Name: chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo
Uploaded: 2021-02-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Gli autori ringraziano S. Prettin per l'assistenza tecnica esperta. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione dell'Associazione Helmholtz dei centri di ricerca tedeschi (HGF) che è stata fornita come parte dell'Alleanza Helmholtz "Immunoterapia dei tumori" (HCC_WP2b).

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dall'agenzia governativa locale (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; numero di file 33.12-42502-04-10/0108) e sono stati eseguiti secondo le linee guida nazionali e istituzionali.
1. Produzione di αDEC-205 dalla linea cellulare di ibridoma NLDC-145
<ol><li>Per la produzione di anticorpi, scongelare le cellule NLDC-145 crioconservate producendo αDEC-205 a 37 °C a bagnomaria. Espan...

<ol>
	<li>Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+complete+repertoire+of+conventional+dendritic+cell+functions+for+cancer+immunotherapy.">Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy.</a> Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Wculek, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+cancer+immunology+and+immunotherapy.">Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy.</a> Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).</li><li>Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell-targeted+vaccines--hope+or+hype.">Dendritic cell-targeted vaccines--hope or hype.</a> Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).</li><li>Bonifaz, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+targeting+of+antigens+to+maturing+dendritic+cells+via+the+DEC-205+receptor+improves+T+cell+vaccination.">In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination.</a> Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).</li><li>Boscardin, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+targeting+to+dendritic+cells+elicits+long-lived+T+cell+help+for+antibody+responses.">Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses.</a> Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).</li><li>Hossain, M. K., Wall, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Dendritic+Cell+Receptors+as+Targets+for+Enhancing+Anti-Cancer+Immune+Responses.">Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses.</a> Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).</li><li>Johnson, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+melanoma+growth+by+targeting+of+antigen+to+dendritic+cells+via+an+anti-DEC-205+single-chain+fragment+variable+molecule.">Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule.</a> Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).</li><li>Trumpfheller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbial+mimic+poly+IC+induces+durable+and+protective+CD4++T+cell+immunity+together+with+a+dendritic+cell+targeted+vaccine.">The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).</li><li>Idoyaga, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparable+T+helper+1+(Th1)+and+CD8+T-cell+immunity+by+targeting+HIV+gag+p24+to+CD8+dendritic+cells+within+antibodies+to+Langerin,+DEC205,+and+Clec9A.">Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).</li><li>Sancho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+therapy+in+mice+via+antigen+targeting+to+a+novel,+DC-restricted+C-type+lectin.">Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+antigen+delivery+to+dendritic+cells+elicits+robust+antiviral+T+cell-mediated+immunity+in+the+liver.">Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver.</a> Scientific Reports. 7, 43985 (2017).</li><li>Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans'+cells,+veiled+cells,+and+interdigitating+cells+in+the+mouse+recognized+by+a+monoclonal+antibody.">Langerhans' cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STING+activator+c-di-AMP+exerts+superior+adjuvant+properties+than+the+formulation+poly(I:C)/CpG+after+subcutaneous+vaccination+with+soluble+protein+antigen+or+DEC-205-mediated+antigen+targeting+to+dendritic+cells.">The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells.</a> Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).</li></ol>

La coniugazione chimica di un anticorpo specifico del recettore dell'endocitosi e di un antigene proteico fornisce un approccio efficiente e, soprattutto, anche flessibile per il targeting DC in vivo in modelli murini pre-clinici. Con il nostro protocollo forniamo un approccio efficiente per la coniugazione di successo dell'antigene modello OAV a un anticorpo IgG specifico dec-205.
Nel nostro protocollo, αDEC-205 viene purificato da una linea cellulare di ibridoma e in passato abbiam...

Le cellule dendritiche (DC) sono attori centrali del sistema immunitario. Sono un gruppo eterogeneo di cellule specializzate nella presentazione dell'antigene e la loro funzione principale è quella di colmare l'immunità innata e adattativa1,2. È importante sottolineare che i DC non solo svolgono un ruolo importante in risposte efficienti e specifiche dirette ai patogeni, ma sono anche coinvolti in molti aspetti dell'immunità antitumorale1,3.
A causa del loro ruolo esclusivo nell'immunità dell'ospite, dc è venuto a fuoco come cellule bersaglio per la vaccinazione4. Un approccio è quello di indirizzare gli antigeni a DC in vivo per indurre risposte immunitarie antigene-specifiche e negli ultimi anni, un gran numero di studi sono stati dedicati alla definizione di recettori adatti e strategie di targeting1,4. Un esempio è il recettore della lectina di tipo C DEC-205, che può essere preso di mira da anticorpi specifici DEC-205 per indurre l'endocitosi. È importante sottolineare che il targeting DEC-205 in combinazione con adiuvanti adatti ha dimostrato di indurre in modo efficiente cellule T CD4+ e CD8+ di lunga durata e protettive, nonché risposte anticorpali, anche contro gli antigeni tumorali3,5,6,7,8,9.
Ci sono un certo numero di studi che dimostrano che gli antigeni coniugati mirati alla DC sono superiori all'antigene libero non coniugato3,5,10,11,12. Ciò rende la coniugazione dell'antigene alla rispettiva porzione di targeting DC un passo centrale negli approcci di targeting DC. Nel caso del targeting DC tramite anticorpi o frammenti di anticorpi, gli antigeni possono essere collegati chimicamente o geneticamente e entrambe le strategie forniscono i propri (dis)vantaggi1. Da un lato, nei costrutti anticorpo-antigene geneticamente modificati esiste un controllo sulla dose di antigene e sulla posizione che fornisce una comparabilità superiore tra i lotti1. Allo stesso tempo, tuttavia, la coniugazione chimica richiede meno preparazione e fornisce maggiore flessibilità soprattutto quando si tenta di testare e confrontare diversi antigeni e / o strategie di vaccinazione in modelli sperimentali e pre-clinici.
Qui, presentiamo un protocollo per la coniugazione chimica efficiente e affidabile dell'ovalbumina (OVA) come antigene proteico modello a un anticorpo IgG2a specifico dec-205 (αDEC-205) adatto per il targeting DC in vivo nei topi. Innanzitutto, αDEC-205 viene purificato dalle cellule di ibridoma NLDC-14513. Per la coniugazione chimica, viene utilizzato il reticolante eterobifunzionale sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC), che contiene estere NHS (N-idrossisuccinimide) e gruppi maleimmidi, consentendo la coniugazione covalente di molecole contenenti ammine e sulfidril. In particolare, le ammine primarie dell'anticorpo reagiscono inizialmente con sulfo-SMCC e il risultante αDEC-205 attivato dalla maleimmide reagisce quindi con la proteina OAV contenente sulfidrile ridotta attraverso TCEP-HCl (Tris(2-carbossietil) fosfina cloridrato). Il prodotto finale è αDEC-205/OVA coniugato chimicamente (Figura 1). Oltre alla coniugazione chimica stessa, il nostro protocollo descrive la rimozione dell'OVA in eccesso dal coniugato e la verifica del successo della coniugazione attraverso l'analisi western blot e uno specifico test immunoassorbente enzimatico. Abbiamo utilizzato con successo questo approccio in passato per coniugare chimicamente l'OVA e altre proteine o peptidi immunogenici ad αDEC-205. Dimostriamo un legame efficiente alle cellule CD11c+ in vitro e l'induzione efficiente dell'immunità cellulare e umorale in vivo.
Certamente, ci sono degli svantaggi in questo metodo, come nella comparabilità da lotto a lotto e nel dosaggio esatto dell'antigene all'interno del coniugato finale. Tuttavia, la coniugazione chimica fornisce flessibilità sperimentale nella scelta dell'anticorpo e dell'antigene proteico rispetto ai costrutti geneticamente modificati. Pertanto, riteniamo che questo approccio sia particolarmente prezioso nella valutazione di diversi antigeni per la loro efficienza nel targeting DC in modelli murini pre-clinici, soprattutto anche nel contesto di specifiche risposte immunitarie antitumorali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibody buffer 2 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody buffer 5 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % FBS in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 4 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 10 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T25</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>690175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T75</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR&#160; filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T175</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>661175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal concentrator MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2001</td>
			<td>Vivaspin 20 centrifugal concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88532</td>
			<td>Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>525-2314</td>
			<td>PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coating buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desalting columns MWCO 7 kDa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89891</td>
			<td>Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent ELISA (HRPO substrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>T8665-100ML</td>
			<td>3,3&#8242;,5,5&#8242;-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent western blot (HRPO substrate)</td>
			<td>Roche/Merck</td>
			<td>12 015 200 01</td>
			<td>Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa</td>
			<td>SERVA Electrophoresis</td>
			<td>44110</td>
			<td>Visking dialysis tubing, 16 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA 96-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td>MaxiSorp Nunc-Immuno Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum</td>
			<td>PAN-BIOtech</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>FBS Good forte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISF-1 medium</td>
			<td>Biochrom/bioswisstec</td>
			<td>F 9061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145.2</td>
			<td>powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLDC-145 hybridoma</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-290</td>
			<td>if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-reducing SDS sample buffer 4 x&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 &#181;l 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 &#181;l of 5 % Bromphenol Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ovalbumin</td>
			<td>Hyglos (via BioVendor)</td>
			<td>321000</td>
			<td>EndoGrade OVA ultrapure with &#60;0.1 EU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles</td>
			<td>Nunc In Vitro</td>
			<td>734-2394</td>
			<td>standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm&#178;, 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109535</td>
			<td>pH indicator strips 0-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG(H+L)-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-062</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG+IgM-HRPO antibody&#160; (ELISA)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-068</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rabbit-IgG-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>111-035-045&#160;</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA (ELISA)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181688</td>
			<td>used at 3 ng/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA antibody (western blot)</td>
			<td>OriGene</td>
			<td>R1101</td>
			<td>used at 1:3,000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose column</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>P3296</td>
			<td>5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td>PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber plug</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5230217</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN rubber stoppers (lower &#934; 17 mm; upper &#934; 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone tube</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5430925</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN (inside &#934; 1 mm; outer &#934; 3 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim-Fast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopping solution (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M H2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22322</td>
			<td>Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter unit 0.22 &#181;m&#160;</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe 10 ml</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Disposable syringes Injekt&#174; Solo B.Braun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican&#174; cannulas</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td></td>
			<td>Sterican&#174; G 20 x 1 1/2&#34;&#34;; 0.90 x 40 mm; yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A35349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing connector</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo

La somministrazione mirata di antigene a cellule dendritiche a presentazione incrociata (DC) in vivo induce in modo efficiente le risposte delle cellule effettrici T e mostra un approccio prezioso nella progettazione del vaccino. L'antigene viene consegnato a DC tramite anticorpi specifici per i recettori dell'endocitosi come DEC-205 che inducono l'assorbimento, l'elaborazione e la presentazione di MHC di classe I e II.
La coniugazione efficiente e affidabile dell'antigene desiderato con un anticorpo adatto è un passo critico nel targeting DC e tra gli altri fattori dipende dal formato dell'antigene. La coniugazione chimica di proteine a lunghezza intera in anticorpi purificati è una possibile strategia. In passato, abbiamo stabilito con successo il cross-linking dell'antigene modello ovalbumina (OVA) e di un anticorpo IgG2a specifico dec-205 (αDEC-205) per studi di targeting DC in vivo nei topi. Il primo passo del protocollo è la purificazione dell'anticorpo dal surnatante dell'ibridoma DENDRITICO NLDC (cellule dendritiche non linfoidi)-145 mediante cromatografia di affinità. L'anticorpo purificato viene attivato per la coniugazione chimica dal sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate) mentre allo stesso tempo i gruppi sulfidrilici della proteina OAV sono esposti attraverso l'incubazione con TCEP-HCl (tris (2-carbossietil) fosfina cloridrato). L'eccesso di TCEP-HCl e sulfo-SMCC viene rimosso e l'antigene viene miscelato con l'anticorpo attivato per l'accoppiamento notturno. Il coniugato αDEC-205/OVA risultante viene concentrato e liberato da OAV non legati. Il successo della coniugazione dell'OAV in αDEC-205 è verificato mediante l'analisi western blot e il saggio immunoassorbente enzimatico (ELISA).
Abbiamo utilizzato con successo αDEC-205/OVA reticolato chimicamente per indurre risposte citotossiche delle cellule T nel fegato e per confrontare diversi adiuvanti per il loro potenziale nell'indurre l'immunità umorale e cellulare a seguito del targeting in vivo di DEC-205+ DC. Oltre a ciò, tali coniugati anticorpo/antigene accoppiati chimicamente offrono strumenti preziosi per l'induzione efficiente delle risposte vaccinali agli antigeni tumorali e hanno dimostrato di essere superiori agli approcci di immunizzazione classici per quanto riguarda la prevenzione e la terapia di vari tipi di tumori.

La coniugazione chimica di αDEC-205 alla proteina OAV utilizzando questo protocollo consentirà in genere la generazione efficiente di αDEC-205/OVA per approcci di targeting DC in vivo. Esistono diverse strategie per verificare la tecnica stessa e per testare la funzionalità del coniugato ceduto. L'analisi Western blot e l'ELISA vengono utilizzati per verificare il successo della coniugazione e allo stesso tempo rilevare oAV potenzialmente lasciati liberi (<strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Descriviamo un protocollo per la coniugazione chimica dell'antigene modello ovalbumina ad un anticorpo specifico del recettore dell'endocitosi per il targeting delle cellule dendritiche in vivo. Il protocollo comprende la purificazione dell'anticorpo, la coniugazione chimica dell'antigene, nonché la purificazione del coniugato e la verifica di una coniugazione efficiente.

Coniugazione chimica di un anticorpo purificato dec-205 diretto con proteina a lunghezza intera per il targeting di cellule dendritiche di topo in vitro e in vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

Questo protocollo per il quale tutte le condizioni sperimentali sono state attentamente ottimizzate può essere utilizzato per facilitare una coniugazione chimica efficace ed efficiente dell'anticorpo DEC-205 all'antigene OAV. I principali vantaggi di questa tecnica sono che consente una selezione flessibile dell'antigene proteico e dell'anticorpo e che non si basa sulla fusione genetica di questi componenti. Abbiamo anche utilizzato questo protocollo per generare coniugati di proteine del virus dell'epatite C e anti-DEC-205 per il targeting DC in vivo.Questo potrebbe anche essere utile per gli approcci di vaccinazione antitumorale. Per avviare la produzione anti-DEC-205, risospese un volume di un millilitro da uno a cinque milioni di cellule NLDC 145 crioconservate scongelate in nove millilitri di 37 gradi Celsius ISF-1 mezzo integrato con 1% di penicillina e streptomicina, e seminare le cellule in un pallone di coltura cellulare di 25 centimetri quadrati per l'incubazione a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24-48 ore. Quando le cellule raggiungono il 70% di confluenza, trasferire l'intera sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri e raccogliere le cellule mediante centrifugazione.Risospesso il pellet in 12 millilitri di mezzo ISF-1 isF-1 fresco completo a 37 gradi e ri-placcare le celle in un pallone da 75 centimetri quadrati. Dopo 48-72 ore di coltura, dividere la coltura confluente al 70% tra ciascuna delle due nuove fiasche da 75 centimetri quadrati e aggiungere sei millilitri di isF-1 medio fresco completo a ciascun pallone. Quando le colture raggiungono il 70% di confluenza, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per lavare i fondi e le superfici di coltura cellulare con la sospensione cellulare per raccogliere tutte le cellule e trasferire 10 millilitri di ogni sospensione espansa NLDC 145 celle in singoli flaconi a rulli PETG.Quindi aggiungere 140 millilitri di mezzo ISF-1 completo a ciascuna coltura di bottiglie a rulli e coltivare le bottiglie a rulli a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 25 colpi al minuto per tre giorni. Per la purificazione degli anticorpi dal surnatante NLDC 145, posizionare l'estremità di un tubo di silicio nel becher riempito di surnatante e lasciare che 800 millilitri di surnatante scorrano a goccia attraverso una colonna di sefarosio della proteina G. Per l'eluizione, aggiungere 100 microlitri di 1,5 tris-HCL molari in ciascuno dei venti tubi da 1,5 millilitri e rimuovere il tappo di gomma dalla colonna.Trasferire un millilitro di glicina molare 0,1 nella camera superiore della colonna e raccogliere l'anticorpo contenente eluente in uno dei tubi da 1,5 millilitri preparati e ripetere per ciascun tubo. Quando tutto l'anticorpo è stato raccolto e le eluizioni contenenti anticorpi sono state raggruppate, chiudere il fondo di un tubo di dialisi lungo 20 centimetri con un'appropriata chiusura del tubo di dialisi e pipettare con cura l'eluizione anticorpale nel tubo. Chiudere la parte superiore del tubo di dialisi con un secondo morsetto e fissare il morsetto superiore del tubo di dialisi a un supporto galleggiante.Aggiungere una barra magnetica a un becher di PBS e posizionare il becher su un agitatore magnetico. Dopo la dialisi notturna a quattro gradi Celsius, aprire un morsetto per consentire il caricamento del dializzatore completo su un concentratore centrifugo con un taglio di peso molecolare di 10 kiloDalton e centrifugare il concentratore per 30 minuti a 693 volte G e quattro gradi Celsius. Alla fine dello spin, caricare il concentratore centrifugo con 10 millilitri di PBS per una seconda centrifugazione fino ad ottenere un volume finale da 1,5 millilitri di soluzione anticorpale.Per coniugare l'OAV all'anticorpo anti-DEC-205, aggiungere 200 microlitri di PBS integrati con 500 microgrammi di proteina OAV, 240 microlitri di una soluzione TCEP-HCL appena preparata e 560 microlitri di acqua ultrapura sterile in un tubo da 1,5 millilitri per un'incubazione di 1,5 ore a temperatura ambiente. Allo stesso tempo, aggiungere 2,5 milligrammi di anti-DEC-205 in 900 microlitri di PBS e 100 microlitri di sulfo-SMCC appena preparato a un secondo tubo da 1,5 millilitri per un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius a 550 giri al minuto in un blocco riscaldante. Alla fine delle incubazioni, posizionare le colonne di dissalazione con tappi allentati e fondi attorcigliati in singoli tubi conici da 15 millilitri e centrifugare le colonne per rimuovere il liquido.Dopo la centrifugazione, posizionare le colonne in nuovi tubi con i tappi rimossi e caricare lentamente le soluzioni anticorpali sulfo-SMCC e OVA TCEP-HCL al centro del letto di resina compatto di una colonna per soluzione. Dopo la centrifugazione, scartare le colonne e mescolare immediatamente le soluzioni anticorpali e OAV con un pipettaggio delicato. Caricare la soluzione anti-DEC-205/OVA su un concentratore di proteine centrifughe e riempire il concentratore con PBS fino a un volume di 15 millilitri.Centrifugare il concentratore per cinque minuti a 2.000 volte G e temperatura ambiente e riempire il concentratore con ulteriori 10 millilitri di PBS. Dopo aver centrifugato la concentrazione per almeno otto minuti nelle stesse condizioni di centrifuga, raccogliere delicatamente il campione concentrato dalla camera superiore. Per verificare il successo della coniugazione mediante analisi Western blot, caricare un'aliquota da ciascun campione su uno standard proteico su un gel SDS ed eseguire il gel secondo i protocolli di analisi SDS-PAGE standard.Dopo il gel blotting, colorare le membrane con anticorpi coniugati con perossidasi di rafano per rilevare anti-DEC-205 o OVA secondo i protocolli standard. Le membrane possono quindi essere analizzate per la presenza della rispettiva proteina in ciascun campione. Per verificare il successo della coniugazione da parte di ELISA, rivestire un'appropriata piastra ELISA a 96 pozzetti con 100 microlitri dell'anticorpo anti-OAV per pozzetto e diluire serialmente anti-DEC-205/OVA con un rapporto uno a due e tampone bloccante per ottenere diluizioni da sei microgrammi per millilitro a 93,8 nanogrammi per millilitro.Aggiungere 100 microlitri di ogni diluizione ai pozzetti appropriati della piastra rivestita di anticorpi per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, aggiungere 100 microlitri di anticorpo coniugato con perossidasi di rafano contro il coniugato anti-DEC-205/OVA alla piastra per un'incubazione di un'ora a temperatura ambiente, quindi aggiungere 50 microlitri di substrato di perossidasi di rafano a ciascun pozzetto per consentire l'analisi della reazione del colore mediante spettrofotometria. L'analisi parallela Western blot può essere utilizzata per rilevare sia l'OAV coniugato che l'anti-DEC-205 coniugato.La colorazione per oAV consentirebbe la rilevazione di OAV liberi in eccesso se presenti, e la colorazione per anti-DEC-205 verifica il successo della coniugazione attraverso un aumento del peso molecolare tra l'anti-DEC-205 nudo e il coniugato. ELISA può anche essere utilizzato per valutare il successo della coniugazione con un'associazione positiva tra il segnale rilevato e la quantità analizzata di proteina che indica il successo della generazione di coniuge anti-DEC-205 / OAV. La citometria a flusso e l'analisi di immunofluorescenza mostrano chiaramente che il nucleo anti-DEC-205 lega in modo efficiente le cellule CD11c-positive derivate dal midollo osseo.La vaccinazione con anti-DEC-205/OVA in combinazione con l'adiuvante induce un aumento dei titoli IgG specifici per oAV nei riceventi di topo rispetto alla vaccinazione con OAV e adiuvante da solo. Inoltre, l'anti-DEC-205/OVA induce in modo efficiente risposte sovraspecifiche delle cellule T CD4 e CD8-positive con le risposte delle cellule T CD8-positive indotte da anti-DEC-205/OVA significativamente superiori a quelle indotte dal solo OAV. Per una coniugazione di successo dell'antigene OAV all'anticorpo anti-DEC-205, è importante preparare i materiali come dimostrato ed eseguire le fasi di coniugazione in condizioni coerenti.Dopo aver coniugato con successo l'antigene e l'anticorpo, sono possibili numerosi approcci successivi, tra cui l'analisi del legame e l'induzione dell'immunità patogena o correlata al tumore in vivo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

In Vitro Imaging e quantificazione della Drug Targeting efficienza di fluorescente GnRH analoghi

GnRH analogues are effective targeting moieties and able to deliver anticancer agents selectively into malignant tumor cells which highly express GnRH ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Che istituisce la doppia resistenza all'EGFR-TKI e incontrato-TKI nel polmone Adenocarcinoma cellule In Vitro con una procedura 2-passo Dose-escalation

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Proteine in singole cellule con gocciolina indirizzabile Microarrays di conteggio

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Lo spostamento verso l'alto: Un semplice e flessibile In Vitro tridimensionale invasione protocollo di analisi

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR valutazione di pH, pO2, lo stato Redox e le concentrazioni di fosfato e glutatione nel microambiente tumorale

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Protocollo di isolamento del Mouse cellule dentritiche monocito-derivate e loro attivazione successiva In Vitro con tumore immunocomplessi

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

Un targeting GPC3 bispecifico, GPC3-S-Fab, con potente citotossicità

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Fosfopeptide arricchimento accoppiata alla spettrometria di massa privo di etichetta quantitativa per indagare il Phosphoproteome nel carcinoma della prostata

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

Localizzazione dell'immunofluorescenza in vivo per la valutazione della biodistribuzione terapeutica e diagnostica degli anticorpi nella ricerca sul cancro

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

In Vivo Targeting di cellule tumorali umane Xenografted con nanoparticelle di silice fluorescenti funzionalizzate nel pesce zebra

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...