Name: chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo
Uploaded: 2021-02-05T14:00:00
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Die Autoren danken S. Prettin für die fachkundige technische Unterstützung. Unterstützt wurde diese Arbeit durch ein Stipendium der Helmholtz-Gemeinschaft Deutscher Forschungszentren (HGF), das im Rahmen der Helmholtz-Allianz "Immuntherapie von Krebserkrankungen" (HCC_WP2b) zur Verfügung gestellt wurde.

Alle beschriebenen Tierversuche wurden vom Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (Aktenzeichen 33.12-42502-04-10/0108) genehmigt und nach den nationalen und institutionellen Richtlinien durchgeführt.
1. Herstellung von αDEC-205 aus der Hybridom-Zelllinie NLDC-145
<ol><li>Für die Antikörperproduktion tauen kryokonservierte NLDC-145-Zellen, die αDEC-205 bei 37 °C produzieren, in einem Wasserbad auf. Erweitern Sie die Zellen bei 37 °C und 5% CO<su...

<ol>
	<li>Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+complete+repertoire+of+conventional+dendritic+cell+functions+for+cancer+immunotherapy.">Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy.</a> Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Wculek, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+cancer+immunology+and+immunotherapy.">Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy.</a> Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).</li><li>Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell-targeted+vaccines--hope+or+hype.">Dendritic cell-targeted vaccines--hope or hype.</a> Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).</li><li>Bonifaz, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+targeting+of+antigens+to+maturing+dendritic+cells+via+the+DEC-205+receptor+improves+T+cell+vaccination.">In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination.</a> Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).</li><li>Boscardin, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+targeting+to+dendritic+cells+elicits+long-lived+T+cell+help+for+antibody+responses.">Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses.</a> Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).</li><li>Hossain, M. K., Wall, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Dendritic+Cell+Receptors+as+Targets+for+Enhancing+Anti-Cancer+Immune+Responses.">Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses.</a> Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).</li><li>Johnson, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+melanoma+growth+by+targeting+of+antigen+to+dendritic+cells+via+an+anti-DEC-205+single-chain+fragment+variable+molecule.">Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule.</a> Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).</li><li>Trumpfheller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbial+mimic+poly+IC+induces+durable+and+protective+CD4++T+cell+immunity+together+with+a+dendritic+cell+targeted+vaccine.">The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).</li><li>Idoyaga, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparable+T+helper+1+(Th1)+and+CD8+T-cell+immunity+by+targeting+HIV+gag+p24+to+CD8+dendritic+cells+within+antibodies+to+Langerin,+DEC205,+and+Clec9A.">Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).</li><li>Sancho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+therapy+in+mice+via+antigen+targeting+to+a+novel,+DC-restricted+C-type+lectin.">Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+antigen+delivery+to+dendritic+cells+elicits+robust+antiviral+T+cell-mediated+immunity+in+the+liver.">Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver.</a> Scientific Reports. 7, 43985 (2017).</li><li>Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans'+cells,+veiled+cells,+and+interdigitating+cells+in+the+mouse+recognized+by+a+monoclonal+antibody.">Langerhans' cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STING+activator+c-di-AMP+exerts+superior+adjuvant+properties+than+the+formulation+poly(I:C)/CpG+after+subcutaneous+vaccination+with+soluble+protein+antigen+or+DEC-205-mediated+antigen+targeting+to+dendritic+cells.">The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells.</a> Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).</li></ol>

Die chemische Konjugation eines endozytoserezeptorspezifischen Antikörpers und eines Proteinantigens bietet einen effizienten und vor allem flexiblen Ansatz für das In-vivo-DC-Targeting in präklinischen Mausmodellen. Mit unserem Protokoll bieten wir einen effizienten Ansatz für die erfolgreiche Konjugation des Modellantigens OVA zu einem DEC-205-spezifischen IgG-Antikörper.
In unserem Protokoll wird αDEC-205 aus einer Hybridom-Zelllinie gereinigt und in der Vergangenheit haben w...

Dendritische Zellen (DC) sind zentrale Akteure des Immunsystems. Sie sind eine vielfältige Gruppe von Zellen, die auf die Antigenpräsentation spezialisiert sind, und ihre Hauptfunktion besteht darin, angeborene und adaptive Immunität zu überbrücken1,2. Wichtig ist, dass DC nicht nur eine wichtige Rolle bei effizienten und spezifischen pathogengesteuerten Reaktionen spielt, sondern auch an vielen Aspekten der Antitumorimmunität beteiligt ist1,3.
Aufgrund ihrer exklusiven Rolle bei der Wirtsimmunität rückte DC als Zielzellen für die Impfung in den Fokus4. Ein Ansatz besteht darin, Antigene in vivo auf DC auszurichten, um antigenspezifische Immunantworten zu induzieren, und in den letzten Jahren wurde eine große Anzahl von Studien der Definition geeigneter Rezeptoren und Targeting-Strategien gewidmet1,4. Ein Beispiel ist der C-Typ-Lektinrezeptor DEC-205, der durch DEC-205-spezifische Antikörper gezielt endozytose induziert werden kann. Wichtig ist, dass DEC-205-Targeting in Kombination mit geeigneten Adjuvantien nachweislich langlebige und schützende CD4+ und CD8+ T-Zellen sowie Antikörperreaktionen auch gegen die Tumorantigene 3,5,6,7,8,9wirksam induziert.
Es gibt eine Reihe von Studien, die zeigen, dass konjugierte Antigene, die auf DC abzielen, dem freien unkonjugierten Antigen3,5,10,11,12überlegen sind. Dies macht die Konjugation des Antigens zur jeweiligen DC-Zieleinheit zu einem zentralen Schritt in DC-Targeting-Ansätzen. Im Falle des DC-Targetings über Antikörper oder Antikörperfragmente können Antigene entweder chemisch oder genetisch verknüpft sein, und jede Strategie bietet ihre eigenen (Dis-)Vorteile1. Auf der einen Seite gibt es in gentechnisch veränderten Antikörper-Antigen-Konstrukten eine Kontrolle über die Antigendosis sowie den Ort, der eine überlegene Vergleichbarkeit zwischen den Losen1 ermöglicht. Gleichzeitig benötigt die chemische Konjugation jedoch weniger Vorbereitung und bietet mehr Flexibilität, insbesondere wenn versucht wird, verschiedene Antigene und / oder Impfstrategien in experimentellen und präklinischen Modellen zu testen und zu vergleichen.
Hier stellen wir ein Protokoll für die effiziente und zuverlässige chemische Konjugation von Ovalbumin (OVA) als Modellproteinantigen zu einem DEC-205-spezifischen IgG2a-Antikörper (αDEC-205) vor, der für das in vivo DC-Targeting in Mäusen geeignet ist. Zunächst wird αDEC-205 aus NLDC-145-Hybridomzellen13gereinigt. Zur chemischen Konjugation wird der heterobifunktionelle Vernetzer Sulfosuccinimidyl-4-[N-Maleimidomethyl]-cyclohexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC) verwendet, der NHS (N-Hydroxysuccinimid)-Ester- und Maleimidgruppen enthält, was eine kovalente Konjugation von amin- und Sulfhydryl-haltigen Molekülen ermöglicht. Insbesondere reagieren die primären Amine des Antikörpers zunächst mit Sulfo-SMCC und das resultierende Maleimid-aktivierte αDEC-205 reagiert dann mit dem durch TCEP-HCl (Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid) reduzierten Sulfhydryl-haltigen OVA-Protein. Das Endprodukt ist chemisch konjugiert αDEC-205/OVA (Abbildung 1). Über die chemische Konjugation selbst hinaus beschreibt unser Protokoll die Entfernung überschüssiger OVA aus dem Konjugat sowie die Überprüfung der erfolgreichen Konjugation durch Western-Blot-Analyse und einen spezifischen enzymgebundenen Immunosorbent-Assay. Wir haben diesen Ansatz in der Vergangenheit erfolgreich eingesetzt, um OVA und andere Proteine oder immunogene Peptide chemisch an αDEC-205 zu konjugieren. Wir demonstrieren eine effiziente Bindung an CD11c+ -Zellen in vitro sowie die effiziente Induktion der zellulären und humoralen Immunität in vivo.
Sicherlich gibt es Nachteile dieser Methode, wie z.B. in der Parierbarkeit von Charge zu Charge und bei der genauen Dosierung des Antigens innerhalb des endgültigen Konjugats. Dennoch bietet die chemische Konjugation experimentelle Flexibilität bei der Wahl des Antikörpers und des Proteinantigens im Vergleich zu gentechnisch veränderten Konstrukten. Daher glauben wir, dass dieser Ansatz besonders wertvoll ist, um verschiedene Antigene auf ihre Effizienz beim DC-Targeting in präklinischen Mausmodellen zu bewerten, vor allem auch im Zusammenhang mit spezifischen Antitumor-Immunantworten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibody buffer 2 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody buffer 5 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % FBS in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 4 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 10 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T25</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>690175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T75</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR&#160; filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T175</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>661175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal concentrator MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2001</td>
			<td>Vivaspin 20 centrifugal concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88532</td>
			<td>Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>525-2314</td>
			<td>PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coating buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desalting columns MWCO 7 kDa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89891</td>
			<td>Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent ELISA (HRPO substrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>T8665-100ML</td>
			<td>3,3&#8242;,5,5&#8242;-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent western blot (HRPO substrate)</td>
			<td>Roche/Merck</td>
			<td>12 015 200 01</td>
			<td>Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa</td>
			<td>SERVA Electrophoresis</td>
			<td>44110</td>
			<td>Visking dialysis tubing, 16 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA 96-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td>MaxiSorp Nunc-Immuno Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum</td>
			<td>PAN-BIOtech</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>FBS Good forte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISF-1 medium</td>
			<td>Biochrom/bioswisstec</td>
			<td>F 9061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145.2</td>
			<td>powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLDC-145 hybridoma</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-290</td>
			<td>if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-reducing SDS sample buffer 4 x&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 &#181;l 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 &#181;l of 5 % Bromphenol Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ovalbumin</td>
			<td>Hyglos (via BioVendor)</td>
			<td>321000</td>
			<td>EndoGrade OVA ultrapure with &#60;0.1 EU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles</td>
			<td>Nunc In Vitro</td>
			<td>734-2394</td>
			<td>standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm&#178;, 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109535</td>
			<td>pH indicator strips 0-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG(H+L)-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-062</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG+IgM-HRPO antibody&#160; (ELISA)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-068</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rabbit-IgG-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>111-035-045&#160;</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA (ELISA)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181688</td>
			<td>used at 3 ng/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA antibody (western blot)</td>
			<td>OriGene</td>
			<td>R1101</td>
			<td>used at 1:3,000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose column</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>P3296</td>
			<td>5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td>PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber plug</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5230217</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN rubber stoppers (lower &#934; 17 mm; upper &#934; 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone tube</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5430925</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN (inside &#934; 1 mm; outer &#934; 3 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim-Fast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopping solution (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M H2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22322</td>
			<td>Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter unit 0.22 &#181;m&#160;</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe 10 ml</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Disposable syringes Injekt&#174; Solo B.Braun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican&#174; cannulas</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td></td>
			<td>Sterican&#174; G 20 x 1 1/2&#34;&#34;; 0.90 x 40 mm; yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A35349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing connector</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo

Die gezielte Antigenabgabe an kreuzproduzierende dendritische Zellen (DC) in vivo induziert effizient T-Effektorzellantworten und zeigt einen wertvollen Ansatz im Impfstoffdesign. Antigen wird über Antikörper, die spezifisch für Endozytoserezeptoren wie DEC-205 sind, die Aufnahme, Verarbeitung und MHC-Klasse-I- und II-Präsentation induzieren, an DC abgegeben.
Die effiziente und zuverlässige Konjugation des gewünschten Antigens zu einem geeigneten Antikörper ist ein kritischer Schritt im DC-Targeting und hängt unter anderem vom Format des Antigens ab. Die chemische Konjugation von Protein in voller Länge zu gereinigten Antikörpern ist eine mögliche Strategie. In der Vergangenheit haben wir erfolgreich eine Vernetzung des Modellantigens Ovalbumin (OVA) und eines DEC-205-spezifischen IgG2a-Antikörpers (αDEC-205) für In-vivo-DC-Targeting-Studien an Mäusen etabliert. Der erste Schritt des Protokolls ist die Reinigung des Antikörpers aus dem Überstand des NLDC(non-lymphoid dendritic cells)-145 Hybridoms durch Affinitätschromatographie. Der gereinigte Antikörper wird zur chemischen Konjugation durch Sulfo-SMCC (Sulfosuccinimidyl 4-[N-Maleimidomethyl]-cyclohexan-1-carboxylat) aktiviert, während gleichzeitig die Sulfhydrylgruppen des OVA-Proteins durch Inkubation mit TCEP-HCl (Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid) exponiert werden. Überschüssiges TCEP-HCl und Sulfo-SMCC werden entfernt und das Antigen wird mit dem aktivierten Antikörper zur Übernachtkopplung gemischt. Das resultierende αDEC-205/OVA-Konjugat wird konzentriert und von ungebundener OVA befreit. Die erfolgreiche Konjugation von OVA zu αDEC-205 wird durch Western-Blot-Analyse und Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) verifiziert.
Wir haben erfolgreich chemisch vernetztes αDEC-205/OVA verwendet, um zytotoxische T-Zell-Reaktionen in der Leber zu induzieren und verschiedene Adjuvantien auf ihr Potenzial bei der Induktion einer humoralen und zellulären Immunität nach in vivo Targeting von DEC-205+ DC zu vergleichen. Darüber hinaus bieten solche chemisch gekoppelten Antikörper/Antigen-Konjugate wertvolle Werkzeuge für die effiziente Induktion von Impfantworten auf Tumorantigene und haben sich hinsichtlich der Prävention und Therapie verschiedener Tumorarten als überlegen gegenüber klassischen Immunisierungsansätzen erwiesen.

Die chemische Konjugation von αDEC-205 zu OVA-Protein unter Verwendung dieses Protokolls ermöglicht typischerweise die effiziente Erzeugung von αDEC-205/OVA für In-vivo-DC-Targeting-Ansätze. Es gibt verschiedene Strategien, um die Technik selbst zu verifizieren und die Funktionalität des erhaltenen Konjugats zu testen. Western-Blot-Analyse und ELISA werden verwendet, um eine erfolgreiche Konjugation zu verifizieren und gleichzeitig potenziell freie OVA zu erkennen (<strong ...

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Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Wir beschreiben ein Protokoll für die chemische Konjugation des Modellantigens Ovalbumin zu einem endozytoserezeptorspezifischen Antikörper für das in vivo dendritische Zell-Targeting. Das Protokoll umfasst die Reinigung des Antikörpers, die chemische Konjugation des Antigens sowie die Reinigung des Konjugats und die Überprüfung der effizienten Konjugation.

Chemische Konjugation eines gereinigten DEC-205-gerichteten Antikörpers mit Protein in voller Länge für das Targeting von dendritischen Zellen der Maus in vitro und in vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

Dieses Protokoll, für das alle experimentellen Bedingungen sorgfältig optimiert wurden, kann verwendet werden, um eine erfolgreiche und effiziente chemische Konjugation des DEC-205-Antikörpers zum OVA-Antigen zu ermöglichen. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie eine flexible Auswahl des Proteinantigens und des Antikörpers ermöglicht und nicht auf eine genetische Fusion dieser Komponenten angewiesen ist. Wir haben dieses Protokoll auch verwendet, um Konjugate von Hepatitis-C-Virusproteinen und Anti-DEC-205 für das In-vivo-DC-Targeting zu erzeugen.Dies könnte auch für Anti-Tumor-Impfansätze wertvoll sein. Um mit der Anti-DEC-205-Produktion zu beginnen, resuspendieren Sie ein Milliliter-Volumen von ein bis fünf Millionen aufgetauten kryokonservierten NLDC 145-Zellen in neun Millilitern 37 Grad Celsius ISF-1-Medium, ergänzt mit 1% Penicillin und Streptomycin, und säen Sie die Zellen in einen 25 Quadratzentimeter-Zellkulturkolben zur Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 24 bis 48 Stunden. Wenn die Zellen 70% Konfluenz erreichen, übertragen Sie die gesamte Zellsuspension in ein 15 Milliliter konisches Rohr und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation.Resuspendieren Sie das Pellet in 12 Milliliter frisches komplettes 37 Grad ISF-1 Medium und platten Sie die Zellen in einem 75 Quadratzentimeterkolben neu. Nach 48 bis 72 Stunden Kultur wird die 70%ige Konfluentkultur auf jeweils zwei neue 75 Quadratzentimeterkolben aufgeteilt und jedem Kolben sechs Milliliter frisches komplettes ISF-1 Medium zugesetzt. Wenn die Kulturen 70% Konfluenz erreichen, verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um die Zellkulturkolbenböden und Kulturoberflächen mit der Zellsuspension zu spülen, um alle Zellen zu sammeln und 10 Milliliter jeder expandierten NLDC 145-Zellsuspension in einzelne PETG-Walzenflaschen zu übertragen.Dann geben Sie 140 Milliliter komplettes ISF-1 Medium zu jeder Walzenflaschenkultur und kultivieren Sie die Walzenflaschen bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 25 Schuss pro Minute für drei Tage. Für die Antikörperreinigung aus dem NLDC 145-Überstand das Ende eines Siliziumrohrs in das mit Überständen gefüllte Becherglas geben und 800 Milliliter Überstand tropfenweise durch eine Protein G Sepharose-Säule laufen lassen. Zur Elution fügen Sie 100 Mikroliter 1,5 molare Tris-HCL in jedes der zwanzig zwanzig 1,5 Milliliter-Röhrchen hinzu und entfernen Sie den Gummistopfen aus der Säule.Einen Milliliter 0,1 molares Glycin in die obere Kammer der Säule geben und den eluenthaltigen Antikörper in eines der vorbereiteten 1,5 Milliliter röhrchen sammeln und für jedes Röhrchen wiederholen. Wenn alle Antikörper gesammelt und die antikörperhaltigen Elutionen gepoolt wurden, schließen Sie den Boden eines 20 Zentimeter langen Dialyseschlauchs mit einem geeigneten Dialyseschlauchverschluss und pipettieren Sie die Antikörperelution vorsichtig in den Schlauch. Schließen Sie die Oberseite des Dialyseschlauchs mit einer zweiten Klemme und befestigen Sie die obere Klemme des Dialyseschlauchs an einem schwimmenden Ständer.Fügen Sie einen magnetischen Rührstab zu einem Becher pbS hinzu und legen Sie das Becherglas auf einen Magnetrührer. Öffnen Sie nach der nächtlichen Dialyse bei vier Grad Celsius eine Klemme, um das komplette Dialysat auf einen Zentrifugalkonzentrator mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 10 Kilo zu laden, und zentrifugieren Sie den Konzentrator für 30 Minuten bei 693 mal G und vier Grad Celsius. Am Ende des Spins wird der Zentrifugalkonzentrator mit 10 Milliliter PBS für eine zweite Zentrifugation belastet, bis ein letztes bis 1,5 Milliliter Volumen Antikörperlösung erhalten ist.Um OVA an den Anti-DEC-205-Antikörper zu konjugieren, fügen Sie 200 Mikroliter PBS, ergänzt mit 500 Mikrogramm OVA-Protein, 240 Mikroliter einer frisch zubereiteten TCEP-HCL-Lösung und 560 Mikroliter steriles Reinstwasser in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen für eine 1,5-stündige Inkubation bei Raumtemperatur hinzu. Gleichzeitig 2,5 Milligramm Anti-DEC-205 in 900 Mikroliter PBS und 100 Mikroliter frisch zubereitetes Sulfo-SMCC in ein zweites 1,5-Milliliter-Röhrchen für eine 30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius bei 550 Umdrehungen pro Minute in einem Heizblock geben. Legen Sie am Ende der Inkubationen Entsalzungssäulen mit gelösten Kappen und abgedrehten Böden in einzelne konische 15-Milliliter-Rohre und zentrifugieren Sie die Säulen, um die Flüssigkeit zu entfernen.Nach der Zentrifugation legen Sie die Säulen in neue Röhrchen mit entfernten Kappen und laden Sie die Antikörper-Sulfo-SMCC- und OVA TCEP-HCL-Lösungen langsam in die Mitte des kompakten Harzbettes von einer Säule pro Lösung. Nach dem Zentrifugieren die Säulen entsorgen und die Antikörper- und OVA-Lösungen sofort mit schonender Pipettung mischen. Laden Sie die Anti-DEC-205/OVA-Lösung auf einen zentrifugalen Proteinkonzentrator und füllen Sie den Konzentrator mit PBS auf ein Volumen von 15 Milliliter.Zentrifugieren Sie den Konzentrator für fünf Minuten bei 2.000 mal G und Raumtemperatur und füllen Sie den Konzentrator mit weiteren 10 Millilitern PBS. Nachdem Sie die Konzentration mindestens acht Minuten lang unter den gleichen Zentrifugenbedingungen zentrifugiert haben, sammeln Sie die konzentrierte Probe vorsichtig aus der oberen Kammer. Um den Erfolg der Konjugation durch Western-Blot-Analyse zu überprüfen, laden Sie ein Aliquot aus jeder Probe auf einem Proteinstandard auf ein SDS-Gel und führen Sie das Gel gemäß den Standard-SDS-PAGE-Analyseprotokollen aus.Färben Sie die Membranen nach dem Gel-Blotting mit Meerrettichperoxidase-konjugierten Antikörpern, um Anti-DEC-205 oder OVA gemäß Standardprotokollen nachzuweisen. Die Membranen können dann auf das Vorhandensein des jeweiligen Proteins in jeder Probe analysiert werden. Um den Erfolg der Konjugation durch ELISA zu überprüfen, beschichten Sie eine geeignete 96-Well-ELISA-Platte mit 100 Mikrolitern des Anti-OVA-Antikörpers pro Well und verdünnen Sie Anti-DEC-205/OVA in einem Verhältnis von ein zu zwei und einem Blockierungspuffer, um Verdünnungen von sechs Mikrogramm pro Milliliter auf 93,8 Nanogramm pro Milliliter zu erhalten.100 Mikroliter jeder Verdünnung in die entsprechenden Vertiefungen der antikörperbeschichteten Platte für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur geben. Am Ende der Inkubation werden 100 Mikroliter Meerrettichperoxidase-konjugierter Antikörper gegen das Anti-DEC-205/OVA-Konjugat für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur in die Platte gegeben und dann 50 Mikroliter Meerrettichperoxidase-Substrat in jede Vertiefung gegeben, um die Analyse der Farbreaktion durch Spektrophotometrie zu ermöglichen. Die parallele Western-Blot-Analyse kann verwendet werden, um sowohl konjugierte OVA als auch konjugierte Anti-DEC-205 nachzuweisen.Die Färbung für OVA würde den Nachweis von überschüssiger freier OVA ermöglichen, falls vorhanden, und die Färbung für Anti-DEC-205 überprüft den Erfolg der Konjugation durch eine Erhöhung des Molekulargewichts zwischen nacktem Anti-DEC-205 und dem Konjugat. ELISA kann auch verwendet werden, um den Erfolg der Konjugation mit einer positiven Assoziation zwischen dem nachgewiesenen Signal und der analysierten Proteinmenge zu bewerten, was auf die erfolgreiche Erzeugung von Anti-DEC-205 / OVA-Konjugant hinweist. Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenzanalyse zeigen deutlich, dass der Anti-DEC-205-Kern effizient aus dem Knochenmark stammende CD11c-positive Zellen bindet.Die Impfung mit Anti-DEC-205/OVA in Verbindung mit Adjuvans induziert einen Anstieg der OVA-spezifischen IgG-Titer bei Mausempfängern im Vergleich zur Impfung mit OVA und Adjuvans allein. Darüber hinaus induziert Anti-DEC-205/OVA effizient überspezifische CD4- und CD8-positive T-Zell-Antworten, wobei die Anti-DEC-205/OVA-induzierten CD8-positiven T-Zell-Antworten die durch OVA allein induzierte signifikant übertreffen. Für eine erfolgreiche Konjugation des OVA-Antigens mit dem Anti-DEC-205-Antikörper ist es wichtig, die Materialien wie nachgewiesen vorzubereiten und die Konjugationsschritte unter konsistenten Bedingungen durchzuführen.Nach erfolgreicher Konjugation des Antigens und des Antikörpers sind zahlreiche nachfolgende Ansätze möglich, darunter die Bindungsanalyse und die Induktion einer pathogen- oder tumorbedingten Immunität in vivo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

In - vitro - Bildgebung und Quantifizierung des Drug Targeting Efficiency von fluoreszierend markierten GnRH - Analoga

GnRH analogues are effective targeting moieties and able to deliver anticancer agents selectively into malignant tumor cells which highly express GnRH ...

Forschung

Krebsforschung

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Doppelte Resistenz gegen EGFR-TKI und traf TKI etablieren in Lunge Adenokarzinom Zellen In Vitro mit einem 2-stufigen Dosiseskalation Verfahren

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Zählen Proteine in einzelne Zellen mit adressierbaren Tröpfchen Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR-Bewertung der pH, pO2, Redox-Status, und Konzentrationen von Phosphat und Glutathion in der Tumor-Mikroumgebung

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolierung-Protokoll der Maus Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen und ihre anschließende In-vitro- Aktivierung mit Tumor Immunkomplexe

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

Ein GPC3-targeting Bispezifische Antikörper, GPC3-S-Fab, mit potenten Zytotoxizität

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphopeptide Bereicherung gepaart mit quantitativen markierungsfreie Massenspektrometrie zu untersuchen, die Phosphoproteome bei Prostatakrebs

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

In Vivo Immunfluoreszenzlokalisation zur Bewertung der therapeutischen und diagnostischen Antikörperbiodistribution in der Krebsforschung

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

In Vivo Targeting von xenografierten menschlichen Krebszellen mit funktionalisierten fluoreszierenden Kieselsäure-Nanopartikeln in Zebrafischen

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...