Name: chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo
Uploaded: 2021-02-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Os autores agradecem a S. Prettin pela assistência técnica especializada. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Associação Helmholtz de Centros de Pesquisa Alemães (HGF) que foi fornecida como parte da "Imunoterapia dos Cânceres" da Aliança Helmholtz (HCC_WP2b).

Todos os experimentos animais descritos foram aprovados pela agência do governo local (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; arquivo número 33.12-42502-04-10/0108) e foram realizados de acordo com as diretrizes nacionais e institucionais.
1. Produção de αDEC-205 a partir da linha celular hybridoma NLDC-145
<ol><li>Para a produção de anticorpos, descongele as células NLDC-145 que produzem αDEC-205 a 37 °C em banho-maria. Expanda as células ...

<ol>
	<li>Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+complete+repertoire+of+conventional+dendritic+cell+functions+for+cancer+immunotherapy.">Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy.</a> Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Wculek, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+cancer+immunology+and+immunotherapy.">Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy.</a> Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).</li><li>Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell-targeted+vaccines--hope+or+hype.">Dendritic cell-targeted vaccines--hope or hype.</a> Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).</li><li>Bonifaz, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+targeting+of+antigens+to+maturing+dendritic+cells+via+the+DEC-205+receptor+improves+T+cell+vaccination.">In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination.</a> Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).</li><li>Boscardin, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+targeting+to+dendritic+cells+elicits+long-lived+T+cell+help+for+antibody+responses.">Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses.</a> Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).</li><li>Hossain, M. K., Wall, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Dendritic+Cell+Receptors+as+Targets+for+Enhancing+Anti-Cancer+Immune+Responses.">Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses.</a> Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).</li><li>Johnson, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+melanoma+growth+by+targeting+of+antigen+to+dendritic+cells+via+an+anti-DEC-205+single-chain+fragment+variable+molecule.">Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule.</a> Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).</li><li>Trumpfheller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbial+mimic+poly+IC+induces+durable+and+protective+CD4++T+cell+immunity+together+with+a+dendritic+cell+targeted+vaccine.">The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).</li><li>Idoyaga, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparable+T+helper+1+(Th1)+and+CD8+T-cell+immunity+by+targeting+HIV+gag+p24+to+CD8+dendritic+cells+within+antibodies+to+Langerin,+DEC205,+and+Clec9A.">Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).</li><li>Sancho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+therapy+in+mice+via+antigen+targeting+to+a+novel,+DC-restricted+C-type+lectin.">Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+antigen+delivery+to+dendritic+cells+elicits+robust+antiviral+T+cell-mediated+immunity+in+the+liver.">Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver.</a> Scientific Reports. 7, 43985 (2017).</li><li>Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans'+cells,+veiled+cells,+and+interdigitating+cells+in+the+mouse+recognized+by+a+monoclonal+antibody.">Langerhans' cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STING+activator+c-di-AMP+exerts+superior+adjuvant+properties+than+the+formulation+poly(I:C)/CpG+after+subcutaneous+vaccination+with+soluble+protein+antigen+or+DEC-205-mediated+antigen+targeting+to+dendritic+cells.">The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells.</a> Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).</li></ol>

A conjugação química de um anticorpo específico do receptor de endocitose e um antígeno proteico fornece uma abordagem eficiente e, importante, também flexível para o direcionamento in vivo DC em modelos pré-clínicos de camundongos. Com nosso protocolo, fornecemos uma abordagem eficiente para a conjugação bem sucedida do modelo de antígeno OVA a um anticorpo IgG específico DEC-205.
Em nosso protocolo, αDEC-205 é purificado de uma célula híbrida e, no passado, purifica...

As células dendríticas (DC) são atores centrais do sistema imunológico. Tratam-se de um grupo diversificado de células especializadas em apresentação de antígenos e sua principal função é fazer a ponte entre imunidade inata e adaptativa1,2. É importante ressaltar que a DC não só desempenha um papel importante em respostas eficientes e específicas dirigidas por patógenos, mas também está envolvida em muitos aspectos da imunidade antitumoral1,3.
Devido ao seu papel exclusivo na imunidade do hospedeiro, a DC entrou em foco como células-alvo paraa vacinação 4. Uma abordagem é direcionar antígenos para DC in vivo para induzir respostas imunes específicas de antígenos e, nos últimos anos, um grande número de estudos tem sido dedicado à definição de receptores adequados e estratégias de segmentação1,4. Um exemplo é o receptor de lectina tipo C DEC-205, que pode ser alvo de anticorpos específicos DEC-205 para induzir a endocitose. É importante ressaltar que o alvo DO DEC-205 na combinação com adjuvantes adequados tem sido mostrado para induzir eficientemente células CD4+ e CD8+ T de longa duração, bem como respostas de anticorpos, também contra antígenos tumorais3,5,6,7,8,9.
Há uma série de estudos que mostram que antígenos conjugados direcionados à DC são superiores ao antígeno não conjugadolivre 3,5,10,11,12. Isso torna a conjugação do antígeno para o respectivo DC visando moiety um passo central nas abordagens de segmentação dc. No caso do direcionamento dc via anticorpos ou fragmentos de anticorpos, os antígenos podem ser quimicamente ou geneticamente ligados e qualquer estratégia fornece suas próprias (des)vantagens1. Por um lado, em construções de anticorpos-antígenos geneticamente modificados há um controle sobre a dose de antígeno, bem como a localização proporcionando comparabilidade superior entre os lotes1. Ao mesmo tempo, no entanto, a conjugação química precisa de menos preparação e proporciona mais flexibilidade especialmente na tentativa de testar e comparar diferentes antígenos e/ou estratégias de vacinação em modelos experimentais e pré-clínicos.
Aqui, apresentamos um protocolo para a conjugação química eficiente e confiável de ovalbumin (OVA) como um antígeno de proteína modelo para um anticorpo IgG2a específico DEC-205 (αDEC-205) adequado para o direcionamento in vivo DC em camundongos. Primeiro, o αDEC-205 é purificado a partir de células hybridoma NLDC-14513. Para conjugação química, é utilizado o sulfosuccinimidil heterobifuncional 4-[N-maleimidomethyl] ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC), que contém os grupos de ester e maleiminimide n-hidroxisuccinimide( N-hidroxisuccinimide), permitindo a conjugação covalente de moléculas de amina e sulfidry-constitucional. Especificamente, as aminas primárias do anticorpo inicialmente reagem com sulfo-SMCC e o αDEC-205 ativado por maleimida resultante, então reage com a proteína OVA contendo sulfidryl reduzida através do CLOP-HCl (Tris(2-carboxyethyl) cloridrato. O produto final é quimicamente conjugado αDEC-205/OVA (Figura 1). Além da conjugação química em si, nosso protocolo descreve a remoção do excesso de OVA do conjugado, bem como a verificação da conjugação bem sucedida através da análise de manchas ocidentais e um ensaio imunológico específico ligado à enzima. Nós empregamos com sucesso essa abordagem no passado para conjugar quimicamente OVA e outras proteínas ou peptídeos imunogênicos para αDEC-205. Demonstramos vinculação eficiente às células CD11c+ in vitro, bem como a eficiente indução da imunidade celular e humoral in vivo.
Certamente, há desvantagens para este método, como na comparabilidade lot-to-lot e na dosagem exata do antígeno dentro do conjugado final. No entanto, a conjugação química proporciona flexibilidade experimental na escolha do anticorpo e do antígeno proteico em comparação com construções geneticamente modificadas. Portanto, acreditamos que essa abordagem é especialmente valiosa na avaliação de diferentes antígenos para sua eficiência na segmentação dc em modelos pré-clínicos de camundongos, importante também no contexto de respostas imunes antitumorais específicas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibody buffer 2 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody buffer 5 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % FBS in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 4 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 10 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T25</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>690175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T75</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR&#160; filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T175</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>661175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal concentrator MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2001</td>
			<td>Vivaspin 20 centrifugal concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88532</td>
			<td>Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>525-2314</td>
			<td>PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coating buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desalting columns MWCO 7 kDa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89891</td>
			<td>Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent ELISA (HRPO substrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>T8665-100ML</td>
			<td>3,3&#8242;,5,5&#8242;-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent western blot (HRPO substrate)</td>
			<td>Roche/Merck</td>
			<td>12 015 200 01</td>
			<td>Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa</td>
			<td>SERVA Electrophoresis</td>
			<td>44110</td>
			<td>Visking dialysis tubing, 16 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA 96-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td>MaxiSorp Nunc-Immuno Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum</td>
			<td>PAN-BIOtech</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>FBS Good forte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISF-1 medium</td>
			<td>Biochrom/bioswisstec</td>
			<td>F 9061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145.2</td>
			<td>powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLDC-145 hybridoma</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-290</td>
			<td>if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-reducing SDS sample buffer 4 x&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 &#181;l 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 &#181;l of 5 % Bromphenol Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ovalbumin</td>
			<td>Hyglos (via BioVendor)</td>
			<td>321000</td>
			<td>EndoGrade OVA ultrapure with &#60;0.1 EU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles</td>
			<td>Nunc In Vitro</td>
			<td>734-2394</td>
			<td>standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm&#178;, 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109535</td>
			<td>pH indicator strips 0-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG(H+L)-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-062</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG+IgM-HRPO antibody&#160; (ELISA)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-068</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rabbit-IgG-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>111-035-045&#160;</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA (ELISA)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181688</td>
			<td>used at 3 ng/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA antibody (western blot)</td>
			<td>OriGene</td>
			<td>R1101</td>
			<td>used at 1:3,000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose column</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>P3296</td>
			<td>5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td>PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber plug</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5230217</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN rubber stoppers (lower &#934; 17 mm; upper &#934; 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone tube</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5430925</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN (inside &#934; 1 mm; outer &#934; 3 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim-Fast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopping solution (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M H2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22322</td>
			<td>Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter unit 0.22 &#181;m&#160;</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe 10 ml</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Disposable syringes Injekt&#174; Solo B.Braun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican&#174; cannulas</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td></td>
			<td>Sterican&#174; G 20 x 1 1/2&#34;&#34;; 0.90 x 40 mm; yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A35349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing connector</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo

A entrega de antígenos direcionados para células dendríticas de apresentação cruzada (DC) in vivo in vivo induz eficientemente as respostas celulares de efeito T e exibe uma abordagem valiosa no design da vacina. O antígeno é fornecido em DC através de anticorpos específicos para receptores de endocitose, como o DEC-205, que induz a captação, processamento e apresentação da classe I e II do MHC.
A conjugação eficiente e confiável do antígeno desejado para um anticorpo adequado é um passo crítico na segmentação dc e, entre outros fatores, depende do formato do antígeno. A conjugação química de proteína de comprimento total para anticorpos purificados é uma estratégia possível. No passado, estabelecemos com sucesso a inter-vinculação do modelo antigen ovalbumin (OVA) e um anticorpo IgG2a específico DEC-205 (αDEC-205) para estudos in vivo DC direcionados em camundongos. O primeiro passo do protocolo é a purificação do anticorpo do supernacante do NLDC (células dendríticas não linfoides)-145 hibrim por cromatografia de afinidade. O anticorpo purificado é ativado para conjugação química por sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] ciclohexano-1-carboxilato) enquanto ao mesmo tempo os grupos de sulfhydryl da proteína OVA são expostos através de incubação com TCEP-HCl (tris (tris (2 carboxyethyl). O excesso de TCEP-HCl e sulfo-SMCC são removidos e o antígeno é misturado com o anticorpo ativado para acoplamento durante a noite. O conjugado αDEC-205/OVA resultante é concentrado e liberado de OVA não vinculado. A conjugação bem sucedida de OVA para αDEC-205 é verificada pela análise de manchas ocidentais e ensaio imunosorbente ligado à enzima (ELISA).
Usamos com sucesso αDEC-205/OVA quimicamente cruzado para induzir respostas de células T citotóxicas no fígado e comparar diferentes adjuvantes para seu potencial em induzir imunidade humoral e celular após o direcionamento vivo do DEC-205+ DC. Além disso, esses conjugados quimicamente acoplados a anticorpos/antígenos oferecem ferramentas valiosas para a indução eficiente das respostas vacinais aos antígenos tumorais e têm sido comprovadamente superiores às abordagens clássicas de imunização em relação à prevenção e terapia de vários tipos de tumores.

A conjugação química da proteína αDEC-205 para o OVA usando este protocolo normalmente permitirá uma geração eficiente de αDEC-205/OVA para abordagens de segmentação in vivo DC. Existem diferentes estratégias para verificar a técnica em si e testar a funcionalidade do conjugado rendido. A análise da mancha ocidental e o ELISA são usados para verificar a conjugação bem sucedida e, ao mesmo tempo, detectar OVA potencialmente deixado livre(Figur...

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Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Descrevemos um protocolo para a conjugação química do modelo de ovalbumin de antígeno para um anticorpo específico do receptor de endocitose para o direcionamento de células dendríticas in vivo. O protocolo inclui a purificação do anticorpo, a conjugação química do antígeno, bem como a purificação do conjugado e a verificação de uma conjugação eficiente.

Conjugação Química de um anticorpo purificado DEC-205-Directed com proteína de comprimento completo para direcionar células dendríticas de camundongos in vitro e in vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

Este protocolo para o qual toda a condição experimental foi cuidadosamente otimizada pode ser usado para facilitar uma conjugação química bem sucedida e eficiente do anticorpo DEC-205 ao antígeno OVA. As principais vantagens dessa técnica são que permite uma seleção flexível do antígeno e anticorpos proteicos, e que não depende da fusão genética desses componentes. Também usamos este protocolo para gerar conjugados de proteínas do vírus da hepatite C e anti-DEC-205 para segmentação in vivo DC.Isso também pode ser valioso para abordagens de vacinação anti-tumor. Para iniciar a produção anti-DEC-205, resuspenque um volume de um mililitro de uma a cinco milhões de células NLDC 145 conservadas em nove mililitros de 37 graus Celsius ISF-1 médio suplementado com penicilina de 1%e estreptomicina, e semeou as células em um frasco de cultura celular de 25 centímetros quadrados para incubação a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 a 48 horas. Quando as células atingirem 70% de confluência, transfira toda a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros e colete as células por centrifugação.Resuspenque a pelota em 12 mililitros de meio ISF-1 completo fresco de 37 graus e re-emplaque as células em um frasco de 75 centímetros quadrados. Após 48 a 72 horas de cultura, divida a cultura 70% confluente entre cada um dos dois novos frascos de 75 centímetros quadrados e adicione seis mililitros de meio ISF-1 completo fresco a cada frasco. Quando as culturas atingirem 70% de confluência, use uma pipeta de 10 mililitros para lavar os fundo do frasco de cultura celular e superfícies de cultura com a suspensão celular para coletar todas as células e transferir 10 mililitros de cada suspensão celular NLDC 145 expandida para garrafas de rolo PETG individuais.Em seguida, adicione 140 mililitros de meio ISF-1 completos a cada cultura de garrafa de rolo e cultura as garrafas de rolo a 37 graus Celsius, 5% dióxido de carbono e 25 rodadas por minuto durante três dias. Para purificação de anticorpos do nldc 145 supernante, coloque a extremidade de um tubo de silício no béquer recheado de supernasce e permita que 800 mililitros de supernante corram em sentido baixo através de uma coluna protein G Sepharose. Para eluição, adicione 100 microlitres de 1,5 molar Tris-HCL em cada um dos vinte tubos de 1,5 mililitro e remova o plugue de borracha da coluna.Transfira um mililitro de 0,1 glicina molar para a câmara superior da coluna e colete o anticorpo contendo eluent em um dos tubos preparados de 1,5 mililitro e repita para cada tubo. Quando todo o anticorpo tiver sido coletado e as eluções contendo anticorpos tiverem sido agrupadas, feche o fundo de uma tubulação de diálise de 20 centímetros de comprimento com um fechamento apropriado de tubos de diálise, e cuidadosamente pipeta a eluição de anticorpos na tubulação. Feche a parte superior da tubulação de diálise com um segundo grampo e fixe o grampo superior da tubulação de diálise em um suporte flutuante.Adicione uma barra de agitação magnética a um béquer de PBS e coloque o béquer em um agitador magnético. Após a diálise durante a noite a quatro graus Celsius, abra um grampo para permitir o carregamento do dialiseto completo a um concentrador centrífuga com um corte de peso molecular de 10 quiloDalton, e centrifugar o concentrador por 30 minutos a 693 vezes G e quatro graus Celsius. No final do giro, carregue o concentrador centrífuga com 10 mililitros de PBS para uma segunda centrifugação até que um volume final de 1,5 mililitro de solução de anticorpos seja obtido.Para conjugar OVA ao anticorpo anti-DEC-205, adicione 200 microliters de PBS suplementados com 500 microgramas de proteína OVA, 240 microliters de uma solução TCEP-HCL recém-preparada e 560 microliters de água ultrapura estéril a um tubo de 1,5 mililitro para uma incubação de 1,5 horas em temperatura ambiente. Ao mesmo tempo, adicione 2,5 miligramas de anti-DEC-205 em 900 microliters de PBS e 100 microliters de sulfo-SMCC recém-preparado a um segundo tubo de 1,5 mililitro para uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius a 550 rotações por minuto em um bloco de aquecimento. No final das incubações, coloque colunas desalagem com tampas soltas e torcidos de fundo em tubos cônicos individuais de 15 mililitros, e centrifugar as colunas para remover o líquido.Após a centrifugação, coloque as colunas em novos tubos com as tampas removidas e carregue lentamente as soluções de anticorpo sulfo-SMCC e OVA TCEP-HCL para o centro do leito de resina compacta de uma coluna por solução. Após a centrifugação, descarte as colunas e misture imediatamente as soluções de anticorpos e OVA com tubulação suave. Carregue a solução anti-DEC-205/OVA em um concentrador de proteína centrífuga e encha o concentrador com PBS a um volume de 15 mililitros.Centrifugar o concentrador por cinco minutos a 2.000 vezes g e temperatura ambiente e encher o concentrador com mais 10 mililitros de PBS. Depois de centrifugar a concentração por pelo menos oito minutos sob as mesmas condições centrífugas, colecione suavemente a amostra concentrada da câmara superior. Para verificar o sucesso da conjugação pela análise de manchas ocidentais, carregue uma alíquota de cada amostra em um padrão de proteína em um gel SDS e execute o gel de acordo com os protocolos padrão de análise SDS-PAGE.Após a mancha de gel, colorique as membranas com anticorpos conjugados peroxidase de rabanete para detectar anti-DEC-205 ou OVA de acordo com os protocolos padrão. As membranas podem então ser analisadas para a presença da respectiva proteína em cada amostra. Para verificar o sucesso da conjugação pela ELISA, cubra uma placa ELISA apropriada de 96 poços com 100 microlitres do anticorpo anti-OVA por poço e dilui o anti-DEC-205/OVA em uma razão de um a dois e bloqueando o buffer para obter diluições de seis microgramas por mililitro a 93,8 nanogramas por mililitro.Adicione 100 microlitres de cada diluição aos poços apropriados da placa revestida de anticorpos para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente. Ao final da incubação, adicione 100 microliters de anticorpo conjugado peroxidase de rabanete contra o conjugado anti-DEC-205/OVA à placa para uma incubação de uma hora à temperatura ambiente, em seguida, adicione 50 microliters de substrato de peroxidase de rabanete a cada poço para permitir a análise da reação de cor por espectrometphotoria. A análise paralela da mancha ocidental pode ser usada para detectar tanto oVA conjugado quanto anti-DEC-205 conjugado.A coloração para OVA permitiria a detecção de OVA livre em excesso se presente, e a coloração para anti-DEC-205 verifica o sucesso da conjugação através de um aumento no peso molecular entre o anti-DEC-205 nu e o conjugado. A ELISA também pode ser utilizada para avaliar o sucesso da conjugação com uma associação positiva entre o sinal detectado e a quantidade analisada de proteína indicando a geração bem sucedida de conjugantes anti-DEC-205/OVA. A análise de citometria e imunofluorescência do fluxo mostra claramente que o núcleo anti-DEC-205 liga eficientemente células CD11c-positivas derivadas da medula óssea.A vacinação com anti-DEC-205/OVA em conjunto com o adjuvante induz um aumento de títulos de IgG específicos de OVA em receptores de camundongos em comparação com a vacinação com OVA e adjuvante sozinho. Além disso, o anti-DEC-205/OVA induz eficientemente respostas de células T super-específicas cd4 e CD8 positivo com as respostas anti-DEC-205/OVA-induced CD8-positive T-cell responses significativamente superiores às induzidas apenas pelo OVA. Para uma conjugação bem sucedida de antígeno OVA com anticorpo anti-DEC-205, é importante preparar os materiais como demonstrado e executar as etapas de conjugação em condições consistentes.Após a conjugação bem sucedida do antígeno e do anticorpo, inúmeras abordagens subsequentes são possíveis, incluindo análise de vinculação e indução de patógeno ou imunidade relacionada ao tumor in vivo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

In Vitro Imaging and Quantificação da segmentação Eficiência Drogas de análogos de GnRH fluorescente etiquetado

GnRH analogues are effective targeting moieties and able to deliver anticancer agents selectively into malignant tumor cells which highly express GnRH ...

Pesquisa do câncer

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Estabelecimento de dupla resistência de EGFR-TKI e conheci-TKI em Lung Adenocarcinoma células In Vitro com um procedimento passo-2 Dose-escalada

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Contagem de proteínas em células únicas com gotículas endereçável Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Se movendo para cima: Um simples e flexível em Vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Na Vivo Avaliação de EPR de pH, pO2, Status Redox e as concentrações de fosfato e glutationa no microambiente do Tumor

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Protocolo de isolamento de células dendríticas derivadas de monócitos de rato e sua ativação subsequente em Vitro com Tumor de imunocomplexos

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

Um direcionamento-GPC3 anticorpo Bispecific, GPC3-S-Fab, com potente citotoxicidade

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Enriquecimento de Fosfopeptida acoplado com espectrometria de massa livre de rótulo quantitativa para investigar o Phosphoproteome no câncer de próstata

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

In vivo localização de imunofluorescência para avaliação de anticorpo terapêutico e diagnóstico biodistribuição em pesquisa de câncer

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Fluorescente Sílica Nanopartículas em Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...