Name: chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo
Uploaded: 2021-02-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo at JoVE.com

המחברים מודים לס. פרטין על הסיוע הטכני המומחה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של איגוד הלמהולץ של מרכזי מחקר גרמניים (HGF) שניתן כחלק מברית הלמהולץ 'אימונותרפיה של סרטן' (HCC_WP2b).

כל הניסויים בבעלי חיים המתוארים אושרו על ידי הסוכנות הממשלתית המקומית (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; קובץ מספר 33.12-42502-04-10/0108) ובוצעו על פי ההנחיות הלאומיות והמוסדיות.
1. ייצור αDEC-205 מקו התא ההיברידי NLDC-145
<ol><li>לייצור נוגדנים, להפשיר תאי NLDC-145 המפיקים αDEC-205 ב 37 °C (50 ...

<ol>
	<li>Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+complete+repertoire+of+conventional+dendritic+cell+functions+for+cancer+immunotherapy.">Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy.</a> Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Wculek, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+cancer+immunology+and+immunotherapy.">Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy.</a> Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).</li><li>Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell-targeted+vaccines--hope+or+hype.">Dendritic cell-targeted vaccines--hope or hype.</a> Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).</li><li>Bonifaz, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+targeting+of+antigens+to+maturing+dendritic+cells+via+the+DEC-205+receptor+improves+T+cell+vaccination.">In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination.</a> Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).</li><li>Boscardin, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+targeting+to+dendritic+cells+elicits+long-lived+T+cell+help+for+antibody+responses.">Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses.</a> Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).</li><li>Hossain, M. K., Wall, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Dendritic+Cell+Receptors+as+Targets+for+Enhancing+Anti-Cancer+Immune+Responses.">Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses.</a> Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).</li><li>Johnson, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+melanoma+growth+by+targeting+of+antigen+to+dendritic+cells+via+an+anti-DEC-205+single-chain+fragment+variable+molecule.">Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule.</a> Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).</li><li>Trumpfheller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbial+mimic+poly+IC+induces+durable+and+protective+CD4++T+cell+immunity+together+with+a+dendritic+cell+targeted+vaccine.">The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).</li><li>Idoyaga, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparable+T+helper+1+(Th1)+and+CD8+T-cell+immunity+by+targeting+HIV+gag+p24+to+CD8+dendritic+cells+within+antibodies+to+Langerin,+DEC205,+and+Clec9A.">Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).</li><li>Sancho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+therapy+in+mice+via+antigen+targeting+to+a+novel,+DC-restricted+C-type+lectin.">Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+antigen+delivery+to+dendritic+cells+elicits+robust+antiviral+T+cell-mediated+immunity+in+the+liver.">Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver.</a> Scientific Reports. 7, 43985 (2017).</li><li>Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans'+cells,+veiled+cells,+and+interdigitating+cells+in+the+mouse+recognized+by+a+monoclonal+antibody.">Langerhans' cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STING+activator+c-di-AMP+exerts+superior+adjuvant+properties+than+the+formulation+poly(I:C)/CpG+after+subcutaneous+vaccination+with+soluble+protein+antigen+or+DEC-205-mediated+antigen+targeting+to+dendritic+cells.">The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells.</a> Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).</li></ol>

הטיות כימיות של נוגדן ספציפי לקולטן אנדוציטוזיס ואנטיגן חלבונים מספקות גישה יעילה, וחשובה, גם גמישה עבור in vivo DC פילוח במודלים עכבר פרה קליני. עם הפרוטוקול שלנו אנו מספקים גישה יעילה להטיה מוצלחת של מודל אנטיגן OVA לנוגדן IgG ספציפי DEC-205.
בפרוטוקול שלנו, αDEC-205 מטוהר מקו התא ?...

תאים דנדריטיים (DC) הם שחקנים מרכזיים של המערכת החיסונית. הם קבוצה מגוונת של תאים המתמחים אנטיגן-מצגת ותפקידם העיקרי הוא לגשרחסינות מולדתאדפטיבית1,2. חשוב לציין, DC לא רק לשחק תפקיד חשוב בתגובות יעילות וספציפליות פתוגן, אלא גם מעורבים בהיבטים רבים של חסינות antitumor1,3.
בשל תפקידם הבלעדי בחסינות המארחת, DC נכנסה לפוקוס כתאי יעד לחיסון4. גישה אחת היא למקד אנטיגנים לוושינגטון ב- vivo כדי לגרום לתגובות חיסוניות ספציפיות לאנטיגן ובשנים האחרונות, מספר רב של מחקרים הוקדשו להגדרת קולטנים מתאימים ואסטרטגיות מיקוד1,4. דוגמה אחת היא קולטן לציטין מסוג C DEC-205, אשר יכול להיות ממוקד על ידי נוגדנים ספציפיים DEC-205 כדי לגרום אנדוציטוזיס. חשוב לציין, פילוח DEC-205 בשילוב עם אדג'ובנטים מתאימים הוכח כמזינה ביעילות CD4+ ו- CD8+ T, כמו גם תגובות נוגדנים, גם נגד אנטיגנים גידול3,5,6,7,8,9.
ישנם מספר מחקרים המראים אנטיגנים מצומדים המיועדים לוושינגטון להיות עדיפים על אנטיגן חינם לא מצומד3,5,10,11,12. זה הופך את ההטיה של האנטיגן לוושינגטון בהתאמה מיקוד moiety צעד מרכזי בגישות מיקוד DC. במקרה של מיקוד DC באמצעות נוגדנים או שברי נוגדנים, אנטיגנים יכולים להיות מקושרים כימית או גנטית וכל אסטרטגיה מספקת יתרונות משלה(dis)1. מצד אחד, במבנים נוגדנים אנטיגן מהונדסים גנטית יש שליטה על מינון האנטיגן, כמו גם את המיקום המספק השוואה מעולה בין מגרשים1. יחד עם זאת, הטיות כימיות זקוקות לפחות הכנה ומספקת גמישות רבה יותר במיוחד כאשר מנסים לבדוק ולהשוות אנטיגנים שונים ו / או אסטרטגיות חיסון במודלים ניסיוניים ופרה קליניים.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להטיה כימית יעילה ואמינה של אובלבומין (OVA) כאנטיגן חלבון מודל לנוגדן IgG2a ספציפי ל- DEC-205 (αDEC-205) המתאים למיקוד ב- vivo DC בעכברים. ראשית, αDEC-205 מטוהר מתאי היברידיומה NLDC-14513. עבור הטיות כימיות, נעשה שימוש באיתרונים הטרוביפונקטוריים סולפוסוצינימידיל 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-קרבוקסילאט (סולפו-SMCC), המכיל קבוצות אסתר ומליימיד NHS (N-הידרוקסיסוצינימיד), המאפשר הטיות קוולנטיות של מולקולות המכילות אמין וגופריתיל. באופן ספציפי, האמינים העיקריים של הנוגדן מגיבים בתחילה עם סולפו-SMCC וכתוצאה מכך מופעל maleimide αDEC-205 ואז מגיב עם חלבון OVA המכיל סולפיהידיל מופחת באמצעות TCEP-HCl (טריס (2-קרבוקסיתיל) הידרוכלוריד). המוצר הסופי הוא מצומד כימית αDEC-205/OVA(איור 1). מעבר להטיה הכימית עצמה, הפרוטוקול שלנו מתאר הסרה של עודף OVA מההצמדה, כמו גם אימות של הטיות מוצלחות באמצעות ניתוח כתם מערבי וביטול חיסוני ספציפי הקשור לאנזים. השתמשנו בהצלחה בגישה זו בעבר כדי להטות כימית OVA וחלבונים אחרים או פפטידים אימונוגניים ל αDEC-205. אנו מפגינים קשירה יעילה ל- CD11c+ תאים במבחנה, כמו גם אינדוקציה יעילה של חסינות תאית והומוריסטית ב- vivo.
אין ספק, ישנם חסרונות לשיטה זו כגון השוואת הרבה למגרש ובמינון המדויק של האנטיגן בתוך ההסתה הסופית. עם זאת, הטיות כימיות מספקות גמישות ניסיונית בבחירת הנוגדן ואנטיגן החלבון בהשוואה למבנים מהונדסים גנטית. לכן, אנו מאמינים שגישה זו חשובה במיוחד בהערכת אנטיגנים שונים ליעילותם ב- DC פילוח במודלים של עכברים פרה-קליניים, וחשוב גם בהקשר של תגובות חיסוניות אנטי-אטומיות ספציפיות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibody buffer 2 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody buffer 5 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % FBS in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 4 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 10 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T25</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>690175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T75</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR&#160; filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T175</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>661175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal concentrator MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2001</td>
			<td>Vivaspin 20 centrifugal concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88532</td>
			<td>Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>525-2314</td>
			<td>PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coating buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desalting columns MWCO 7 kDa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89891</td>
			<td>Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent ELISA (HRPO substrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>T8665-100ML</td>
			<td>3,3&#8242;,5,5&#8242;-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent western blot (HRPO substrate)</td>
			<td>Roche/Merck</td>
			<td>12 015 200 01</td>
			<td>Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa</td>
			<td>SERVA Electrophoresis</td>
			<td>44110</td>
			<td>Visking dialysis tubing, 16 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA 96-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td>MaxiSorp Nunc-Immuno Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum</td>
			<td>PAN-BIOtech</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>FBS Good forte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISF-1 medium</td>
			<td>Biochrom/bioswisstec</td>
			<td>F 9061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145.2</td>
			<td>powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLDC-145 hybridoma</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-290</td>
			<td>if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-reducing SDS sample buffer 4 x&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 &#181;l 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 &#181;l of 5 % Bromphenol Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ovalbumin</td>
			<td>Hyglos (via BioVendor)</td>
			<td>321000</td>
			<td>EndoGrade OVA ultrapure with &#60;0.1 EU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles</td>
			<td>Nunc In Vitro</td>
			<td>734-2394</td>
			<td>standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm&#178;, 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109535</td>
			<td>pH indicator strips 0-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG(H+L)-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-062</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG+IgM-HRPO antibody&#160; (ELISA)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-068</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rabbit-IgG-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>111-035-045&#160;</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA (ELISA)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181688</td>
			<td>used at 3 ng/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA antibody (western blot)</td>
			<td>OriGene</td>
			<td>R1101</td>
			<td>used at 1:3,000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose column</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>P3296</td>
			<td>5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td>PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber plug</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5230217</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN rubber stoppers (lower &#934; 17 mm; upper &#934; 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone tube</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5430925</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN (inside &#934; 1 mm; outer &#934; 3 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim-Fast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopping solution (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M H2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22322</td>
			<td>Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter unit 0.22 &#181;m&#160;</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe 10 ml</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Disposable syringes Injekt&#174; Solo B.Braun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican&#174; cannulas</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td></td>
			<td>Sterican&#174; G 20 x 1 1/2&#34;&#34;; 0.90 x 40 mm; yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A35349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing connector</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo

אספקת אנטיגן ממוקדת לתאים דנדריטיים (DC) המציגים באופן צולב ב-vivo גורמת ביעילות לתגובות תאי אפקט T ומציגה גישה בעלת ערך בעיצוב החיסון. אנטיגן מועבר ל- DC באמצעות נוגדנים ספציפיים לקולטני אנדוציטוזיס כגון DEC-205 הגורמים לספיגה, עיבוד ו- MHC Class I- ו- II- presentation.
הטיות יעילות ואמינות של האנטיגן הרצוי לנוגדן מתאים הוא צעד קריטי בפילוח DC ובין היתר תלוי בפורמט האנטיגן. הטיות כימיות של חלבון באורך מלא לנוגדנים מטוהרים היא אסטרטגיה אפשרית אחת. בעבר, הקמנו בהצלחה קישור צולב של המודל אנטיגן אובלבומין (OVA) ונוגדן IgG2a ספציפי DEC-205 (αDEC-205) למחקרי מיקוד in vivo DC בעכברים. השלב הראשון של הפרוטוקול הוא טיהור הנוגדן מן supernatant של NLDC (תאים דנדריטיים שאינם לימפואידים)-145 hybridoma על ידי כרומטוגרפיה זיקה. הנוגדן המטוהר מופעל להטיה כימית על ידי סולפו-SMCC (סולפוסוקינימידיל 4-[N-maleimidomethyl] ציקלוהקסן-1-קרבוקסילאט) ובמקביל קבוצות סולפיהידיל של חלבון OVA נחשפות באמצעות דגירה עם TCEP-HCl (טריס (2-קרבוקסיתיל) פוספין הידרוכלוריד). עודף TCEP-HCl וסולפו-SMCC מוסרים והאנטיגן מעורבב עם הנוגדן הפעיל לצימוד בן לילה. αDEC-205/OVA מצומדת ומשוחררת מ-OVA לא מאוגד. הטיות מוצלחות של OVA ל- αDEC-205 מאומתת על ידי ניתוח כתם מערבי ובוחן חיסוני הקשור לאנזים (ELISA).
השתמשנו בהצלחה αDEC-205/OVA מוצלב כימית כדי לגרום לתגובות תאי T ציטוטוקסיות בכבד ולהשוות אדג'ובנטים שונים לפוטנציאל שלהם לגרום לחסינות הומוריסטית ותאית בעקבות פילוח vivo של DEC-205+ DC. מעבר לכך, הצמדי נוגדנים/אנטיגן בעלי זיקה כימית אלה מציעים כלים בעלי ערך לגיוס יעיל של תגובות חיסון לאנטיגנים של הגידולים והוכחו כנעלים על גישות חיסון קלאסיות בנוגע למניעה וטיפול בסוגים שונים של גידולים.

הטיות כימיות של αDEC-205 לחלבון OVA באמצעות פרוטוקול זה תאפשר בדרך כלל ייצור יעיל של αDEC-205/OVA עבור גישות פילוח ב- vivo DC. ישנן אסטרטגיות שונות כדי לאמת את הטכניקה עצמה כדי לבדוק את הפונקציונליות של מצומד הניב. ניתוח כתמים מערביים ו- ELISA משמשים לאימות הטיות מוצלחות ובמקביל לזה?...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

אנו מתארים פרוטוקול להטיה הכימית של המודל אנטיגן אובלבומין לנוגדן ספציפי לקולטן אנדוציטוזיס עבור פילוח תאים דנדריטיים של ויוו. הפרוטוקול כולל טיהור של הנוגדן, הטיות כימיות של האנטיגן, כמו גם טיהור של ההצומדת ואימות ההטיות היעילות.

הטיות כימיות של נוגדן מטוהר מכוון DEC-205 עם חלבון באורך מלא למיקוד תאים דנדריטיים של עכבר במבחנה וב- In Vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

פרוטוקול זה שעבורו כל המצב הניסיוני אופטימיזציה בקפידה יכול לשמש כדי להקל על הטיות כימיות מוצלחות ויעילות של נוגדן DEC-205 אנטיגן OVA. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא מאפשרת בחירה גמישה של אנטיגן חלבון ונוגדן, וכי היא אינה מסתמכת על היתוך גנטי של רכיבים אלה. השתמשנו גם בפרוטוקול זה כדי ליצור מצומדים של חלבוני וירוס הפטיטיס C ואנטי DEC-205 עבור in vivo DC פילוח.זה יכול להיות גם בעל ערך עבור גישות חיסון נגד הגידול. כדי להתחיל בייצור נגד DEC-205, resuspend נפח מיליליטר אחד של אחד עד חמישה מיליון הפשרה השתמר NLDC 145 תאים בתשעה מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס ISF-1 מדיום בתוספת עם 1%פניצילין וסטרפטומיצין, ולזרוע את התאים לתוך בקבוק תרבית תא 25 סנטימטר מרובע לדגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 24 עד 48 שעות. כאשר התאים מגיעים ל-70% השפעה, העבירו את כל ההשעיה של התא לצינור חרוטי של 15 מיליליטר ואוספים את התאים בצנטריפוגה.resuspend הכדור ב 12 מיליליטר של 37 מעלות ISF-1 בינוני להשלים מחדש את התאים בבקבוק 75 ס"מ רבוע. לאחר 48 עד 72 שעות של תרבות, לפצל את התרבות המשתלבת 70% בין כל אחד משני צלוחיות חדשות 75 ס"מ מרובע ולהוסיף שישה מיליליטר של מדיום ISF-1 מלא טרי לכל בקבוקון. כאשר התרבויות מגיעות ל-70%, השתמש בצינורה של 10 מיליליטר כדי לשטוף את תחתיות הבקבוקים של תרבית התא ומשטחי התרבות עם מתלה התא כדי לאסוף את כל התאים ולהעביר 10 מיליליטר של כל מתלה תאי NLDC 145 מורחב לבקבוקי רולר PETG בודדים.לאחר מכן להוסיף 140 מיליליטר של ISF-1 מלא בינוני לכל תרבות בקבוק רולר ותרבות בקבוקי רולר ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו 25 סיבובים לדקה במשך שלושה ימים. לטיהור נוגדנים מ-NLDC 145 supernatant, הניחו את קצה צינור הסיליקון לתוך הסופר-טבעית ואפשרו ל-800 מיליליטר של סופר-נט לרוץ במהירות דרך עמודת חלבון G ספרוז. עבור elution, להוסיף 100 microliters של 1.5 טוחנת Tris-HCL לתוך כל אחד מעשרים צינורות 1.5 מיליליטר ולהסיר את תקע הגומי מהעמוד.מעבירים מיליליטר אחד של גליצין טוחן 0.1 לתא העליון של העמוד ואוספים את הנוגדן המכיל אלנט לאחד מצינורות 1.5 מיליליטר מוכנים וחוזרים על הפעולה עבור כל צינור. כאשר כל הנוגדנים נאספו והאולוטים המכילים נוגדנים אוגדו, סגור את תחתית צינור הדיאליזה באורך 20 ס"מ עם סגירת צינורות דיאליזה מתאימה, וצינור בזהירות את הנוגדנים אל הצינורות. סגור את החלק העליון של צינורות הדיאליזה עם מהדק שני ותקן את המהדק העליון של צינורות הדיאליזה לעמדה צפה.מוסיפים מוט ערבוב מגנטי לתחבת PBS ומניחים את הכיס על מערבל מגנטי. לאחר דיאליזה לילית בארבע מעלות צלזיוס, פתחו מהדק אחד כדי לאפשר טעינה של הדיאליזה המלאה לרכז צנטריפוגלי עם 10 קילוDalton מולקולרית לניתוק משקל מולקולרי, וצנטריפוגה הרכז במשך 30 דקות ב 693 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. בסוף הסיבוב, לטעון את רכז צנטריפוגלי עם 10 מיליליטר של PBS עבור צנטריפוגה שנייה עד אחד הסופי עד 1.5 מיליליטר נפח של פתרון נוגדנים מתקבל.כדי להטות את OVA לנוגדן נגד DEC-205, להוסיף 200 מיקרוליטרים של PBS בתוספת 500 מיקרוגרם של חלבון OVA, 240 מיקרוליטרים של פתרון TCEP-HCL מוכן טרי, ו 560 microliters של מים אולטרה-טחונים סטריליים לצינור 1.5 מיליליטר עבור דגירה של שעה וחצי בטמפרטורת החדר. במקביל, להוסיף 2.5 מיליגרם של אנטי DEC-205 ב 900 microliters של PBS ו 100 microliters של סולפו-SMCC מוכן טרי לצינור 1.5 מיליליטר שני עבור דגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ב 550 סיבובים לדקה בבלוק חימום. בסוף הדגירה, מניחים עמודי התפלה עם כובעים משוחררים ומעוותים את התחתית לצינורות חרוטיים בודדים של 15 מיליליטר, וצנטריפוגות העמודים כדי להסיר את הנוזל.לאחר צנטריפוגה, מקם את העמודים בצינורות חדשים עם המכסות הוסרו, ולאט לאט לטעון את הנוגדנים sulfo-SMCC ו OVA TCEP-HCL פתרונות למרכז מיטת שרף קומפקטית של עמודה אחת לכל פתרון. לאחר הצנטריפוגה, יש להשליך את העמודים ומיד לערבב את פתרונות הנוגדנים וה-OVA עם צנרת עדינה. העמיסו את התמיסה נגד DEC-205/OVA על רכז חלבונים צנטריפוגלי ומלאו את הרכז ב-PBS לנפח של 15 מיליליטר.צנטריפוגות הרכז במשך חמש דקות ב 2, 000 פעמים G וטמפרטורת החדר ולמלא את הרכז עם 10 מיליליטר נוסף של PBS. לאחר צנטריפוגה הריכוז במשך שמונה דקות לפחות תחת אותם תנאי צנטריפוגה, לאסוף בעדינות את המדגם המרוכז מהתא העליון. כדי לאמת את הצלחת ההטיה על ידי ניתוח כתם מערבי, לטעון aliquot מתוך כל מדגם על תקן חלבון על ג'ל SDS ולהפעיל את הג'ל על פי פרוטוקולי ניתוח SDS-PAGE סטנדרטיים.לאחר סופגת ג'ל, להכתים את הממברנות עם נוגדנים מצומדים peroxidase חזרת כדי לזהות אנטי DEC-205 או OVA על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. לאחר מכן ניתן לנתח את הממברנות לנוכחות החלבון המתאים בכל דגימה. כדי לאמת את ההצלחה של ההטיה על ידי ELISA, לצפות צלחת ELISA 96-well מתאים עם 100 microliters של נוגדן אנטי OVA לבאר לדלל באופן סדרתי נגד DEC-205/OVA ביחס אחד עד שניים חוסם חוצץ כדי לקבל דילול מ 6 מיקרוגרם למיליליטר ל 93.8 ננוגרם למיליליטר.הוסיפו 100 מיקרוליטרים של כל דילול לבארות המתאימות של הצלחת מצופה הנוגדנים לדגירה של שעה בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, להוסיף 100 microliters של נוגדן peroxidase חזרת מצומד נגד אנטי DEC-205 / OVA מצומד לצלחת עבור דגירה של שעה בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להוסיף 50 microliters של מצע peroxidase חזרת לכל באר כדי לאפשר ניתוח של תגובת הצבע על ידי ספקטרופוטומטריה. ניתוח כתם מערבי מקביל יכול לשמש כדי לזהות הן OVA מצומד, כמו גם נגד DEC-205 מצומד.כתמים עבור OVA יאפשרו זיהוי של עודף חינם OVA אם קיים, והכתמה עבור אנטי DEC-205 מאמת את ההצלחה של ההטיה באמצעות עלייה במשקל המולקולרי בין עירום נגד DEC-205 ואת מצומד. ELISA יכול לשמש גם כדי להעריך את ההצלחה של ההטיה עם קשר חיובי בין האות שזוהה ואת כמות ניתוח של חלבון המציין את הדור המוצלח של אנטי DEC-205/OVA הטיות. ציטומטריית זרימה וניתוח חיסוני מראים בבירור כי הליבה נגד DEC-205 קושרת ביעילות תאים חד-פעמיים ממקורות מח עצם.חיסון עם אנטי-DEC-205/OVA בשילוב עם אדג'ובנט גרם לעלייה בטיטרים IgG ספציפיים ל- OVA במקבלי עכברים בהשוואה לחיסון עם OVA ואדג'ובנט בלבד. יתר על כן, אנטי-DEC-205/OVA ביעילות גורמת לתגובות תאי T ספציפיות יתר על המידה של CD4 ו- CD8 עם תגובות תאי T אנטי-DEC-205/OVA-חיוביות ל- CD8 העולות באופן משמעותי על זה שנגרם על ידי OVA בלבד. עבור הטיות מוצלחות של אנטיגן OVA נוגדן נגד DEC-205, חשוב להכין את החומרים כפי שהודגם ולבצע את שלבי ההטיה בתנאים עקביים.לאחר הטיות מוצלחות של האנטיגן והנוגדן, גישות רבות לאחר מכן אפשריות, כולל ניתוח מחייב וגיוס של פתוגן או חסינות הקשורה לגידול ב vivo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

במבחנה הדמיה וכימות של יעילות מיקוד והתרופות של אנלוגים של GnRH שכותרתו fluorescently

GnRH analogues are effective targeting moieties and able to deliver anticancer agents selectively into malignant tumor cells which highly express GnRH ...

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

יצירת עמידות כפול EGFR-TKI ו- TKI פגש ריאות אדנוקרצינומה תאי במבחנה עם הליך דו-שלבי המינון

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

ספירת חלבונים בתאים יחיד עם Droplet למיעון מיקרו-מערכים

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

אין ויוו הערכת EPR pH, pO2, מצב חמצון-חיזור, ואת ריכוזים של פוספט גלוטתיון ב Microenvironment הגידול

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

בידוד פרוטוקול של העכבר נגזר מונוציט תאים דנדריטים והפעלה שלהם עוקבות במבחנה עם מכלולים חיסוניים הגידול

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

פילוח GPC3 נוגדן Bispecific, GPC3-S-חיובי, עם חזק Cytotoxicity

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

העשרה Phosphopeptide בשילוב עם ספקטרומטר מסה ללא תווית כמותיים כדי לחקור את Phosphoproteome סרטן הערמונית

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

ב Vivo אימונוofor, לוקליזציה להערכת הטיפול הרפואי והאבחון ביופצת התרופות בחקר הסרטן

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

ב Vivo מיקוד של תאים סרטניים אנושיים Xenografted עם חלקיקים פלורסנט פונקציונלי סיליקה ב דגי זברה

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...