Name: chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo
Uploaded: 2021-02-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo at JoVE.com

लेखक विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए एस प्रीटिन का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को हेल्महोल्ट्ज एसोसिएशन ऑफ जर्मन रिसर्च सेंटर्स (एचजीएफ) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था जिसे हेल्महोल्ट्ज़ एलायंस 'इम्यूनोथेरेपी ऑफ कैंसर' (HCC_WP2b) के हिस्से के रूप में प्रदान किया गया था।

वर्णित पशु प्रयोगों के सभी स्थानीय सरकारी एजेंसी (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; फ़ाइल संख्या 33.12-42502-04-10/0108) द्वारा अनुमोदित किया गया और राष्ट्रीय और संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया ।</p...

<ol>
	<li>Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+complete+repertoire+of+conventional+dendritic+cell+functions+for+cancer+immunotherapy.">Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy.</a> Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Wculek, S. 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एंडोसाइटोसिस रिसेप्टर-विशिष्ट एंटीबॉडी और प्रोटीन एंटीजन का रासायनिक संयुग्मण एक कुशल और महत्वपूर्ण बात यह है कि प्री-क्लीनिकल माउस मॉडल में वीवो डीसी लक्ष्यीकरण के लिए लचीला दृष्टिकोण भी प्रदा...

डेंड्रिटिक कोशिकाएं (डीसी) प्रतिरक्षा प्रणाली के केंद्रीय खिलाड़ी हैं। वे एंटीजन-प्रस्तुति में विशिष्ट कोशिकाओं के एक विविध समूह हैं और उनका प्रमुख कार्य जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा को पाटना है1,2। महत्वपूर्ण बात यह है कि डीसी न केवल कुशल और विशिष्ट रोगजनक निर्देशित प्रतिक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं बल्कि एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा1,3के कई पहलुओं में भी शामिल हैं।
मेजबान प्रतिरक्षा में उनकी विशेष भूमिका के कारण, डीसी टीकाकरण4के लिए लक्ष्य कोशिकाओं के रूप में ध्यान में आया । एक दृष्टिकोण एंटीजन-विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए वीवो में डीसी को एंटीजन को लक्षित करना है और पिछले वर्षों में, बड़ी संख्या में अध्ययन उपयुक्त रिसेप्टर्स को परिभाषित करने और रणनीतियों को लक्षित करने के लिए समर्पित किए गए हैं1,4। इसका एक उदाहरण सी-टाइप लेक्टिन रिसेप्टर डीईसी-205 है, जिसे एंडोसाइटोसिस को प्रेरित करने के लिए डीईसी-205-विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा लक्षित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि उपयुक्त एडजुवेंट के साथ संयोजन में डीईसी-205 को लंबे समय तक रहने वाले और सुरक्षात्मक सीडी 4 + और सीडी 8+ टी कोशिकाओं के साथ-साथ एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं को भी ट्यूमर एंटीजन3, 5, 6,7,8,9के खिलाफ कुशलतापूर्वक प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है।
ऐसे कई अध्ययन हैं जिनमें डीसी को लक्षित एंटीजन को मुक्त संयुक्त राष्ट्र-संयुग्मित एंटीजन3,5,10, 11,12से बेहतर होने का लक्ष्य दिया गया है । इससे संबंधित डीसी को एंटीजन का संजीदिय होना पड़ता है, जिसमें डीसी लक्ष्यीकरण दृष्टिकोण में एक केंद्रीय कदम है। एंटीबॉडी या एंटीबॉडी टुकड़े के माध्यम से डीसी लक्ष्यीकरण के मामले में, एंटीजन या तो रासायनिक या आनुवंशिक रूप से जुड़ा हो सकता है और या तो रणनीति अपने स्वयं के (dis) लाभ प्रदान करता है1। एक तरफ, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर एंटीबॉडी-एंटीजन निर्माण में एंटीजन खुराक पर नियंत्रण के साथ-साथ बहुत सारे1के बीच बेहतर तुलनीयता प्रदान करने वाला स्थान है। इसके साथ ही, रासायनिक संविलियन को कम तैयारी की आवश्यकता होती है और विशेष रूप से प्रयोगात्मक और पूर्व-नैदानिक मॉडलों में विभिन्न एंटीजन और/या टीकाकरण रणनीतियों का परीक्षण और तुलना करने का प्रयास करते समय अधिक लचीलापन प्रदान करता है ।
यहां, हम एक मॉडल प्रोटीन एंटीजन के रूप में अंडाकार (ओवीए) के कुशल और विश्वसनीय रासायनिक संयुग्मण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो चूहों में वीवो डीसी लक्ष्यीकरण में उपयुक्त है। सबसे पहले, αDEC-205 एनएलडीसी-145 हाइब्रिडोमा कोशिकाओं13से शुद्ध है। रासायनिक संयुग्मण के लिए, हेट्रोबिफंक्शनल क्रॉसलिंकर सल्फोसुक्यूनिमिडिल 4-[एन-मलीमिडोमेथिल] साइक्लोहेक्सेन-1-कार्बोक्सिलेट (सल्फो-एसएमसीसी), जिसमें एनएचएस (एन-हाइड्रोक्सीस्यूसिनिमाइड) एस्टर और मलीमाइड समूह शामिल हैं, का उपयोग किया जाता है, जिससे अमीन और सल्फीड्रिल-युक्त अणुओं के सहसंयोजक conjugation की अनुमति होती है । विशेष रूप से, एंटीबॉडी के प्राथमिक अमीन शुरू में सल्फो-एसएमसीसी और परिणामस्वरूप मलीमाइड-सक्रिय αDEC-205 के साथ प्रतिक्रिया करते हैं, फिर टीएमईपी-एचसीएल (ट्राइस (2-कार्बोक्सीथिल) फॉस्फिन हाइड्रोक्लोराइड) के माध्यम से कम सल्फ्लाइड्रिल युक्त ओवा प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया करता है। अंतिम उत्पाद रासायनिक रूप से αDEC-205/OVA(चित्रा 1)है । रासायनिक संयुग्मण से परे, हमारा प्रोटोकॉल संयुग्म से अतिरिक्त ओवी को हटाने के साथ-साथ पश्चिमी दाग विश्लेषण और एक विशिष्ट एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख के माध्यम से सफल संयुग्मण के सत्यापन का वर्णन करता है। हमने अतीत में इस दृष्टिकोण को सफलतापूर्वक नियोजित किया है ताकि ओडब्ल्यूए और अन्य प्रोटीन या इम्यूनोजेनिक पेप्टाइड्स को αDEC-205 तक रासायनिक रूप से संयोजित किया जा सके । हम विट्रो में सीडी 11सी+ कोशिकाओं के साथ - साथ वीवोमें सेलुलर और ह्यूमरल इम्युनिटी के कुशल प्रेरण के लिए कुशल बाध्यकारी प्रदर्शन करते हैं ।
निश्चित रूप से, इस विधि के लिए कमियां हैं जैसे कि बहुत-से-बहुत तुलनीयता और अंतिम संजूगेट के भीतर एंटीजन की सटीक डोजिंग में। फिर भी, रासायनिक संवजन आनुवंशिक रूप से इंजीनियर निर्माणों की तुलना में एंटीबॉडी और प्रोटीन एंटीजन की पसंद में प्रयोगात्मक लचीलापन प्रदान करता है। इसलिए, हमारा मानना है कि यह दृष्टिकोण पूर्व-नैदानिक माउस मॉडल में डीसी लक्ष्यीकरण में उनकी दक्षता के लिए विभिन्न एंटीजन का मूल्यांकन करने में विशेष रूप से मूल्यवान है, महत्वपूर्ण रूप से विशिष्ट एंटीट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के संदर्भ में भी।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibody buffer 2 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody buffer 5 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % FBS in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 4 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 10 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T25</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>690175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T75</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR&#160; filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T175</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>661175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal concentrator MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2001</td>
			<td>Vivaspin 20 centrifugal concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88532</td>
			<td>Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>525-2314</td>
			<td>PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coating buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desalting columns MWCO 7 kDa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89891</td>
			<td>Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent ELISA (HRPO substrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>T8665-100ML</td>
			<td>3,3&#8242;,5,5&#8242;-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent western blot (HRPO substrate)</td>
			<td>Roche/Merck</td>
			<td>12 015 200 01</td>
			<td>Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa</td>
			<td>SERVA Electrophoresis</td>
			<td>44110</td>
			<td>Visking dialysis tubing, 16 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA 96-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td>MaxiSorp Nunc-Immuno Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum</td>
			<td>PAN-BIOtech</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>FBS Good forte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISF-1 medium</td>
			<td>Biochrom/bioswisstec</td>
			<td>F 9061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145.2</td>
			<td>powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLDC-145 hybridoma</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-290</td>
			<td>if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-reducing SDS sample buffer 4 x&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 &#181;l 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 &#181;l of 5 % Bromphenol Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ovalbumin</td>
			<td>Hyglos (via BioVendor)</td>
			<td>321000</td>
			<td>EndoGrade OVA ultrapure with &#60;0.1 EU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles</td>
			<td>Nunc In Vitro</td>
			<td>734-2394</td>
			<td>standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm&#178;, 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109535</td>
			<td>pH indicator strips 0-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG(H+L)-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-062</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG+IgM-HRPO antibody&#160; (ELISA)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-068</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rabbit-IgG-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>111-035-045&#160;</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA (ELISA)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181688</td>
			<td>used at 3 ng/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA antibody (western blot)</td>
			<td>OriGene</td>
			<td>R1101</td>
			<td>used at 1:3,000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose column</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>P3296</td>
			<td>5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td>PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber plug</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5230217</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN rubber stoppers (lower &#934; 17 mm; upper &#934; 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone tube</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5430925</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN (inside &#934; 1 mm; outer &#934; 3 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim-Fast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopping solution (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M H2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22322</td>
			<td>Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter unit 0.22 &#181;m&#160;</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe 10 ml</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Disposable syringes Injekt&#174; Solo B.Braun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican&#174; cannulas</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td></td>
			<td>Sterican&#174; G 20 x 1 1/2&#34;&#34;; 0.90 x 40 mm; yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A35349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing connector</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo

वीवो में डेंड्रिटिक कोशिकाओं (डीसी) को क्रॉस-पेश करने के लिए लक्षित एंटीजन डिलीवरी कुशलतापूर्वक टी प्रभावकार सेल प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करती है और वैक्सीन डिजाइन में एक मूल्यवान दृष्टिकोण प्रदर्शित करती है। एंटीजन को एंडोसाइटोसिस रिसेप्टर्स जैसे डीईसी-205 के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के माध्यम से डीसी को दिया जाता है जो तेज, प्रसंस्करण और MHC वर्ग I-और II-प्रस्तुति को प्रेरित करते हैं।
एक उपयुक्त एंटीबॉडी के लिए वांछित एंटीजन का कुशल और विश्वसनीय संाधीनता डीसी लक्ष्यीकरण में एक महत्वपूर्ण कदम है और अन्य कारकों के बीच एंटीजन के प्रारूप पर निर्भर करता है। एंटीबॉडी को शुद्ध करने के लिए पूर्ण लंबाई वाले प्रोटीन का रासायनिक संविलियन एक संभावित रणनीति है। अतीत में, हमने चूहों में अध्ययन को लक्षित करने वाले वीवो डीसी में मॉडल एंटीजन ओवलब्यूमिन (ओडब्ल्यूए) और एक डीईसी-205-विशिष्ट IgG2a एंटीबॉडी (αDEC-205) को सफलतापूर्वक क्रॉस-लिंकिंग की स्थापना की है। प्रोटोकॉल का पहला कदम एनएलडीसी (नॉन-लिम्फोइड डेंड्रिटिक कोशिकाओं) के सुपरनिटेंट से एंटीबॉडी का शुद्धिकरण है- 145 हाइब्रिडोमा एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी द्वारा। शुद्ध एंटीबॉडी को सल्फो-एसएमसीसी (सल्फोस्यूसिनिमिडिल 4-[एन-मालेमिडोमेथिल] साइक्लोहेक्सेन-1-कार्बोक्सिलेट) द्वारा रासायनिक संयुग्मण के लिए सक्रिय किया जाता है, जबकि उसी समय ओवीए प्रोटीन के सल्फ्रीडिल-समूह टीसीईपी-एचसीएल (ट्राइस (2-कार्बोक्सिएथिल) फॉस्फिन हाइड्रोक्लोराइड) के साथ इनक्यूबेशन के माध्यम से उजागर होते हैं। अतिरिक्त टीएमईपी-एचसीएल और सल्फो-एसएमसीसी को हटा दिया जाता है और एंटीजन को रातोंरात युग्मन के लिए सक्रिय एंटीबॉडी के साथ मिलाया जाता है। जिसके परिणामस्वरूप αDEC-205/OVA conjugate केंद्रित है और अनबाउंड OVA से मुक्त है । αDEC-205 के लिए OVA के सफल conjugation पश्चिमी दाग विश्लेषण और एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) द्वारा सत्यापित किया जाता है।
हमने सफलतापूर्वक उपयोग किया है, लिवर में साइटोटॉक्सिक टी सेल प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए रासायनिक क्रॉसलिंक-αDEC-205/OVA का उपयोग किया है और डीईसी-205+ डीसी के वीवो लक्ष्यीकरण में निम्नलिखित ह्यूमरल और सेलुलर प्रतिरक्षा को प्रेरित करने में उनकी क्षमता के लिए विभिन्न एडजुवेंट्स की तुलना करने के लिए। इसके अलावा, इस तरह के रासायनिक युग्मित एंटीबॉडी/एंटीजन conjugates ट्यूमर एंटीजन के लिए वैक्सीन प्रतिक्रियाओं के कुशल प्रेरण के लिए मूल्यवान उपकरण प्रदान करते है और रोकथाम और ट्यूमर के विभिंन प्रकार की चिकित्सा के बारे में शास्त्रीय प्रतिरक्षण दृष्टिकोण से बेहतर साबित हो गया है ।

इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर ओडब्ल्यूए प्रोटीन के लिए αDEC-205 के रासायनिक conjugation आम तौर पर वीवो डीसी लक्ष्यीकरण दृष्टिकोण में के लिए αDEC-205/OVA की कुशल पीढ़ी की अनुमति होगी। तकनीक को सत्यापित करने और ?...

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Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

हम वीवो डेंड्रिटिक सेल टार्गेटिंग में एंडोसाइटोसिस रिसेप्टर-विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए मॉडल एंटीजन ओवलबुमिन के रासायनिक संयुग्मण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल में एंटीबॉडी का शुद्धिकरण, एंटीजन का रासायनिक संाधीनता, साथ ही संजूगेट का शुद्धिकरण और कुशल संाधीनता का सत्यापन शामिल है।

एक शुद्ध DEC-205-विट्रो में माउस Dendritic कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए पूर्ण लंबाई प्रोटीन के साथ एंटीबॉडी निर्देशित और वीवो में रासायनिक Conjugation

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

इस प्रोटोकॉल जिसके लिए सभी प्रायोगिक स्थिति को सावधानीपूर्वक अनुकूलित किया गया है, का उपयोग ओडब्ल्यूए एंटीजन के लिए डीईसी-205 एंटीबॉडी के सफल और कुशल रासायनिक संजीदगी को सुविधाजनक बनाने के लिए किया जा सकता है। इस तकनीक के मुख्य फायदे यह हैं कि यह प्रोटीन एंटीजन और एंटीबॉडी के लचीले चयन की अनुमति देता है, और यह इन घटकों के आनुवंशिक संलयन पर भरोसा नहीं करता है। हमने इस प्रोटोकॉल का उपयोग वीवो डीसी लक्ष्यीकरण में हेपेटाइटिस सी वायरस प्रोटीन और एंटी-डीईसी-205 के संयुग्मों को उत्पन्न करने के लिए भी किया है।यह इसी तरह विरोधी ट्यूमर टीकाकरण दृष्टिकोण के लिए मूल्यवान हो सकता है । एंटी-डीईसी-205 उत्पादन शुरू करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस आईएसएफ-1 माध्यम के नौ मिलीलीटर में एक से पांच मिलियन गल क्रायो-संरक्षित एनएलडीसी 145 कोशिकाओं की एक मिलीलीटर मात्रा को फिर से रीसस्ट करें, 1% पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक है, और 37 डिग्री सेल्सियस और 24 से 48 घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेशन के लिए एक 25 वर्ग सेंटीमीटर सेल संस्कृति फ्लास्क में कोशिकाओं बीज। जब कोशिकाएं 70% तक पहुंचती हैं, तो पूरे सेल निलंबन को 15 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को अपकेंद्री द्वारा एकत्र करें।ताजा पूर्ण 37 डिग्री आईएसएफ-1 माध्यम के 12 मिलीलीटर में गोली को फिर से रीसल्पेंड करें और कोशिकाओं को 75 वर्ग सेंटीमीटर फ्लास्क में फिर से प्लेट करें। संस्कृति के 48 से 72 घंटे के बाद, दो नए 75 वर्ग सेंटीमीटर फ्लास्क में से प्रत्येक के बीच 70% कॉन्फ्ल्यूटी संस्कृति को विभाजित करें और प्रत्येक फ्लास्क में ताजा पूर्ण आईएसएफ-1 माध्यम के छह मिलीलीटर जोड़ें। जब संस्कृतियां 70% तक पहुंचती हैं, तो सेल कल्चर फ्लास्क बॉटम्स और संस्कृति सतहों को सेल सस्पेंशन के साथ फ्लश करने के लिए 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करें ताकि सभी कोशिकाओं को इकट्ठा किया जा सके और प्रत्येक विस्तारित एनएलडीसी 145 सेल निलंबन के 10 मिलीलीटर को व्यक्तिगत पीईटीजी रोलर बोतलों में स्थानांतरित किया जा सके।फिर प्रत्येक रोलर बोतल संस्कृति और संस्कृति के लिए पूर्ण आईएसएफ-1 माध्यम के १४० मिलीलीटर ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% कार्बन डाइऑक्साइड और तीन दिनों के लिए प्रति मिनट 25 राउंड पर रोलर की बोतलें जोड़ें । एनएलडीसी 145 सुपरनैट से एंटीबॉडी शुद्धिकरण के लिए, एक सिलिकॉन ट्यूब के अंत को सुपरनेट से भरे बीकर में रखें और प्रोटीन जी सेफरोज कॉलम के माध्यम से ड्रॉपवाइज चलाने के लिए सुपरनेट्टर के 800 मिलीलीटर की अनुमति दें। उन्मूलन के लिए, 1.5 मोलर ट्रिस-एचसीएल के 100 माइक्रोलीटर को बीस 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में से प्रत्येक में जोड़ें और कॉलम से रबर प्लग को हटा दें।कॉलम के ऊपरी कक्ष में 0.1 मोलर ग्लाइसिन के एक मिलीलीटर को स्थानांतरित करें और तैयार 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में से एक में एल्यूएंट युक्त एंटीबॉडी एकत्र करें और प्रत्येक ट्यूब के लिए दोहराएं। जब एंटीबॉडी के सभी एकत्र किया गया है और एंटीबॉडी युक्त elutions जमा किया गया है, एक उपयुक्त डायलिसिस ट्यूबिंग बंद करने के साथ एक 20 सेंटीमीटर लंबाई डायलिसिस ट्यूबिंग के नीचे बंद करो, और ध्यान से टयूबिंग में एंटीबॉडी एल्यूशन पिपेट । डायलिसिस ट्यूबिंग के शीर्ष को दूसरे क्लैंप के साथ बंद करें और डायलिसिस ट्यूबिंग के ऊपरी क्लैंप को फ्लोटिंग स्टैंड पर ठीक करें।पीबीएस के एक बीकर में एक चुंबकीय हलचल बार जोड़ें और बीकर को चुंबकीय उभारकर रखें। चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर डायलिसिस के बाद, एक क्लैंप खोलें ताकि 10 किलोDalton आणविक वजन कटऑफ के साथ एक अपकेंद्रित्र सांद्रता के लिए पूर्ण डायलिसिस की अनुमति दी जा सके, और 693 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सांद्रता को केंद्रित करें। स्पिन के अंत में, एक दूसरे अपकेंद्रित्र के लिए पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ अपकेंद्रित्र सांकर लोड करें जब तक कि एंटीबॉडी समाधान की अंतिम एक से 1.5 मिलीलीटर मात्रा प्राप्त न हो जाए।ओवी को एंटी-डीईसी-205 एंटीबॉडी में संयोजित करने के लिए, पीबीएस के 200 माइक्रोलीटर को 500 माइक्रोग्राम ओवी प्रोटीन, 240 माइक्रोलीटर एक ताजा तैयार टीसीईपी-एचसीएल समाधान के साथ जोड़ें, और बाँझ अल्ट्रापुर पानी के 560 माइक्रोलीटर को 1.5 घंटे के इनक्यूबेशन तापमान पर 1.5 मिलीमीटर ट्यूब के लिए जोड़ें। इसके साथ ही पीबीएस के ९०० माइक्रोलीटर में एंटी-डीईसी-२०५ के २.५ मिलीग्राम और एक हीटिंग ब्लॉक में ५५० क्रांतियों प्रति मिनट ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के इनक्यूबेशन पर एक दूसरे १.५ मिलीलीटर ट्यूब के लिए हौसले से तैयार सल्फो-एसएमसीसी के १०० माइक्रोलीटर जोड़ें । ऊष्मायन के अंत में, ढीला टोपियां के साथ टुकड़ों को अलग रखें और नीचे से अलग-अलग 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में मुड़ जाएं, और तरल को हटाने के लिए कॉलम को अपकेंद्रित्र करें।अपकेंद्रित्र के बाद, कॉलम को हटाई गई टोपियां के साथ नई ट्यूबों में रखें, और धीरे-धीरे प्रति समाधान एक कॉलम के कॉम्पैक्ट राल बिस्तर के केंद्र में एंटीबॉडी सल्फो-एसएमसीसी और ओवी टीएमसीपी-एचसीएल समाधान लोड करें। अपकेंद्रित्र के बाद, कॉलम को त्यागें और तुरंत कोमल पाइपिंग के साथ एंटीबॉडी और ओवी समाधान मिलाएं। एंटी-डीईसी-205/ओवी समाधान को एक अपकेंद्रित्र प्रोटीन सांद्रता पर लोड करें और पीबीएस के साथ एक 15 मिलीलीटर मात्रा में सांद्रता को भरें।2, 000 बार जी और कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए केंद्रीकरण अपकेंद्रित्र और PBS के एक अतिरिक्त 10 मिलीलीटर के साथ ध्यान केंद्रित भरें । एक ही अपकेंद्रित्र स्थितियों के तहत कम से कम आठ मिनट के लिए एकाग्रता अपकेंद्रित्र करने के बाद, धीरे से ऊपरी कक्ष से केंद्रित नमूना इकट्ठा। पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा संाधीनता की सफलता को सत्यापित करने के लिए, एक प्रोटीन मानक पर प्रत्येक नमूने से एक एलिकोट को एसडीएस जेल पर लोड करें और मानक एसडीएस-पेज विश्लेषण प्रोटोकॉल के अनुसार जेल चलाएं।जेल ब्लॉटिंग के बाद, मानक प्रोटोकॉल के अनुसार एंटी-डीईसी-205 या ओवी का पता लगाने के लिए सहिजन पेरोक्सिडेस के साथ झिल्ली को दाग दें। झिल्ली तो प्रत्येक नमूने में संबंधित प्रोटीन की उपस्थिति के लिए विश्लेषण किया जा सकता है। एलिसा द्वारा संाधीनता की सफलता को सत्यापित करने के लिए, प्रति अच्छी तरह से एंटी-ओवा एंटीबॉडी के १०० माइक्रोलीटर के साथ एक उपयुक्त ९६-अच्छी तरह से एलिसा प्लेट कोट करें और क्रमिक रूप से एंटी-डीईसी-205/ओवा को एक से दो अनुपात में पतला करें और एक से दो अनुपात में एंटी-डीईसी-205/ओए को कमजोर करें और छह माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर से ९३.८ नैनोग्राम मिलिटेटर तक कमजोर करने के लिए बफर को अवरुद्ध करें ।कमरे के तापमान पर एक घंटे की इनक्यूबेशन के लिए एंटीबॉडी-लेपित प्लेट के उपयुक्त कुओं में प्रत्येक कमजोर पड़ने के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। इनक्यूबेशन के अंत में, कमरे के तापमान पर एक घंटे की इनक्यूबेशन के लिए प्लेट में एंटी-डीईसी-205/ओवा के खिलाफ सहिजन पेरोक्सिडेस के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, फिर स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा रंग प्रतिक्रिया के विश्लेषण की अनुमति देने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से सहिजन पेरोक्सिडास सबस्ट्रेट के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। समानांतर पश्चिमी दाग विश्लेषण दोनों संयुग्मित OVA के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संयुग्मित विरोधी DEC-२०५ का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।OVA के लिए धुंधला अतिरिक्त मुक्त OVA का पता लगाने की अनुमति होगी अगर वर्तमान, और विरोधी के लिए धुंधला-DEC-२०५ नग्न विरोधी DEC-२०५ और conjugate के बीच आणविक वजन में वृद्धि के माध्यम से conjugation की सफलता की पुष्टि करता है । एलिसा का उपयोग पता लगाने वाले संकेत और प्रोटीन की विश्लेषण की गई मात्रा के बीच एक सकारात्मक संबंध के साथ संाधीनता की सफलता का आकलन करने के लिए भी किया जा सकता है जो एंटी-डीईसी-205/ओवा संकुजेंट की सफल पीढ़ी का संकेत देता है । फ्लो साइटोमेट्री और इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण से स्पष्ट रूप से पता चलता है कि एंटी-डीईसी-205 कोर बोन मैरो-व्युत्पन्न सीडी 11c-सकारात्मक कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक बांधता है।विरोधी डीईसी के साथ टीकाकरण-205/OVA adjuvant के साथ संयोजन के रूप में ओवी में वृद्धि-माउस प्राप्तकर्ताओं में विशिष्ट IgG titers अकेले OVA और adjuvant के साथ टीकाकरण की तुलना में लाती है । इसके अलावा, विरोधी DEC-205/OVA कुशलता से अधिक विशिष्ट CD4 और CD8-सकारात्मक टी विरोधी के साथ सेल प्रतिक्रियाओं लाती है-205/OVA-प्रेरित सीडी 8-सकारात्मक टी सेल प्रतिक्रियाओं काफी अधिक है कि अकेले OVA द्वारा प्रेरित । विरोधी डीईसी-205 एंटीबॉडी के लिए OVA एंटीजन के एक सफल conjugation के लिए, यह प्रदर्शन के रूप में सामग्री तैयार करने के लिए और लगातार परिस्थितियों में conjugation कदम प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है।एंटीजन और एंटीबॉडी के सफल संयुग्मण के बाद, कई बाद के दृष्टिकोण संभव हैं, जिनमें बाध्यकारी विश्लेषण और वीवो में रोगजनक या ट्यूमर से संबंधित प्रतिरक्षा को शामिल करना शामिल है।

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

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इन विट्रो इमेजिंग और fluorescently लेबल GnRH analogues के ड्रग लक्ष्य निर्धारण क्षमता की मात्रा का ठहराव में

GnRH analogues are effective targeting moieties and able to deliver anticancer agents selectively into malignant tumor cells which highly express GnRH ...

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

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एक 2-कदम खुराक-वृद्धि प्रक्रिया के साथ फेफड़ों ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं में इन विट्रो में EGFR-TKI और TKI से मुलाकात के लिए दोहरी प्रतिरोध की स्थापना

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

पता करने वाली छोटी बूंद Microarrays के साथ एकल कोशिकाओं में प्रोटीन गिनती

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

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ऊपर की ओर बढ़ रहा है: एक सरल और लचीले इन विट्रो में तीन आयामी आक्रमण परख प्रोटोकॉल

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

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Vivo में पीएच के EPR आकलन, पीओ2, Redox स्थिति, और ट्यूमर में फॉस्फेट और Glutathione की सांद्रता Microenvironment

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

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माउस Monocyte के आइसोलेशन प्रोटोकॉल-व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं और उनके बाद में ट्यूमर प्रतिरक्षा परिसरों के साथ इन विट्रो सक्रियण

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

एक GPC3-लक्ष्यीकरण Bispecific एंटीबॉडी, GPC3-एस-फैब, शक्तिशाली Cytotoxicity के साथ

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphopeptide संवर्धन लेबल के साथ युग्मित मुक्त मात्रात्मक जन स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोस्टेट कैंसर में Phosphoproteome की जांच करने के लिए

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

कैंसर अनुसंधान में चिकित्सीय और नैदानिक एंटीबॉडी जैव वितरण के आकलन के लिए Vivo इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्थानीयकरण में

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

वीवो में ज़ेब्राफ़िश में कार्यात्मक फ्लोरोसेंट सिलिका नैनोकणों के साथ Xenografted मानव कैंसर कोशिकाओं का लक्ष्यीकरण

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...