verifieert het succes van de conjugatie door een toename van het molecuulgewicht tussen naakte anti-DEC-205 en het geconjugeerde. ELISA kan ook worden gebruikt om het succes van de conjugatie te beoordelen met een positieve associatie tussen het gedetecteerde signaal en de geanalyseerde hoeveelheid eiwit die wijst op de succesvolle generatie van anti-DEC-205 / OVA-conjugant. Flowcytometrie en immunofluorescentieanalyse tonen duidelijk aan dat de anti-DEC-205-kern efficiënt beenmerg-afgeleide CD11c-positieve cellen bindt.Vaccinatie met anti-DEC-205/OVA in combinatie met adjuvans induceert een toename van OVA-specifieke IgG-titers bij muizenontvangers in vergelijking met vaccinatie met OVA en adjuvans alleen. Bovendien induceert anti-DEC-205/OVA efficiënt over-specifieke CD4- en CD8-positieve T-celresponsen met de anti-DEC-205/OVA-geïnduceerde CD8-positieve T-celresponsen die significant groter zijn dan die geïnduceerd door OVA alleen. Voor een succesvolle conjugatie van OVA-antigeen tot anti-DEC-205-antilichaam is het belangrijk om de materialen voor te bereiden zoals aangetoond en de conjugatiestappen onder consistente omstandigheden uit te voeren.Na succesvolle conjugatie van het antigeen en het antilichaam zijn tal van daaropvolgende benaderingen mogelijk, waaronder bindende analyse en de inductie van pathogene of tumorgerelateerde immuniteit in vivo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

In Vitro Imaging en kwantificering van de Drug Targeting Efficiency van fluorescent gelabelde GnRH analogen

GnRH analogues are effective targeting moieties and able to deliver anticancer agents selectively into malignant tumor cells which highly express GnRH ...

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Tot oprichting van dubbele weerstand tegen EGFR-TKI en ONTMOETTE-TKI in Lung adenocarcinoom cellen In Vitro met een 2-step dosis-escalatie-Procedure

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Tellen van eiwitten in afzonderlijke cellen met adresseerbare Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Verplaatsen naar boven: Een eenvoudig en flexibel In Vitro driedimensionale invasie Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR beoordeling van pH, pO2, Redox Status, en concentraties van fosfaat en glutathion in de communicatie van de Tumor

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Protocol van de isolatie van muis monocyt-afgeleide dendritische cellen en hun latere In Vitro activatie met Tumor immuuncomplexen

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

Een GPC3-targeting bispecifieke antilichaam, GPC3-S-Fab, met krachtige cytotoxiciteit

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Verrijking van de Phosphopeptide in combinatie met kwantitatieve Label-vrije Spectrometrie van de massa te onderzoeken van de Phosphoproteome in prostaatkanker

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

In vivo immunofluorescentie lokalisatie voor de beoordeling van therapeutische en diagnostische antilichamen Biodistribution in kankeronderzoek

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...