Name: chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo
Uploaded: 2021-02-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Les auteurs remercient S. Prettin pour son assistance technique experte. Ce travail a été soutenu par une subvention de l’Association Helmholtz des centres de recherche allemands (HGF) qui a été fournie dans le cadre de l’Alliance Helmholtz ''Immunothérapie des cancers'' (HCC_WP2b).

Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été approuvées par l’agence gouvernementale locale (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; numéro de dossier 33.12-42502-04-10/0108) et ont été réalisées conformément aux directives nationales et institutionnelles.
1. Production d’αDEC-205 à partir de la lignée cellulaire d’hybridome NLDC-145
<ol><li>Pour la production d’anticorps, décongeler des cellules NLDC-145 cryoconservé...

<ol>
	<li>Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+complete+repertoire+of+conventional+dendritic+cell+functions+for+cancer+immunotherapy.">Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy.</a> Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Wculek, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+cancer+immunology+and+immunotherapy.">Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy.</a> Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).</li><li>Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell-targeted+vaccines--hope+or+hype.">Dendritic cell-targeted vaccines--hope or hype.</a> Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).</li><li>Bonifaz, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+targeting+of+antigens+to+maturing+dendritic+cells+via+the+DEC-205+receptor+improves+T+cell+vaccination.">In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination.</a> Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).</li><li>Boscardin, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+targeting+to+dendritic+cells+elicits+long-lived+T+cell+help+for+antibody+responses.">Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses.</a> Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).</li><li>Hossain, M. K., Wall, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Dendritic+Cell+Receptors+as+Targets+for+Enhancing+Anti-Cancer+Immune+Responses.">Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses.</a> Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).</li><li>Johnson, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+melanoma+growth+by+targeting+of+antigen+to+dendritic+cells+via+an+anti-DEC-205+single-chain+fragment+variable+molecule.">Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule.</a> Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).</li><li>Trumpfheller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbial+mimic+poly+IC+induces+durable+and+protective+CD4++T+cell+immunity+together+with+a+dendritic+cell+targeted+vaccine.">The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).</li><li>Idoyaga, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparable+T+helper+1+(Th1)+and+CD8+T-cell+immunity+by+targeting+HIV+gag+p24+to+CD8+dendritic+cells+within+antibodies+to+Langerin,+DEC205,+and+Clec9A.">Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).</li><li>Sancho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+therapy+in+mice+via+antigen+targeting+to+a+novel,+DC-restricted+C-type+lectin.">Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+antigen+delivery+to+dendritic+cells+elicits+robust+antiviral+T+cell-mediated+immunity+in+the+liver.">Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver.</a> Scientific Reports. 7, 43985 (2017).</li><li>Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans'+cells,+veiled+cells,+and+interdigitating+cells+in+the+mouse+recognized+by+a+monoclonal+antibody.">Langerhans' cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STING+activator+c-di-AMP+exerts+superior+adjuvant+properties+than+the+formulation+poly(I:C)/CpG+after+subcutaneous+vaccination+with+soluble+protein+antigen+or+DEC-205-mediated+antigen+targeting+to+dendritic+cells.">The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells.</a> Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).</li></ol>

La conjugaison chimique d’un anticorps spécifique au récepteur de l’endocytose et d’un antigène protéique fournit une approche efficace et, surtout, flexible pour le ciblage in vivo dc dans des modèles murins précliniques. Avec notre protocole, nous fournissons une approche efficace pour la conjugaison réussie de l’antigène modèle OVA à un anticorps IgG spécifique DEC-205.
Dans notre protocole, αDEC-205 est purifié à partir d’une lignée cellulaire d’hybridom...

Les cellules dendritiques (DC) sont des acteurs centraux du système immunitaire. Il s’agit d’un groupe diversifié de cellules spécialisées dans la présentation de l’antigène et leur fonction principale est de combler l’immunité innée et adaptative1,2. Il est important de noter que les DC jouent non seulement un rôle important dans les réponses efficaces et spécifiques dirigées par les agents pathogènes, mais sont également impliqués dans de nombreux aspects de l’immunité antitumorale1,3.
En raison de leur rôle exclusif dans l’immunité de l’hôte, DC est devenu une cible de la vaccination4. Une approche consiste à cibler les antigènes à DC in vivo pour induire des réponses immunitaires spécifiques à l’antigène et au cours des dernières années, un grand nombre d’études ont été consacrées à la définition de récepteurs appropriés et à des stratégies de ciblage1,4. Un exemple est le récepteur de lectine de type C DEC-205, qui peut être ciblé par des anticorps spécifiques au DEC-205 pour induire une endocytose. Il est important de noter qu’il a été démontré que le ciblage DEC-205 en association avec des adjuvants appropriés induit efficacement des lymphocytes T CD4+ et CD8+ protecteurs à longue durée de vie et protecteurs, ainsi que des réponses d’anticorps, également contre les antigènes tumoraux3,5,6,7,8,9.
Il existe un certain nombre d’études montrant que les antigènes conjugués ciblés par DC sont supérieurs à l’antigène libre non conjugué3,5,10,11,12. Cela fait de la conjugaison de l’antigène à la fraction de ciblage DC respective une étape centrale dans les approches de ciblage DC. Dans le cas du ciblage DC via des anticorps ou des fragments d’anticorps, les antigènes peuvent être chimiquement ou génétiquement liés et l’une ou l’autre stratégie fournit ses propres (dés)avantages1. D’une part, dans les constructions anticorps-antigènes génétiquement modifiées, il existe un contrôle de la dose d’antigène ainsi que de l’emplacement offrant une comparabilité supérieure entre les lots1. Dans le même temps, cependant, la conjugaison chimique nécessite moins de préparation et offre plus de flexibilité, en particulier lorsqu’il s’agit de tester et de comparer différents antigènes et / ou stratégies de vaccination dans des modèles expérimentaux et précliniques.
Nous présentons ici un protocole pour la conjugaison chimique efficace et fiable de l’ovalbumine (OVA) en tant qu’antigène protéique modèle à un anticorps IgG2a spécifique dec-205 (αDEC-205) adapté au ciblage DC in vivo chez la souris. Tout d’abord, l’αDEC-205 est purifié à partir de cellules d’hybridome NLDC-14513. Pour la conjugaison chimique, le réticulant hétérobifonctionnel sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC), qui contient des groupes ester NHS (N-hydroxysuccinimide) et maléimide, est utilisé, permettant la conjugaison covalente des molécules contenant des amines et des sulfhydryles. Plus précisément, les amines primaires de l’anticorps réagissent initialement avec le sulfo-SMCC et l’αDEC-205 activé par le maléimide qui en résulte réagit ensuite avec la protéine OVA contenant du sulfhydryle réduite par TCEP-HCl (chlorhydrate de phosphine de tris(2-carboxyéthyle)). Le produit final est chimiquement conjugué αDEC-205/OVA (Figure 1). Au-delà de la conjugaison chimique elle-même, notre protocole décrit l’élimination de l’excès d’OVA du conjugué ainsi que la vérification de la conjugaison réussie par une analyse par transfert western et un test immuno-enzymatique spécifique. Nous avons utilisé avec succès cette approche dans le passé pour conjuguer chimiquement l’OVA et d’autres protéines ou peptides immunogènes en αDEC-205. Nous démontrons une liaison efficace aux cellules CD11c+ in vitro ainsi que l’induction efficace de l’immunité cellulaire et humorale in vivo.
Certes, il y a des inconvénients à cette méthode, comme dans la comparabilité de lot à lot et dans le dosage exact de l’antigène dans le conjugué final. Néanmoins, la conjugaison chimique offre une flexibilité expérimentale dans le choix de l’anticorps et de l’antigène protéique par rapport aux constructions génétiquement modifiées. Par conséquent, nous pensons que cette approche est particulièrement utile pour évaluer différents antigènes pour leur efficacité dans le ciblage DC dans des modèles murins précliniques, et surtout dans le contexte de réponses immunitaires antitumorales spécifiques.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibody buffer 2 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody buffer 5 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % FBS in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 4 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 10 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T25</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>690175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T75</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR&#160; filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T175</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>661175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal concentrator MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2001</td>
			<td>Vivaspin 20 centrifugal concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88532</td>
			<td>Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>525-2314</td>
			<td>PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coating buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desalting columns MWCO 7 kDa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89891</td>
			<td>Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent ELISA (HRPO substrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>T8665-100ML</td>
			<td>3,3&#8242;,5,5&#8242;-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent western blot (HRPO substrate)</td>
			<td>Roche/Merck</td>
			<td>12 015 200 01</td>
			<td>Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa</td>
			<td>SERVA Electrophoresis</td>
			<td>44110</td>
			<td>Visking dialysis tubing, 16 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA 96-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td>MaxiSorp Nunc-Immuno Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum</td>
			<td>PAN-BIOtech</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>FBS Good forte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISF-1 medium</td>
			<td>Biochrom/bioswisstec</td>
			<td>F 9061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145.2</td>
			<td>powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLDC-145 hybridoma</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-290</td>
			<td>if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-reducing SDS sample buffer 4 x&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 &#181;l 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 &#181;l of 5 % Bromphenol Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ovalbumin</td>
			<td>Hyglos (via BioVendor)</td>
			<td>321000</td>
			<td>EndoGrade OVA ultrapure with &#60;0.1 EU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles</td>
			<td>Nunc In Vitro</td>
			<td>734-2394</td>
			<td>standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm&#178;, 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109535</td>
			<td>pH indicator strips 0-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG(H+L)-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-062</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG+IgM-HRPO antibody&#160; (ELISA)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-068</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rabbit-IgG-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>111-035-045&#160;</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA (ELISA)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181688</td>
			<td>used at 3 ng/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA antibody (western blot)</td>
			<td>OriGene</td>
			<td>R1101</td>
			<td>used at 1:3,000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose column</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>P3296</td>
			<td>5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td>PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber plug</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5230217</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN rubber stoppers (lower &#934; 17 mm; upper &#934; 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone tube</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5430925</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN (inside &#934; 1 mm; outer &#934; 3 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim-Fast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopping solution (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M H2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22322</td>
			<td>Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter unit 0.22 &#181;m&#160;</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe 10 ml</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Disposable syringes Injekt&#174; Solo B.Braun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican&#174; cannulas</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td></td>
			<td>Sterican&#174; G 20 x 1 1/2&#34;&#34;; 0.90 x 40 mm; yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A35349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing connector</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo

L’administration ciblée d’antigènes aux cellules dendritiques (DC) à présentation croisée in vivo induit efficacement des réponses aux cellules effectrices T et présente une approche précieuse dans la conception de vaccins. L’antigène est délivré à DC via des anticorps spécifiques aux récepteurs de l’endocytose tels que DEC-205 qui induisent l’absorption, le traitement et la présentation du CMH de classe I et II.
La conjugaison efficace et fiable de l’antigène souhaité à un anticorps approprié est une étape critique dans le ciblage DC et, entre autres facteurs, dépend du format de l’antigène. La conjugaison chimique de protéines pleine longueur en anticorps purifiés est une stratégie possible. Dans le passé, nous avons réussi à établir une réticulation de l’antigène modèle ovalbumine (OVA) et d’un anticorps IgG2a spécifique dec-205 (αDEC-205) pour des études in vivo de ciblage DC chez la souris. La première étape du protocole est la purification de l’anticorps du surnageant de l’hybridome NLDC (cellules dendritiques non lymphoïdes)-145 par chromatographie d’affinité. L’anticorps purifié est activé pour la conjugaison chimique par sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate) tandis que dans le même temps les groupes sulfhydryle de la protéine OVA sont exposés par incubation avec TCEP-HCl (chlorhydrate de phosphine tris (2-carboxyéthyle)). L’excès de TCEP-HCl et de sulfo-SMCC est éliminé et l’antigène est mélangé à l’anticorps activé pour un couplage de nuit. Le conjugué αDEC-205/OVA qui en résulte est concentré et libéré des OVJ non liés. La conjugaison réussie de l’OVA à l’αDEC-205 est vérifiée par l’analyse par transfert western et le test immuno-enzymatique (ELISA).
Nous avons utilisé avec succès l’αDEC-205/OVA réticulé chimiquement pour induire des réponses cytotoxiques des lymphocytes T dans le foie et pour comparer différents adjuvants pour leur potentiel à induire une immunité humorale et cellulaire après un ciblage in vivo de DEC-205+ DC. Au-delà de cela, ces conjugués anticorps/antigènes couplés chimiquement offrent des outils précieux pour l’induction efficace des réponses vaccinales aux antigènes tumoraux et se sont avérés supérieurs aux approches d’immunisation classiques concernant la prévention et le traitement de divers types de tumeurs.

La conjugaison chimique de la protéine αDEC-205 à la protéine OVA à l’aide de ce protocole permettra généralement la génération efficace d’αDEC-205/OVA pour les approches de ciblage DC in vivo. Il existe différentes stratégies pour vérifier la technique elle-même et pour tester la fonctionnalité du conjugué donné. L’analyse par transfert Western et ELISA sont utilisés pour vérifier la conjugaison réussie et en même temps détecter les OVA potentiellemen...

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Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Nous décrivons un protocole pour la conjugaison chimique de l’antigène modèle ovalbumine à un anticorps spécifique au récepteur de l’endocytose pour le ciblage in vivo des cellules dendritiques. Le protocole comprend la purification de l’anticorps, la conjugaison chimique de l’antigène, ainsi que la purification du conjugué et la vérification de la conjugaison efficace.

Conjugaison chimique d’un anticorps purifié dirigé vers DEC-205 avec une protéine pleine longueur pour cibler les cellules dendritiques de souris in vitro et in vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

Ce protocole pour lequel toutes les conditions expérimentales ont été soigneusement optimisées peut être utilisé pour faciliter une conjugaison chimique réussie et efficace de l’anticorps DEC-205 à l’antigène OVA. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle permet une sélection flexible de l’antigène protéique et de l’anticorps, et qu’elle ne repose pas sur la fusion génétique de ces composants. Nous avons également utilisé ce protocole pour générer des conjugués de protéines du virus de l’hépatite C et d’anti-DEC-205 pour le ciblage IN VIVO DC.Cela pourrait également être utile pour les approches de vaccination anti-tumorale. Pour commencer la production anti-DEC-205, resusciter un volume d’un millilitre d’un à cinq millions de cellules NLDC 145 cryoconservées décongelées dans neuf millilitres de milieu ISF-1 de 37 degrés Celsius complété par 1% de pénicilline et de streptomycine, et ensemencer les cellules dans une fiole de culture cellulaire de 25 centimètres carrés pour une incubation à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 24 à 48 heures. Lorsque les cellules atteignent 70% de confluence, transférez toute la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 millilitres et collectez les cellules par centrifugation.Remettez en suspension la pastille dans 12 millilitres de milieu ISF-1 frais complet de 37 degrés et recollez les cellules dans une fiole de 75 centimètres carrés. Après 48 à 72 heures de culture, divisez la culture confluente à 70% entre chacune des deux nouvelles fioles de 75 centimètres carrés et ajoutez six millilitres de milieu ISF-1 frais complet à chaque flacon. Lorsque les cultures atteignent 70 % de confluence, utilisez une pipette de 10 millilitres pour rincer le fond de la fiole de culture cellulaire et les surfaces de culture avec la suspension cellulaire afin de recueillir toutes les cellules et de transférer 10 millilitres de chaque suspension cellulaire NLDC 145 expansée dans des bouteilles à rouleaux PETG individuelles.Ajoutez ensuite 140 millilitres de milieu ISF-1 complet à chaque culture de bouteille à rouleaux et cultivez les bouteilles à rouleaux à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone et 25 tours par minute pendant trois jours. Pour la purification des anticorps du surnageant NLDC 145, placez l’extrémité d’un tube de silicium dans le bécher rempli de surnageants et laissez 800 millilitres de surnageant circuler goutte à goutte à travers une colonne de sépharose de protéine G. Pour l’élution, ajoutez 100 microlitres de Tris-HCL de 1,5 molaire dans chacun des vingt tubes de 1,5 millilitre et retirez le bouchon en caoutchouc de la colonne.Transférer un millilitre de glycine molaire 0,1 dans la chambre supérieure de la colonne et recueillir l’éluant contenant l’anticorps dans l’un des tubes de 1,5 millilitre préparés et répéter pour chaque tube. Lorsque tous les anticorps ont été collectés et que les élutions contenant des anticorps ont été regroupées, fermez le fond d’un tube de dialyse de 20 centimètres de long avec une fermeture de tube de dialyse appropriée et pipetez soigneusement l’élution d’anticorps dans le tube. Fermez le haut du tube de dialyse avec une deuxième pince et fixez la pince supérieure du tube de dialyse à un support flottant.Ajouter une barre d’agitation magnétique à un bécher de PBS et placer le bécher sur un agitateur magnétique. Après une dialyse de nuit à quatre degrés Celsius, ouvrez une pince pour permettre le chargement du dialysat complet dans un concentrateur centrifuge avec une coupure de poids moléculaire de 10 kilodatons, et centrifugez le concentrateur pendant 30 minutes à 693 fois G et quatre degrés Celsius. À la fin du spin, chargez le concentrateur centrifuge de 10 millilitres de PBS pour une deuxième centrifugation jusqu’à l’obtention d’un volume final à 1,5 millilitre de solution d’anticorps.Pour conjuguer l’OVA à l’anticorps anti-DEC-205, ajoutez 200 microlitres de PBS complétés par 500 microgrammes de protéine OVA, 240 microlitres d’une solution de TCEP-HCL fraîchement préparée et 560 microlitres d’eau ultrapure stérile dans un tube de 1,5 millilitre pour une incubation de 1,5 heure à température ambiante. Dans le même temps, ajoutez 2,5 milligrammes d’anti-DEC-205 dans 900 microlitres de PBS et 100 microlitres de sulfo-SMCC fraîchement préparés dans un deuxième tube de 1,5 millilitre pour une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius à 550 tours par minute dans un bloc chauffant. À la fin des incubations, placez les colonnes de dessalement avec des bouchons desserrés et des fonds tordus dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres et centrifugez les colonnes pour éliminer le liquide.Après centrifugation, placez les colonnes dans de nouveaux tubes avec les bouchons enlevés et chargez lentement les solutions d’anticorps sulfo-SMCC et OVA TCEP-HCL au centre du lit de résine compact d’une colonne par solution. Après la centrifugation, jeter les colonnes et mélanger immédiatement les solutions d’anticorps et d’OVA avec un pipetage doux. Chargez la solution anti-DEC-205/OVA sur un concentrateur de protéines centrifuges et remplissez le concentrateur de PBS jusqu’à un volume de 15 millilitres.Centrifugez le concentrateur pendant cinq minutes à 2 000 fois G et à température ambiante et remplissez le concentrateur avec 10 millilitres supplémentaires de PBS. Après avoir centrifugé la concentration pendant au moins huit minutes dans les mêmes conditions de centrifugeuse, prélever doucement l’échantillon concentré dans la chambre supérieure. Pour vérifier le succès de la conjugaison par analyse par transfert Western, chargez une aliquote de chaque échantillon sur un étalon de protéine sur un gel SDS et exécutez le gel selon les protocoles d’analyse SDS-PAGE standard.Après le buvard de gel, colorez les membranes avec des anticorps conjugués à la peroxydase de raifort pour détecter l’anti-DEC-205 ou OVA selon les protocoles standard. Les membranes peuvent ensuite être analysées pour la présence de la protéine respective dans chaque échantillon. Pour vérifier le succès de la conjugaison par ELISA, enduisez une plaque ELISA appropriée de 96 puits avec 100 microlitres de l’anticorps anti-OVA par puits et diluez en série l’anti-DEC-205/OVA à un rapport de un à deux et bloquez le tampon pour obtenir des dilutions de six microgrammes par millilitre à 93,8 nanogrammes par millilitre.Ajouter 100 microlitres de chaque dilution aux puits appropriés de la plaque recouverte d’anticorps pour une incubation d’une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation, ajouter 100 microlitres d’anticorps conjugués peroxydase de raifort contre le conjugué anti-DEC-205/OVA à la plaque pour une incubation d’une heure à température ambiante, puis ajouter 50 microlitres de substrat de peroxydase de raifort à chaque puits pour permettre l’analyse de la réaction de couleur par spectrophotométrie. L’analyse parallèle par transfert Western peut être utilisée pour détecter à la fois les OVA conjugués et les anti-DEC-205 conjugués.La coloration pour OVA permettrait la détection d’un excès d’OVA libre s’il est présent, et la coloration pour anti-DEC-205 vérifie le succès de la conjugaison par une augmentation du poids moléculaire entre l’anti-DEC-205 nu et le conjugué. ELISA peut également être utilisé pour évaluer le succès de la conjugaison avec une association positive entre le signal détecté et la quantité analysée de protéine indiquant la génération réussie d’un conjugué anti-DEC-205/OVA. La cytométrie en flux et l’analyse par immunofluorescence montrent clairement que le noyau anti-DEC-205 lie efficacement les cellules CD11c positives dérivées de la moelle osseuse.La vaccination avec anti-DEC-205/OVA en conjonction avec un adjuvant induit une augmentation des titres d’IgG spécifiques à l’OVA chez les receveurs de souris par rapport à la vaccination avec OVA et adjuvant seul. De plus, l’anti-DEC-205/OVA induit efficacement des réponses surspécifiques des lymphocytes T CD4 et CD8 positifs avec les réponses des lymphocytes T CD8 positifs induites par l’anti-DEC-205/OVA dépassant de manière significative celles induites par l’OVA seul. Pour une conjugaison réussie de l’antigène OVA à l’anticorps anti-DEC-205, il est important de préparer les matériaux comme démontré et d’effectuer les étapes de conjugaison dans des conditions cohérentes.Après une conjugaison réussie de l’antigène et de l’anticorps, de nombreuses approches ultérieures sont possibles, y compris l’analyse de liaison et l’induction d’une immunité pathogène ou liée à la tumeur in vivo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

In Vitro Imaging et la quantification de l&#39;efficacité de ciblage des médicaments d&#39;Analogues GnRH marqué par fluorescence

GnRH analogues are effective targeting moieties and able to deliver anticancer agents selectively into malignant tumor cells which highly express GnRH ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

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Établissant double résistance à l’EGFR-TKI et rencontré-TKI dans le poumon adénocarcinome cellules In Vitro avec une procédure d’augmentation de la Dose 2-step

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Comptage des protéines dans des cellules individuelles avec gouttelettes adressable Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

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Déplacement vers le haut : Un Simple et Flexible In Vitro Invasion en trois dimensions Assay protocole

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

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In Vivo Évaluation des EPR du pH, pO2, statut Redox et les Concentrations de Phosphate et de glutathion dans le microenvironnement tumoral

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

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Protocole d’isolement de cellules dendritiques macrophages dérivés de monocytes de souris et leur Activation ultérieure In Vitro avec tumeur Complexes immuns

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

Un ciblage GPC3 anticorps bispécifiques, GPC3-S-Fab, avec puissante cytotoxicité

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Enrichissement phosphopeptide couplée à la spectrométrie masse Quantitative exempte d’étiquette d’enquêter sur le Phosphoproteome dans le Cancer de la Prostate

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

In Vivo Immunofluorescence Localisation pour l'évaluation de la biodistribution thérapeutique et diagnostique des anticorps dans la recherche sur le cancer

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

In Vivo Ciblage des cellules cancéreuses humaines xénograftées avec des nanoparticules de silice fluorescente fonctionnelles chez le poisson zèbre

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...