Name: chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo
Uploaded: 2021-02-05T14:00:00
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저자는 전문 기술 지원을 위한 S. Prettin에게 감사드립니다. 이 작품은 헬름홀츠 얼라이언스의 일환으로 제공된 독일 연구 센터 (HGF)의 헬름홀츠 협회 (HGF)의 보조금에 의해 지원되었다 "암의 면역 요법"(HCC_WP2b).

모든 기술된 동물 실험은 지방 정부 기관에 의해 승인되었다 (니데르세흐시쉬 란데삼트 퓌르 Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; 파일 번호 33.12-42502-04-10/0108) 국가 및 기관 지침에 따라 수행되었다.
1. 하이브리드 종 세포주 NLDC-145에서 αDEC-205의 생산
<ol><li>항체 생산을 위해, 해동 극저온 보존 NLDC-145 세포는 수조에서 37°C에서 αDEC-205를 생산한다. 셀을 37°C 및 5% CO로 확장2</...

<ol>
	<li>Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+complete+repertoire+of+conventional+dendritic+cell+functions+for+cancer+immunotherapy.">Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy.</a> Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Wculek, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+cancer+immunology+and+immunotherapy.">Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy.</a> Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).</li><li>Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell-targeted+vaccines--hope+or+hype.">Dendritic cell-targeted vaccines--hope or hype.</a> Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).</li><li>Bonifaz, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+targeting+of+antigens+to+maturing+dendritic+cells+via+the+DEC-205+receptor+improves+T+cell+vaccination.">In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination.</a> Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).</li><li>Boscardin, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+targeting+to+dendritic+cells+elicits+long-lived+T+cell+help+for+antibody+responses.">Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses.</a> Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).</li><li>Hossain, M. K., Wall, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Dendritic+Cell+Receptors+as+Targets+for+Enhancing+Anti-Cancer+Immune+Responses.">Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses.</a> Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).</li><li>Johnson, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+melanoma+growth+by+targeting+of+antigen+to+dendritic+cells+via+an+anti-DEC-205+single-chain+fragment+variable+molecule.">Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule.</a> Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).</li><li>Trumpfheller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbial+mimic+poly+IC+induces+durable+and+protective+CD4++T+cell+immunity+together+with+a+dendritic+cell+targeted+vaccine.">The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).</li><li>Idoyaga, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparable+T+helper+1+(Th1)+and+CD8+T-cell+immunity+by+targeting+HIV+gag+p24+to+CD8+dendritic+cells+within+antibodies+to+Langerin,+DEC205,+and+Clec9A.">Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).</li><li>Sancho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+therapy+in+mice+via+antigen+targeting+to+a+novel,+DC-restricted+C-type+lectin.">Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+antigen+delivery+to+dendritic+cells+elicits+robust+antiviral+T+cell-mediated+immunity+in+the+liver.">Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver.</a> Scientific Reports. 7, 43985 (2017).</li><li>Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans'+cells,+veiled+cells,+and+interdigitating+cells+in+the+mouse+recognized+by+a+monoclonal+antibody.">Langerhans' cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STING+activator+c-di-AMP+exerts+superior+adjuvant+properties+than+the+formulation+poly(I:C)/CpG+after+subcutaneous+vaccination+with+soluble+protein+antigen+or+DEC-205-mediated+antigen+targeting+to+dendritic+cells.">The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells.</a> Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).</li></ol>

내분세포증 수용체 특이적 항체 및 단백질 항원의 화학적 결합은 임상 전 마우스 모델에서 생체 내 DC 표적화에 대한 효율적이고 또한 유연한 접근법을 제공한다. 우리의 프로토콜을 통해 우리는 모델 항원 OVA를 DEC-205 특이적 IgG 항체로 성공적으로 결합하기 위한 효율적인 접근법을 제공합니다.
우리의 프로토콜에서 αDEC-205는 혼종 세포주에서 정제되고 과거에, 우리는 ...

수지상 세포 (DC)는 면역 계통의 중앙 선수입니다. 그(것)들은 항원 프리젠 테이션에 전문화된 세포의 다양한 단이고 그들의 주요 기능은 선천적이고 적응성 면역1,2를다리를 하는 것입니다. 중요한 것은, DC는 효율적이고 특정 병원체 지향 반응에서 중요한 역할을 할 뿐만 아니라 항종양 면역1,3의많은 측면에 관여한다.
호스트 면역에서 그들의 독점적인 역할 때문에, DC는 백신접종4를위한 표적 세포로 집중하게 되었습니다. 한 가지 접근법은 항원 특이적 면역 반응을 유도하기 위해 생체 내에서 DC에 항원을 표적으로 하고 지난 몇 년 동안,많은 연구가 적합한 수용체를 정의하고 전략을1,4로지정하는 데 전념해 왔다. 한 가지 예는 C형 렉틴 수용체 DEC-205이며, 이는 내분비증을 유도하기 위해 DEC-205 특이적 항체에 의해 표적으로 할 수 있다. 중요한 것은, DEC-205 표적화는 적절한 보조제와 의 조합으로 수명이 다수 및 보호 CD4+ 및CD8+ T 세포뿐만 아니라 항체 반응뿐만 아니라, 종양 항원3,5,6,7,8,9에대해 효율적으로 유도하는 것으로 나타났다.
DC를 대상으로 한 공주항원을 보여주는 여러 연구가 있는데, 이는 공주항원3,5,10,11,12보다우수하다. 이를 통해 각 DC에 항원을 합산하여 DC 표적화 접근법의 중심 단계인 모이티를 표적으로 한다. 항체 또는 항체 단편을 통한 DC 표적화의 경우, 항원은 화학적으로 또는 유전적으로 연결될 수 있으며 어느 전략중 하나는 자체(dis)의 장점을제공한다. 한편, 유전자 조작된 항체-항원 구조에서는 로트1사이의 우수한 비교성을 제공하는 위치뿐만 아니라 항원 투여량에 대한 제어가 있다. 그러나 동시에 화학 적 융합은 더 적은 준비가 필요하며 특히 실험 및 전임상 모델에서 다른 항원 및 / 또는 예방 접종 전략을 테스트하고 비교하려고 할 때 더 많은 유연성을 제공합니다.
여기서, 우리는 OValbumin (OVA)의 효율적이고 신뢰할 수있는 화학 적 연상을 위한 프로토콜을 12-205 특이적 IgG2a 항체 (αDEC-205)로 단백질 항원으로 마우스에서 생체 내 DC 표적화에 적합한 프로토콜을 제시한다. 먼저, αDEC-205는 NLDC-145 혼종세포로부터 정제된다(13). 화학적 결합을 위해, 이트로비기능 크로스링커 설포시치니미딜 4-[N-maleimidomethyl] CYclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC), NHS (N-하이드록시스쿠니미드) 에스테르와 말리미드 군을 포함하는, 유자 결합을 허용- 유체 결합- 유체 - 유체 - 분자의 결합을 허용. 구체적으로, 항체의 1차 아민은 처음에 황포-SMCC와 반응하고 그 결과 남성-염활성 αDEC-205는 TCEP-HCl(Tris(2-carboxyethyl) 인산염염을 통해 감소된 황피드릴 함유 OVA 단백질과 반응한다. 최종 제품은 화학적으로 cojujugated αDEC-205/OVA(그림 1). 화학 적 공짜 자체를 넘어, 우리의 프로토콜은 공자에서 과잉 OVA의 제거뿐만 아니라 서쪽 얼룩 분석 및 특정 효소 연결 면역 소르벤트 분석을 통해 성공적인 컨쥬게이션의 검증을 설명합니다. 우리는 성공적으로 αDEC-205에 OVA 및 그밖 단백질 또는 면역원성 펩티드를 화학적으로 컨쥬게이트하기 위하여 과거에 이 접근을 성공적으로 채택했습니다. 우리는 생체 내 의 CD11c+ 세포뿐만 아니라 생체 내세포 및 유머 면역의 효율적인 유도에 효율적인 결합을 입증한다.
확실히, 최종 컨쥬게이트 내에서 항원의 정확한 투약에 로트-투-로트 비교및 와 같은 이 방법에 대한 단점이 있다. 그럼에도 불구하고, 화학 적 융합은 유전자 조작 된 구조에 비해 항체 및 단백질 항원의 선택에 실험적 유연성을 제공합니다. 따라서, 우리는 이 접근법이 임상 전 마우스 모형에 있는 DC 표적화에 있는 그들의 효율성을 위해 다른 항원 평가에 특히 가치가 있다고 믿습니다, 또한 특정 항종양 면역 반응의 맥락에서.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibody buffer 2 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody buffer 5 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % FBS in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 4 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 10 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T25</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>690175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T75</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR&#160; filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T175</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>661175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal concentrator MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2001</td>
			<td>Vivaspin 20 centrifugal concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88532</td>
			<td>Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>525-2314</td>
			<td>PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coating buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desalting columns MWCO 7 kDa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89891</td>
			<td>Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent ELISA (HRPO substrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>T8665-100ML</td>
			<td>3,3&#8242;,5,5&#8242;-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent western blot (HRPO substrate)</td>
			<td>Roche/Merck</td>
			<td>12 015 200 01</td>
			<td>Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa</td>
			<td>SERVA Electrophoresis</td>
			<td>44110</td>
			<td>Visking dialysis tubing, 16 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA 96-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td>MaxiSorp Nunc-Immuno Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum</td>
			<td>PAN-BIOtech</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>FBS Good forte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISF-1 medium</td>
			<td>Biochrom/bioswisstec</td>
			<td>F 9061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145.2</td>
			<td>powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLDC-145 hybridoma</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-290</td>
			<td>if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-reducing SDS sample buffer 4 x&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 &#181;l 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 &#181;l of 5 % Bromphenol Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ovalbumin</td>
			<td>Hyglos (via BioVendor)</td>
			<td>321000</td>
			<td>EndoGrade OVA ultrapure with &#60;0.1 EU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles</td>
			<td>Nunc In Vitro</td>
			<td>734-2394</td>
			<td>standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm&#178;, 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109535</td>
			<td>pH indicator strips 0-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG(H+L)-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-062</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG+IgM-HRPO antibody&#160; (ELISA)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-068</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rabbit-IgG-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>111-035-045&#160;</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA (ELISA)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181688</td>
			<td>used at 3 ng/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA antibody (western blot)</td>
			<td>OriGene</td>
			<td>R1101</td>
			<td>used at 1:3,000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose column</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>P3296</td>
			<td>5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td>PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber plug</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5230217</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN rubber stoppers (lower &#934; 17 mm; upper &#934; 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone tube</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5430925</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN (inside &#934; 1 mm; outer &#934; 3 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim-Fast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopping solution (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M H2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22322</td>
			<td>Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter unit 0.22 &#181;m&#160;</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe 10 ml</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Disposable syringes Injekt&#174; Solo B.Braun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican&#174; cannulas</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td></td>
			<td>Sterican&#174; G 20 x 1 1/2&#34;&#34;; 0.90 x 40 mm; yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A35349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing connector</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo

생체 내에서 수지상 세포(DC)를 교차 제시하는 표적 항원 전달은 T 이펙터 세포 반응을 효율적으로 유도하고 백신 설계에 있어 귀중한 접근법을 표시한다. 항원은 섭취량, 처리 및 MHC 급 I-및 II-프레젠테이션을 유도하는 DEC-205와 같은 내분비수용체에 특이적 항체를 통해 DC에 전달된다.
적합한 항체에 원하는 항원을 효율적이고 신뢰할 수 있는 유도는 DC 표적화에 중요한 단계이며 다른 요인들 사이에서는 항원의 형식에 달려 있다. 정제된 항체에 대한 전길이 단백질의 화학적 융합은 하나의 가능한 전략이다. 과거에는 마우스에서 생체내 DC 표적 연구를 위한 모델 항원 ovalbumin(OVA)과 DEC-205 특이적 IgG2a 항체(αDEC-205)의 교차 연결을 성공적으로 확립했습니다. 프로토콜의 첫 번째 단계는 NLDC(비 림프수성 수지상 세포)-145 hybridoma의 상퍼상에서 항체의 정제이다. 정제된 항체는 설포-SMCC(설포스쿠치니미딜 4-[N-maleimidomethyl] 사이클로헥산-1-카박스실레이트)에 의해 화학적 결합을 위해 활성화되는 동시에 OVA 단백질의 황피드릴-그룹은 TCEP-HCl(2-카로이)을 가진 배양을 통해 노출된다. 과잉 TCEP-HCl 및 설포-SMCC는 제거되고 항원들은 밤새 결합을 위한 활성 항체와 혼합된다. 생성된 αDEC-205/OVA 컨쥬게이트는 비바운드 OVA에서 농축되고 해방됩니다. ΑDEC-205에 대한 OVA의 성공적인 결합은 서양 블롯 분석 및 효소 연계 면역소벤트 분석(ELISA)에 의해 검증된다.
우리는 성공적으로 간에서 세포 독성 T 세포 반응을 유도하고 DEC-205+ DC의 생체 내 표적에 따라 유머 및 세포 면역을 유도에 자신의 잠재력에 대한 다른 보조제를 비교하기 위해 화학적으로 교차 αDEC-205 / OVA를 사용했다. 그 외에도, 이러한 화학적으로 결합된 항체/항원 접합체는 종양 항원에 대한 백신 반응의 효율적인 유도를 위한 귀중한 도구를 제공하며 다양한 유형의 종양의 예방 및 치료에 관한 고전적인 예방 접종 접근법보다 우수하다는 것이 입증되었습니다.

αDEC-205를 이 프로토콜을 사용하여 OVA 단백질에 대한 화학적 융합은 일반적으로 생체 내 DC 표적화 접근법에 대한 αDEC-205/OVA의 효율적인 생성을 허용할 것이다. 기술 자체를 확인하고 산출된 컨쥬게이트의 기능을 테스트하기 위한 다양한 전략이 있습니다. 서양 블롯 분석 및 ELISA는 성공적인 컨쥬게이션을 검증하는 데 사용되며 동시에 잠재적으로 자유<strong class="xfig...

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Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

당사는 생체 내 수지상 세포 표적화를 위한 내분균 수용체 특이적 항체에 대한 모델 항원 배부안의 화학적 결합을 위한 프로토콜을 기술한다. 이 프로토콜은 항체의 정제, 항원의 화학적 융합, 공자의 정제 및 효율적인 유도의 검증을 포함한다.

체외 및 비보에서 마우스 수지상 세포를 대상으로 하는 전체 길이 단백질을 가진 정제 된 DEC-205 지향 항체의 화학 적 융합

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

모든 실험 조건이 신중하게 최적화된 이 프로토콜은 OVA 항원에게 DEC-205 항체의 성공적이고 효율적인 화학적 활용을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 이 기술의 주요 장점은 단백질 항원 및 항체의 유연한 선택을 허용하고, 이러한 성분의 유전 적 융합에 의존하지 않는다는 것입니다. 우리는 또한 생체 내 DC 표적화를 위해 C형 간염 바이러스 단백질 및 반대로 DEC-205의 접합을 생성하기 위하여 이 프로토콜을 이용했습니다.이것은 마찬가지로 항 종양 예방 접종 접근에 가치가있을 수 있습니다. 반DEC-205 생산을 시작하려면, 1~500만 개의 해동 된 극저온 으로 보존된 NLDC 145 세포는 섭씨 37도ISF-1 배지에서 1%페니실린과 연쇄상 구균으로 보충하고, 세포를 37°C에서 배양하고 5%의 이산화탄소를 2시간 동안 배양하기 위해 세포를 시드한다. 세포가 70%의 합류에 도달하면 전체 세포 현탁액을 15밀리리터 원문 튜브로 옮기고 원심분리에 의해 세포를 수집합니다.펠릿을 12밀리리터의 신선한 완전한 37도 ISF-1 배지로 재보페판하고 75 평방 센티미터 플라스크에서 세포를 다시 플레이트한다. 48~72시간의 문화가 끝나면 70%의 컨실린 문화를 각각 75평방센티미터의 플라스크로 나누고, 각 플라스크에 6밀리리터의 신선한 완전한 ISF-1 배지를 추가합니다. 배양이 70%에 도달하면 10밀리리터 파이펫을 사용하여 세포 배양 플라스크 바닥과 배양 표면을 세포 현탁액으로 플러시하여 모든 세포를 수집하고 확장된 각 NLDC 145 셀 서스펜션의 10 밀리리터를 개별 PETG 롤러 병으로 전송합니다.그런 다음 각 롤러 병 문화에 140 밀리리터의 완전한 ISF-1 배지를 추가하고 3 일 동안 37섭씨 37도, 이산화탄소 5 %, 분당 25 라운드에서 롤러 병을 배양합니다. NLDC 145 상체체로부터의 항체 정제를 위해 실리콘 튜브의 끝을 상체 채워진 비커에 넣고 800 밀리리터의 슈퍼나트리터가 단백질 G 세파로즈 컬럼을 통해 드롭방향으로 달릴 수 있도록 한다. 용출의 경우, 1.5 개의 어금니 트리스-HCL의 100 마이크로 리터를 각각 20 개의 1.5 밀리리터 튜브에 넣고 컬럼에서 고무 플러그를 제거하십시오.0.1 의 어금니 글리신을 컬럼의 상부 챔버로 옮기고, 제조된 1.5 밀리리터 튜브 중 하나에 용액을 함유하는 항체를 수집하고 각 튜브에 대해 반복한다. 모든 항체가 수집되고 항체 함유 용출이 풀링되면 적절한 투석 튜브 클로빙으로 20센티미터 길이투석 튜브의 바닥을 닫고 항체 용출을 튜브로 조심스럽게 피펫합니다. 투석 튜브의 상단을 두 번째 클램프로 닫고 투석 튜브의 상부 클램프를 부동 스탠드에 고정합니다.PBS의 비커에 마그네틱 스터드 바를 추가하고 비커를 자기 교반기 위에 놓습니다. 섭씨 4도에서 야간 투석 후, 10킬로달톤의 분자량 차단으로 원심 농축기로 완전한 투석기를 적재할 수 있도록 한 클램프를 열고, 농축기를 693회 G와 섭씨 4도에서 30분 동안 원심분리합니다. 스핀의 끝에서, 항체 용액의 최종 1~1.5 밀리리터 부피가 얻어지날 때까지 두 번째 원심분리를 위해 PBS의 10 밀리리터를 가진 원심 농축기를 적재한다.OVA를 안티 DEC-205 항체에 결합하려면 OVA 단백질 500 마이크로그램, 갓 준비된 TCEP-HCL 용액 240마이크로리터, 멸균 초순수 560마이크로리터를 1.5밀리리터 튜브에 1.5밀리리터 튜브에 첨가하여 실내 온도에서 1.5시간 동안 사용할 수 있습니다. 동시에 PBS 900 마이크로리터에 2.5밀리그램의 안티 DEC-205와 갓 준비된 설포-SMCC 100마이크로리터를 1.5밀리리터 튜브에 넣고 분당 550회전에서 섭씨 37도에서 30분 동안 배양할 수 있습니다. 인큐베이션의 끝에서, 탈염 컬럼을 느슨하게 한 캡으로 놓고 바닥을 꼬인 개별 15 밀리리터 원모 튜브로 놓고 컬럼을 원심분리하여 액체를 제거합니다.원심분리 후, 캡을 제거한 채 새로운 튜브에 컬럼을 배치하고, 항체 설포-SMCC 및 OVA TCEP-HCL 용액당 하나의 컬럼의 소형 수지 베드의 중심에 천천히 적재한다. 원심 분리 후 컬럼을 폐기하고 항체및 OVA 용액을 부드러운 파이펫팅과 즉시 혼합합니다. 반 DEC-205/OVA 용액을 원심 단백질 농축기에 적재하고 PBS로 농축기를 15 밀리리터 부피로 채웁니다.2, 000배 G 및 실온에서 5분 동안 농축기를 원심분리하고 PBS의 10밀리리터를 추가로 농축기를 채웁니다. 동일한 원심분리기 조건하에서 적어도 8분 동안 농도를 원심분리한 후, 상부 챔버에서 농축된 샘플을 부드럽게 수집한다. 서양 블롯 분석에 의한 컨쥬게이션의 성공을 확인하기 위해 각 샘플의 알리쿼트를 단백질 표준에 SDS 젤에 적재하고 표준 SDS-PAGE 분석 프로토콜에 따라 겔을 실행합니다.젤 블로팅 후, 표준 프로토콜에 따라 반 DEC-205 또는 OVA를 검출하기 위해 고추냉이 과산화증을 결합한 항체로 막을 얼룩지게 한다. 막은 각 샘플에서 각각의 단백질의 존재를 위해 분석될 수 있다. ELISA의 결합의 성공을 확인하기 위해, 적절한 96-웰 ELISA 플레이트를 잘 당 안티 OVA 항체의 100 마이크로리터로 코팅하고 1 대 2 비율로 안티 DEC-205 / OVA를 연속적으로 희석하고 블로킹 버퍼는 밀리리터 당 6 마이크로 그램에서 93.8 나노 그램으로 희석을 얻을 수 있습니다.실온에서 1시간 배양하기 위해 항체 코팅 플레이트의 적절한 웰에 각 희석제 100마이크로리터를 추가합니다. 인큐베이션의 끝에서, 실온에서 1시간 배양을 위해 접시에 반DEC-205/OVA 공자에 대해 고추냉이 과산화제 공자 100마이크로리터를 첨가한 다음, 각 기수과 구산염기기의 50 마이크로리터를 추가하여 색소분석에 의한 색반응의 분석을 허용한다. 병렬 웨스턴 블롯 분석은 공주 된 OVA뿐만 아니라 공주 된 반 DEC-205를 모두 검출하는 데 사용할 수 있습니다.OVA에 대한 염색은 존재하는 경우 과도한 무료 OVA의 검출을 허용하고, 안티 DEC-205에 대한 염색은 벌거 벗은 안티 DEC-205 및 공주 사이의 분자량의 증가를 통해 결합의 성공을 검증한다. ELISA는 또한 검출된 신호와 분석된 단백질의 양 사이의 양립과의 결합을 통해 결합의 성공을 평가하는 데 사용될 수 있으며, 이는 항 DEC-205/OVA 연상의 성공적인 생성을 나타낸다. 유동 세포질 및 면역형광 분석은 항 DEC-205 코어가 골수 유래 CD11c 양성 세포를 효율적으로 결합한다는 것을 명확하게 보여줍니다.보조와 함께 항 DEC-205/OVA를 접종하면 OVA 및 보조인과 의한 예방 접종에 비해 마우스 수신자의 OVA 별 IgG 티터의 증가를 유도합니다. 더욱이, 안티-DEC-205/OVA는 반DEC-205/OVA 유도 CD8 양성 T 세포 반응을 통해 과도하게 특이적인 CD4 및 CD8 양성 T 세포 반응을 효과적으로 유도하여 OVA단독으로 유도한 반응을 현저히 초과한다. 항DEC-205 항체에 OVA 항원의 성공적인 유도를 위해, 입증된 바와 같이 물질을 준비하고 일관된 조건하에서 유도 단계를 수행하는 것이 중요하다.항원 및 항체의 성공적인 컨쥬션에 이어, 생체 내에서 병원체 또는 종양 관련 면역의 결합 분석 및 유도를 포함한 수많은 후속 접근법이 가능하다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

체외 이미징 및 형광 표지의 GnRH 유사체의 약물 표적 효율성의 정량에서

GnRH analogues are effective targeting moieties and able to deliver anticancer agents selectively into malignant tumor cells which highly express GnRH ...

연구

암 연구학

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

폐 선 암 세포에서 생체 외에서 2 단계 복용량 단계적 확대 절차와 EGFR TKI와 만난 TKI 듀얼 저항 설정

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

주소 지정이 가능한 물방울 Microarrays 단일 셀에서 단백질을 계산

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

위쪽으로 이동: 간단 하 고 유연한 생체 외에서 3 차원 침공 분석 실험 프로토콜

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Vivo에서 PH, pO2, 산화 환 원 상태, 고 농도의 인산 염 및 종양 Microenvironment에 티의 EPR 평가

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

마우스 Monocyte 파생 된 모 수석 세포 및 종양 면역 단지와 활성화 후속 생체 외에서 그들의 격리 프로토콜

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

GPC3 대상으로 Bispecific 항 체, GPC3-S-팹, 강력한 세포 독성을

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

전립선 암에 있는 Phosphoproteome를 조사 하기 위해 양적 라벨 무료 질량 분석으로 결합 된 Phosphopeptide 농축

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

암 연구에서 치료 및 진단 항체 바이오 유통 평가를 위한 생체내 면역형광 국소화

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

제브라피시에 기능성 형광 실리카 나노입자를 가진 제노이식 인간 암세포의 생체 내 표적화

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...