Name: chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo
Uploaded: 2021-02-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Авторы благодарят С. Преттина за экспертную техническую помощь. Эта работа была поддержана грантом Ассоциации немецких исследовательских центров имени Гельмгольца (HGF), который был предоставлен в рамках Альянса Гельмгольца «Иммунотерапия рака» (HCC_WP2b).

Все описанные эксперименты на животных были одобрены местным правительственным агентством (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; номер файла 33.12-42502-04-10/0108) и были выполнены в соответствии с национальными и институциональными руководящими принципами.
1. Производство...

<ol>
	<li>Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+complete+repertoire+of+conventional+dendritic+cell+functions+for+cancer+immunotherapy.">Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy.</a> Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Wculek, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+cancer+immunology+and+immunotherapy.">Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy.</a> Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).</li><li>Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell-targeted+vaccines--hope+or+hype.">Dendritic cell-targeted vaccines--hope or hype.</a> Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).</li><li>Bonifaz, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+targeting+of+antigens+to+maturing+dendritic+cells+via+the+DEC-205+receptor+improves+T+cell+vaccination.">In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination.</a> Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).</li><li>Boscardin, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+targeting+to+dendritic+cells+elicits+long-lived+T+cell+help+for+antibody+responses.">Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses.</a> Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).</li><li>Hossain, M. K., Wall, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Dendritic+Cell+Receptors+as+Targets+for+Enhancing+Anti-Cancer+Immune+Responses.">Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses.</a> Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).</li><li>Johnson, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+melanoma+growth+by+targeting+of+antigen+to+dendritic+cells+via+an+anti-DEC-205+single-chain+fragment+variable+molecule.">Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule.</a> Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).</li><li>Trumpfheller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbial+mimic+poly+IC+induces+durable+and+protective+CD4++T+cell+immunity+together+with+a+dendritic+cell+targeted+vaccine.">The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).</li><li>Idoyaga, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparable+T+helper+1+(Th1)+and+CD8+T-cell+immunity+by+targeting+HIV+gag+p24+to+CD8+dendritic+cells+within+antibodies+to+Langerin,+DEC205,+and+Clec9A.">Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).</li><li>Sancho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+therapy+in+mice+via+antigen+targeting+to+a+novel,+DC-restricted+C-type+lectin.">Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+antigen+delivery+to+dendritic+cells+elicits+robust+antiviral+T+cell-mediated+immunity+in+the+liver.">Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver.</a> Scientific Reports. 7, 43985 (2017).</li><li>Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans'+cells,+veiled+cells,+and+interdigitating+cells+in+the+mouse+recognized+by+a+monoclonal+antibody.">Langerhans' cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STING+activator+c-di-AMP+exerts+superior+adjuvant+properties+than+the+formulation+poly(I:C)/CpG+after+subcutaneous+vaccination+with+soluble+protein+antigen+or+DEC-205-mediated+antigen+targeting+to+dendritic+cells.">The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells.</a> Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).</li></ol>

Химическая конъюгация рецептор-специфического антитела эндоцитоза и белкового антигена обеспечивает эффективный и, что важно, также гибкий подход к нацеливанию in vivo DC на доклинических моделях мышей. С помощью нашего протокола мы обеспечиваем эффективный подход для успешной конъ...

Дендритные клетки (DC) являются центральными игроками иммунной системы. Они представляют собой разнообразную группу клеток, специализирующихся на антиген-презентации, и их основная функция заключается в установлении врожденного и адаптивного иммунитета1,2. Важно отметить, что ДК не только играют важную роль в эффективных и специфических патогенных реакциях, но и участвуют во многих аспектах противоопухолевого иммунитета1,3.
Из-за их исключительной роли в иммунитете хозяина, DC оказался в центре внимания в качестве клеток-мишеней для вакцинации4. Один из подходов заключается в нацеливании антигенов на DC in vivo для индуцирования антиген-специфических иммунных реакций, и за последние годы большое количество исследований было посвящено определению подходящих рецепторов и стратегиям нацеливания1,4. Одним из примеров является рецептор лектина С-типа DEC-205, который может быть нацелен на специфические антитела DEC-205, чтобы вызвать эндоцитоз. Важно отметить, что было показано, что нацеливание DEC-205 в комбинации с подходящими адъювантами эффективно индуцирует долгоживущие и защитные CD4+ и CD8+ Т-клетки, а также ответы антител, также против опухолевых антигенов3,5,6,7,8,9.
Существует ряд исследований, показывающих, что конъюгированные антигены, нацеленные на DC, превосходят свободный неконъюгированный антиген3,5,10,11,12. Это делает конъюгацию антигена с соответствующим фрагментом, нацеленным на постоянный ток, центральным шагом в подходах к нацеливанию на ДК. В случае нацеливания на DC через антитела или фрагменты антител антигены могут быть либо химически, либо генетически связаны, и любая стратегия обеспечивает свои собственные (дис)преимущества1. С одной стороны, в генно-инженерных конструкциях антитело-антиген существует контроль над дозой антигена, а также местоположением, обеспечивающим превосходную сопоставимость между лотами1. В то же время, однако, химическая конъюгация требует меньшей подготовки и обеспечивает большую гибкость, особенно при попытке тестирования и сравнения различных антигенов и / или стратегий вакцинации в экспериментальных и доклинических моделях.
Здесь мы представляем протокол эффективной и надежной химической конъюгации овальбумина (OVA) в качестве модельного белкового антигена к DEC-205-специфическому антителу IgG2a (αDEC-205), подходящему для нацеливания in vivo DC на мышей. Во-первых, αDEC-205 очищают от клеток гибридомы NLDC-14513. Для химической конъюгации используется гетеробифункциональный сшивающий сульфосукцинимидил 4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-SMCC), который содержит эфир NHS (N-гидроксисукцинимид) и малеимидные группы, позволяющий ковалентную конъюгацию амино- и сульфгидрилсодержащих молекул. В частности, первичные амины антитела первоначально реагируют с сульфо-SMCC и полученный малеимид-активированный αDEC-205 затем реагирует с сульфгидрилсодержащим белком OVA, восстановленным через TCEP-HCl (Tris(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлорид). Конечный продукт представляет собой химически сопряженный αDEC-205/OVA(рисунок 1). Помимо самой химической конъюгации, наш протокол описывает удаление избытка OVA из конъюгата, а также проверку успешной конъюгации с помощью анализа вестерн-блот и специфического иммуноферментного анализа. Мы успешно использовали этот подход в прошлом для химической конъюгации OVA и других белков или иммуногенных пептидов с αDEC-205. Мы демонстрируем эффективное связывание с CD11c+ клетками in vitro, а также эффективную индукцию клеточного и гуморального иммунитета in vivo.
Конечно, у этого метода есть недостатки, такие как сопоставимость партии с партией и точное дозирование антигена в конечном конъюгате. Тем не менее, химическая конъюгация обеспечивает экспериментальную гибкость в выборе антитела и белкового антигена по сравнению с генетически модифицированными конструкциями. Поэтому мы считаем, что этот подход особенно ценен при оценке различных антигенов на предмет их эффективности в нацеливании на DC в доклинических моделях мышей, что важно также в контексте специфических противоопухолевых иммунных реакций.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibody buffer 2 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody buffer 5 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % FBS in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 4 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 10 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T25</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>690175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T75</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR&#160; filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T175</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>661175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal concentrator MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2001</td>
			<td>Vivaspin 20 centrifugal concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88532</td>
			<td>Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>525-2314</td>
			<td>PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coating buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desalting columns MWCO 7 kDa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89891</td>
			<td>Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent ELISA (HRPO substrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>T8665-100ML</td>
			<td>3,3&#8242;,5,5&#8242;-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent western blot (HRPO substrate)</td>
			<td>Roche/Merck</td>
			<td>12 015 200 01</td>
			<td>Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa</td>
			<td>SERVA Electrophoresis</td>
			<td>44110</td>
			<td>Visking dialysis tubing, 16 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA 96-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td>MaxiSorp Nunc-Immuno Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum</td>
			<td>PAN-BIOtech</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>FBS Good forte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISF-1 medium</td>
			<td>Biochrom/bioswisstec</td>
			<td>F 9061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145.2</td>
			<td>powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLDC-145 hybridoma</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-290</td>
			<td>if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-reducing SDS sample buffer 4 x&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 &#181;l 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 &#181;l of 5 % Bromphenol Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ovalbumin</td>
			<td>Hyglos (via BioVendor)</td>
			<td>321000</td>
			<td>EndoGrade OVA ultrapure with &#60;0.1 EU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles</td>
			<td>Nunc In Vitro</td>
			<td>734-2394</td>
			<td>standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm&#178;, 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109535</td>
			<td>pH indicator strips 0-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG(H+L)-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-062</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG+IgM-HRPO antibody&#160; (ELISA)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-068</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rabbit-IgG-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>111-035-045&#160;</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA (ELISA)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181688</td>
			<td>used at 3 ng/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA antibody (western blot)</td>
			<td>OriGene</td>
			<td>R1101</td>
			<td>used at 1:3,000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose column</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>P3296</td>
			<td>5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td>PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber plug</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5230217</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN rubber stoppers (lower &#934; 17 mm; upper &#934; 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone tube</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5430925</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN (inside &#934; 1 mm; outer &#934; 3 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim-Fast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopping solution (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M H2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22322</td>
			<td>Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter unit 0.22 &#181;m&#160;</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe 10 ml</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Disposable syringes Injekt&#174; Solo B.Braun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican&#174; cannulas</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td></td>
			<td>Sterican&#174; G 20 x 1 1/2&#34;&#34;; 0.90 x 40 mm; yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A35349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing connector</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo

Таргетная доставка антигена к перекрестно-презентационным дендритным клеткам (DC) in vivo эффективно индуцирует реакции Т-эффекторных клеток и демонстрирует ценный подход в разработке вакцин. Антиген доставляется в DC через антитела, специфичные для рецепторов эндоцитоза, таких как DEC-205, которые индуцируют поглощение, обработку и презентацию MHC класса I и II.
Эффективная и надежная конъюгация желаемого антигена с подходящим антителом является критическим шагом в нацеливании на DC и среди других факторов зависит от формата антигена. Химическая конъюгация полноразмерного белка с очищенными антителами является одной из возможных стратегий. В прошлом мы успешно установили сшивку модельного антигена овальбумина (OVA) и специфического антитела IgG2a DEC-205 (αDEC-205) для исследований in vivo DC на мышах. Первым этапом протокола является очищение антитела от супернатанта NLDC (нелимфоидных дендритных клеток)-145 гибридомы методом аффинной хроматографии. Очищенное антитело активируют для химической конъюгации сульфо-SMCC (сульфосуцинимидил 4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилат), в то время как в то же время сульфгидрильные группы белка OVA подвергают воздействию путем инкубации с TCEP-HCl (трис (2-карбоксиэтил)гидрохлорид фосфина). Избыток TCEP-HCl и сульфо-SMCC удаляют, а антиген смешивают с активированным антителом для ночного соединения. Полученный конъюгат αDEC-205/OVA концентрируется и освобождается от несвязанной OVA. Успешная конъюгация OVA с αDEC-205 подтверждается анализом вестерн-блоттинга и иммуноферментным анализом (ИФА).
Мы успешно использовали химически сшитый αDEC-205/OVA для индуцирования цитотоксических Т-клеточных реакций в печени и сравнения различных адъювантов на предмет их потенциала в индуцировании гуморального и клеточного иммунитета после нацеливания in vivo на DEC-205+ DC. Кроме того, такие конъюгаты химически связанных антител / антигенов предлагают ценные инструменты для эффективной индукции ответов вакцины на опухолевые антигены и, как было доказано, превосходят классические подходы к иммунизации в отношении профилактики и терапии различных типов опухолей.

Химическая конъюгация белка αDEC-205 с белком OVA с использованием этого протокола обычно позволяет эффективно генерировать αDEC-205/OVA для подходов к нацеливанию in vivo DC. Существуют различные стратегии проверки самой техники и проверки функциональности полученного соп?...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Описан протокол химической конъюгации модельного антигена овальбумина к рецептор-специфическому антителу эндоцитоза для нацеливания на дендритные клетки in vivo. Протокол включает очистку антитела, химическую конъюгацию антигена, а также очистку конъюгата и проверку эффективного конъюгации.

Химическая конъюгация очищенного антитела, направленного на DEC-205, с полноразмерным белком для нацеливания на дендритные клетки мышей in vitro и in vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

Этот протокол, для которого все экспериментальные условия были тщательно оптимизированы, может быть использован для содействия успешной и эффективной химической конъюгации антитела DEC-205 к антигену OVA. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он позволяет гибко выбирать белковый антиген и антитело, и что он не полагается на генетическое слияние этих компонентов. Мы также использовали этот протокол для генерации конъюгатов белков вируса гепатита С и анти-DEC-205 для таргетирования in vivo DC.Это также может быть полезно для подходов к противоопухолевой вакцинации. Чтобы начать производство анти-DEC-205, повторно суспендируйте объем в один миллилитр от одного до пяти миллионов размороженных крио-сохраненных клеток NLDC 145 в девяти миллилитрах среды 37 градусов Цельсия ISF-1, дополненной 1% пенициллина и стрептомицина, и посейте клетки в колбу для культуры клеток площадью 25 квадратных сантиметров для инкубации при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа в течение 24-48 часов. Когда клетки достигнут 70% конической трубки, переместите всю клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 миллилитров и соберите клетки путем центрифугирования.Повторно суспендируйте гранулу в 12 миллилитрах свежей полной 37-градусной среды ISF-1 и повторно обложите ячейки в колбу площадью 75 квадратных сантиметров. После 48-72 часов культивирования разделите 70% сливающуюся культуру между каждой из двух новых колб площадью 75 квадратных сантиметров и добавьте шесть миллилитров свежей полной среды ISF-1 в каждую колбу. Когда культуры достигнут 70% сливания, используйте 10-миллилитровую пипетку для промывки дна колбы клеточной культуры и поверхностей культуры клеточной суспензией, чтобы собрать все клетки и перенести 10 миллилитров каждой расширенной клеточной суспензии NLDC 145 в отдельные роликовые бутылки PETG.Затем добавьте 140 миллилитров полной среды ISF-1 к каждой культуре роликовой бутылки и культивируйте роликовые бутылки при 37 градусах Цельсия, 5% углекислого газа и 25 раундов в минуту в течение трех дней. Для очистки антител от супернатанта NLDC 145 поместите конец кремниевой трубки в заполненный супернатантом стакан и позвольте 800 миллилитрам супернатанта пройти по каплям через столбец белка G Sepharose. Для элюирования добавьте 100 микролитров 1,5 моляра Tris-HCL в каждую из двадцати 1,5 миллилитровых трубок и снимите резиновую заглушку из колонки.Переложите один миллилитр 0,1 молярного глицина в верхнюю камеру колонны и соберите антитело, содержащее элюент, в одну из подготовленных 1,5 миллилитровых пробирок и повторите для каждой пробирки. Когда все антитела собраны и элюированные антитела будут объединены, закройте дно диализной трубки длиной 20 сантиметров соответствующим закрытием диализной трубки и осторожно вставьте элюирование антител в трубку. Закройте верхнюю часть диализной трубки вторым зажимом и закрепите верхний зажим диализной трубки на плавающей подставке.Добавьте магнитный перемешиватель в стакан PBS и поместите его на магнитную мешалку. После ночного диализа при четырех градусах Цельсия откройте один зажим, чтобы обеспечить загрузку полного диализата в центробежный концентратор с отсечкой молекулярной массы 10 килоДальтона, и центрифугируйте концентратор в течение 30 минут при 693 раза g и четырех градусах Цельсия. В конце спина нагружают центробежный концентратор 10 миллилитрами ПБС для второго центрифугирования до получения окончательного объема раствора антител до 1,5 миллилитра.Чтобы конъюгировать OVA с антителом против DEC-205, добавьте 200 микролитров PBS, дополненных 500 микрограммами белка OVA, 240 микролитрами свежеприготовленного раствора TCEP-HCL и 560 микролитрами стерильной сверхчистой воды в 1,5 миллилитровую трубку для 1,5-часовой инкубации при комнатной температуре. В то же время добавьте 2,5 миллиграмма анти-DEC-205 в 900 микролитрах PBS и 100 микролитров свежеприготовленного сульфо-SMCC во вторую 1,5-миллилитровую трубку для 30-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия при 550 оборотах в минуту в нагревательном блоке. В конце инкубации поместите обессолительные колонны с ослабленными колпачками и скрученными днами в отдельные 15-миллилитровые конические трубки и центрифугируйте колонны для удаления жидкости.После центрифугирования поместите колонны в новые трубки со снятыми колпачками и медленно загрузите растворы антител сульфо-SMCC и OVA TCEP-HCL в центр компактного смоляного слоя по одной колонке на раствор. После центрифугирования отбросьте колонки и сразу же смешайте растворы антител и OVA с мягким пипетированием. Загрузите раствор anti-DEC-205/OVA на концентратор центробежного белка и заполните концентратор PBS до объема 15 миллилитров.Центрифугируйте концентратор в течение пяти минут при 2000 G и комнатной температуре и заполните концентратор дополнительными 10 миллилитрами PBS. После центрифугирования концентрации в течение не менее восьми минут в тех же условиях центрифуги осторожно соберите концентрированный образец из верхней камеры. Чтобы проверить успешность конъюгации с помощью анализа вестерн-блотт, загрузите аликвоту из каждого образца на стандарте белка на гель SDS и запустите гель в соответствии со стандартными протоколами анализа SDS-PAGE.После гелевого промокания окрашивают мембраны конъюгированными антителами пероксидазы хрена для обнаружения анти-DEC-205 или OVA в соответствии со стандартными протоколами. Затем мембраны могут быть проанализированы на наличие соответствующего белка в каждом образце. Чтобы проверить успешность конъюгации с помощью ИФА, покройте соответствующую 96-луночную ИФА-пластину 100 микролитрами анти-OVA антитела на лунку и последовательно разбавляйте анти-DEC-205/OVA в соотношении один к двум и блокирующим буфером для получения разбавлений от шести микрограммов на миллилитр до 93,8 нанограмм на миллилитр.Добавляют 100 микролитров каждого разведения в соответствующие лунки пластины, покрытой антителами, для одночасовой инкубации при комнатной температуре. В конце инкубации добавляют 100 микролитров конъюгированного антитела пероксидазы хрена против конъюгата анти-DEC-205/OVA на пластину для часовой инкубации при комнатной температуре, затем добавляют 50 микролитров субстрата пероксидазы хрена в каждую лунку, чтобы обеспечить анализ цветовой реакции с помощью спектрофотометрии. Параллельный вестерн-блот-анализ может быть использован для обнаружения как сопряженной OVA, так и сопряженной анти-DEC-205.Окрашивание для OVA позволит обнаружить избыток свободной OVA, если она присутствует, а окрашивание для анти-DEC-205 подтверждает успех конъюгации за счет увеличения молекулярной массы между голым анти-DEC-205 и конъюгатом. ИФА также может быть использована для оценки успешности конъюгации с положительной связью между обнаруженным сигналом и анализируемым количеством белка, что указывает на успешную генерацию конъюганта анти-DEC-205/OVA. Анализ проточной цитометрии и иммунофлуоресценции ясно показывают, что ядро анти-DEC-205 эффективно связывает CD11c-положительные клетки, полученные из костного мозга.Вакцинация анти-DEC-205/OVA в сочетании с адъювантом вызывает увеличение OVA-специфических титров IgG у мышей-реципиентов по сравнению с вакцинацией OVA и только адъювантом. Кроме того, анти-DEC-205/OVA эффективно индуцирует сверхспецифические CD4 и CD8-положительные Т-клеточные ответы с анти-DEC-205/OVA-индуцированными CD8-положительными Т-клетками, значительно превышающими те, которые индуцируются только OVA. Для успешной конъюгации антигена OVA с антителом против DEC-205 важно подготовить материалы, как показано, и выполнить этапы конъюгации в последовательных условиях.После успешной конъюгации антигена и антитела возможны многочисленные последующие подходы, включая связывающий анализ и индукцию патогенного или опухолевого иммунитета in vivo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

In Vitro визуализации и количественному Таргетинг эффективности наркоконтроля флуоресцентно меченных ГнРГ Аналогов

GnRH analogues are effective targeting moieties and able to deliver anticancer agents selectively into malignant tumor cells which highly express GnRH ...

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Создание двойного сопротивления EGFR-тки и встретились тки в легких аденокарциномы клетки In Vitro дозы 2-шаг эскалации процедуры

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Подсчет белков в одиночных клетках с адресно капелька Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Перемещение вверх: Простая и гибкая в Vitro трехмерной вторжения протокол Assay

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

В естественных условиях ЭПР Оценка рН, pO2, окислительно-восстановительного состояния и концентрации фосфатов и глутатиона в микроокружения опухоли

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Протокол изоляции моноцитарных дендритных клеток мыши и их последующее в Vitro активации с опухоли иммунных комплексов

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

GPC3-ориентация Bispecific антител, GPC3-S-Fab, с мощным цитотоксичности

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphopeptide обогащения, в сочетании с Label бесплатно количественного масс-спектрометрии для расследования Phosphoproteome рака простаты

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

В Vivo Иммунофлуоресценция Локализация для оценки терапевтического и диагностического антитела биораспределения в онкологических исследований

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

В Vivo Ориентация Ксенотрансплантированных раковых клеток человека с функциональными флуоресцентными наночастицами кремнезема в Зебрафиш

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...