Name: chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo
Uploaded: 2021-02-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Los autores agradecen a S. Prettin la asistencia técnica de expertos. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Asociación Helmholtz de Centros de Investigación Alemanes (HGF) que se proporcionó como parte de la Alianza Helmholtz "Inmunoterapia de Cánceres" (HCC_WP2b).

Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por la agencia del gobierno local (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; número de expediente 33.12-42502-04-10/0108) y se realizaron de acuerdo con las directrices nacionales e institucionales.
1. Producción de αDEC-205 a partir de la línea celular de hibridoma NLDC-145
<ol><li>Para la producción de anticuerpos, descongele las células NLDC-145 criopreservadas que producen αDEC-205...

<ol>
	<li>Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+complete+repertoire+of+conventional+dendritic+cell+functions+for+cancer+immunotherapy.">Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy.</a> Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Wculek, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+cancer+immunology+and+immunotherapy.">Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy.</a> Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).</li><li>Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell-targeted+vaccines--hope+or+hype.">Dendritic cell-targeted vaccines--hope or hype.</a> Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).</li><li>Bonifaz, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+targeting+of+antigens+to+maturing+dendritic+cells+via+the+DEC-205+receptor+improves+T+cell+vaccination.">In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination.</a> Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).</li><li>Boscardin, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+targeting+to+dendritic+cells+elicits+long-lived+T+cell+help+for+antibody+responses.">Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses.</a> Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).</li><li>Hossain, M. K., Wall, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Dendritic+Cell+Receptors+as+Targets+for+Enhancing+Anti-Cancer+Immune+Responses.">Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses.</a> Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).</li><li>Johnson, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+melanoma+growth+by+targeting+of+antigen+to+dendritic+cells+via+an+anti-DEC-205+single-chain+fragment+variable+molecule.">Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule.</a> Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).</li><li>Trumpfheller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbial+mimic+poly+IC+induces+durable+and+protective+CD4++T+cell+immunity+together+with+a+dendritic+cell+targeted+vaccine.">The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).</li><li>Idoyaga, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparable+T+helper+1+(Th1)+and+CD8+T-cell+immunity+by+targeting+HIV+gag+p24+to+CD8+dendritic+cells+within+antibodies+to+Langerin,+DEC205,+and+Clec9A.">Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).</li><li>Sancho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+therapy+in+mice+via+antigen+targeting+to+a+novel,+DC-restricted+C-type+lectin.">Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+antigen+delivery+to+dendritic+cells+elicits+robust+antiviral+T+cell-mediated+immunity+in+the+liver.">Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver.</a> Scientific Reports. 7, 43985 (2017).</li><li>Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans'+cells,+veiled+cells,+and+interdigitating+cells+in+the+mouse+recognized+by+a+monoclonal+antibody.">Langerhans' cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STING+activator+c-di-AMP+exerts+superior+adjuvant+properties+than+the+formulation+poly(I:C)/CpG+after+subcutaneous+vaccination+with+soluble+protein+antigen+or+DEC-205-mediated+antigen+targeting+to+dendritic+cells.">The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells.</a> Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).</li></ol>

La conjugación química de un anticuerpo específico del receptor de endocitosis y un antígeno proteico proporciona un enfoque eficiente y, lo que es más importante, también flexible para la orientación in vivo de DC en modelos preclínicos de ratón. Con nuestro protocolo proporcionamos un enfoque eficiente para la conjugación exitosa del modelo de antígeno OVA a un anticuerpo IgG específico de DEC-205.
En nuestro protocolo, αDEC-205 se purifica a partir de una línea celula...

Las células dendríticas (DC) son actores centrales del sistema inmunitario. Son un grupo diverso de células especializadas en la presentación de antígenos y su función principal es tender puentes entre la inmunidad innata y adaptativa1,2. Es importante destacar que los DC no solo desempeñan un papel importante en respuestas eficientes y específicas dirigidas a patógenos, sino que también están involucrados en muchos aspectos de la inmunidad antitumoral1,3.
Debido a su papel exclusivo en la inmunidad del huésped, la DC se centró como células diana para la vacunación4. Un enfoque es dirigir antígenos a DC in vivo para inducir respuestas inmunes específicas de antígenos y en los últimos años, un gran número de estudios se han dedicado a definir receptores adecuados y estrategias de orientación1,4. Un ejemplo es el receptor de lectina de tipo C DEC-205, que puede ser dirigido por anticuerpos específicos de DEC-205 para inducir endocitosis. Es importante destacar que se ha demostrado que la orientación DEC-205 en combinación con adyuvantes adecuados induce de manera eficiente células T CD4+ y CD8+ de larga vida y protectoras, así como respuestas de anticuerpos, también contra antígenos tumorales3,5,6,7,8,9.
Hay una serie de estudios que muestran que los antígenos conjugados dirigidos a DC son superiores al antígeno libre no conjugado3,5,10,11,12. Esto hace que la conjugación del antígeno con la respectiva fracción de orientación de CC sea un paso central en los enfoques de orientación de CC. En el caso de la orientación de DC a través de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, los antígenos pueden estar unidos química o genéticamente y cualquiera de las estrategias proporciona sus propias (des)ventajas1. Por un lado, en las construcciones de anticuerpos-antígenos genéticamente modificados existe un control sobre la dosis de antígenos, así como la ubicación que proporciona una comparabilidad superior entre los lotes1. Al mismo tiempo, sin embargo, la conjugación química necesita menos preparación y proporciona más flexibilidad, especialmente cuando se intenta probar y comparar diferentes antígenos y / o estrategias de vacunación en modelos experimentales y preclínicos.
Aquí, presentamos un protocolo para la conjugación química eficiente y confiable de la ovoalbúmina (OVA) como antígeno proteico modelo a un anticuerpo IgG2a específico de DEC-205 (αDEC-205) adecuado para la orientación de CC in vivo en ratones. En primer lugar, αDEC-205 se purifica a partir de células de hibridoma NLDC-14513. Para la conjugación química, se utiliza el reticulador heterobifuncional sulfosuccinimidil 4-[N-maleimidometil] ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC), que contiene éster NHS (N-hidroxisuccinimida) y grupos maleimida, lo que permite la conjugación covalente de moléculas que contienen amina y sulfhidrilo. Específicamente, las aminas primarias del anticuerpo reaccionan inicialmente con sulfo-SMCC y la αDEC-205 activada por maleimida resultante y luego reaccionan con la proteína OVA que contiene sulfhidrilo reducida a través de TCEP-HCl (clorhidrato de fosfina Tris(2-carboxietilo)). El producto final es αDEC-205/OVA conjugado químicamente (Figura 1). Más allá de la conjugación química en sí, nuestro protocolo describe la eliminación del exceso de OVA del conjugado, así como la verificación de la conjugación exitosa a través del análisis de Western Blot y un ensayo específico de inmunoabsorción ligado a enzimas. Hemos empleado con éxito este enfoque en el pasado para conjugar químicamente OVA y otras proteínas o péptidos inmunogénicos a αDEC-205. Demostramos la unión eficiente a células CD11c+ in vitro así como la inducción eficiente de inmunidad celular y humoral in vivo.
Ciertamente, hay inconvenientes en este método, como en la comparabilidad de lote a lote y en la dosificación exacta del antígeno dentro del conjugado final. Sin embargo, la conjugación química proporciona flexibilidad experimental en la elección del anticuerpo y el antígeno proteico en comparación con las construcciones genéticamente modificadas. Por lo tanto, creemos que este enfoque es especialmente valioso en la evaluación de diferentes antígenos por su eficiencia en la orientación de CC en modelos preclínicos de ratón, lo que es importante también en el contexto de respuestas inmunes antitumorales específicas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibody buffer 2 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody buffer 5 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % FBS in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 4 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 10 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T25</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>690175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T75</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR&#160; filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T175</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>661175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal concentrator MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2001</td>
			<td>Vivaspin 20 centrifugal concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88532</td>
			<td>Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>525-2314</td>
			<td>PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coating buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desalting columns MWCO 7 kDa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89891</td>
			<td>Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent ELISA (HRPO substrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>T8665-100ML</td>
			<td>3,3&#8242;,5,5&#8242;-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent western blot (HRPO substrate)</td>
			<td>Roche/Merck</td>
			<td>12 015 200 01</td>
			<td>Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa</td>
			<td>SERVA Electrophoresis</td>
			<td>44110</td>
			<td>Visking dialysis tubing, 16 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA 96-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td>MaxiSorp Nunc-Immuno Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum</td>
			<td>PAN-BIOtech</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>FBS Good forte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISF-1 medium</td>
			<td>Biochrom/bioswisstec</td>
			<td>F 9061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145.2</td>
			<td>powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLDC-145 hybridoma</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-290</td>
			<td>if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-reducing SDS sample buffer 4 x&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 &#181;l 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 &#181;l of 5 % Bromphenol Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ovalbumin</td>
			<td>Hyglos (via BioVendor)</td>
			<td>321000</td>
			<td>EndoGrade OVA ultrapure with &#60;0.1 EU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles</td>
			<td>Nunc In Vitro</td>
			<td>734-2394</td>
			<td>standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm&#178;, 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109535</td>
			<td>pH indicator strips 0-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG(H+L)-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-062</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG+IgM-HRPO antibody&#160; (ELISA)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-068</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rabbit-IgG-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>111-035-045&#160;</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA (ELISA)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181688</td>
			<td>used at 3 ng/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA antibody (western blot)</td>
			<td>OriGene</td>
			<td>R1101</td>
			<td>used at 1:3,000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose column</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>P3296</td>
			<td>5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td>PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber plug</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5230217</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN rubber stoppers (lower &#934; 17 mm; upper &#934; 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone tube</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5430925</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN (inside &#934; 1 mm; outer &#934; 3 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim-Fast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopping solution (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M H2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22322</td>
			<td>Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter unit 0.22 &#181;m&#160;</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe 10 ml</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Disposable syringes Injekt&#174; Solo B.Braun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican&#174; cannulas</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td></td>
			<td>Sterican&#174; G 20 x 1 1/2&#34;&#34;; 0.90 x 40 mm; yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A35349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing connector</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo

La administración dirigida de antígenos a células dendríticas (CC) de presentación cruzada in vivo induce de manera eficiente las respuestas de las células efectoras T y muestra un enfoque valioso en el diseño de vacunas. El antígeno se administra a DC a través de anticuerpos específicos para los receptores de endocitosis como DEC-205 que inducen la absorción, el procesamiento y la presentación de MHC de clase I y II.
La conjugación eficiente y confiable del antígeno deseado a un anticuerpo adecuado es un paso crítico en la orientación de CC y, entre otros factores, depende del formato del antígeno. La conjugación química de proteína de longitud completa a anticuerpos purificados es una posible estrategia. En el pasado, hemos establecido con éxito la reticulación del antígeno modelo de ovoalbúmina (OVA) y un anticuerpo IgG2a específico de DEC-205 (αDEC-205) para estudios de orientación de CC in vivo en ratones. El primer paso del protocolo es la purificación del anticuerpo del sobrenadante del hibridoma NLDC (células dendríticas no linfoides)-145 por cromatografía de afinidad. El anticuerpo purificado se activa para la conjugación química por sulfo-SMCC (sulfosuccinimidil 4-[N-maleimidometil] ciclohexano-1-carboxilato) mientras que al mismo tiempo los grupos sulfhidrilo de la proteína OVA se exponen a través de la incubación con TCEP-HCl (clorhidrato de fosfina tris (2-carboxietilo)). El exceso de TCEP-HCl y sulfo-SMCC se eliminan y el antígeno se mezcla con el anticuerpo activado para el acoplamiento nocturno. El conjugado αDEC-205/OVA resultante se concentra y se libera del OVA no unido. La conjugación exitosa de OVA a αDEC-205 se verifica mediante el análisis de Western Blot y el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).
Hemos utilizado con éxito αDEC-205/OVA reticulados químicamente para inducir respuestas citotóxicas de células T en el hígado y para comparar diferentes adyuvantes por su potencial en la inducción de inmunidad humoral y celular después de la orientación in vivo de DEC-205+ DC. Más allá de eso, tales conjugados anticuerpo/antígeno acoplados químicamente ofrecen herramientas valiosas para la inducción eficiente de las respuestas de la vacuna a los antígenos tumorales y se ha demostrado que son superiores a los enfoques clásicos de inmunización con respecto a la prevención y el tratamiento de varios tipos de tumores.

La conjugación química de αDEC-205 a la proteína OVA utilizando este protocolo normalmente permitirá la generación eficiente de αDEC-205/OVA para enfoques de orientación de CC in vivo. Existen diferentes estrategias para verificar la técnica en sí y probar la funcionalidad del conjugado producido. El análisis de Western blot y ELISA se utilizan para verificar la conjugación exitosa y al mismo tiempo detectar OVA potencialmente libre(Figura 2).</st...

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Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Describimos un protocolo para la conjugación química del antígeno modelo ovoalbúmina a un anticuerpo específico del receptor de endocitosis para la orientación in vivo de células dendríticas. El protocolo incluye la purificación del anticuerpo, la conjugación química del antígeno, así como la purificación del conjugado y la verificación de una conjugación eficiente.

Conjugación química de un anticuerpo purificado dirigido por DEC-205 con proteína de longitud completa para atacar células dendríticas de ratón in vitro e in vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

Este protocolo para el que todas las condiciones experimentales se han optimizado cuidadosamente se puede utilizar para facilitar una conjugación química exitosa y eficiente del anticuerpo DEC-205 al antígeno OVA. Las principales ventajas de esta técnica son que permite una selección flexible del antígeno proteico y del anticuerpo, y que no se basa en la fusión genética de estos componentes. También hemos utilizado este protocolo para generar conjugados de proteínas del virus de la hepatitis C y anti-DEC-205 para la focalización de CC in vivo.Esto también podría ser valioso para los enfoques de vacunación antitumoral. Para comenzar la producción anti-DEC-205, resusped un volumen de un mililitro de uno a cinco millones de células NLDC 145 crioconservadas descongeladas en nueve mililitros de medio ISF-1 de 37 grados Celsius suplementado con penicilina al 1% y estreptomicina, y sembrar las células en un matraz de cultivo celular de 25 centímetros cuadrados para incubación a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 24 a 48 horas. Cuando las células alcancen el 70% de confluencia, transfiera toda la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros y recoja las células por centrifugación.Resuspender el pellet en 12 mililitros de medio ISF-1 de 37 grados completo y volver a colocar las células en un matraz de 75 centímetros cuadrados. Después de 48 a 72 horas de cultivo, divida el cultivo confluente del 70% entre cada uno de los dos nuevos matraces de 75 centímetros cuadrados y agregue seis mililitros de medio ISF-1 completo fresco a cada matraz. Cuando los cultivos alcancen el 70% de confluencia, use una pipeta de 10 mililitros para enjuagar los fondos de matraz de cultivo celular y las superficies de cultivo con la suspensión celular para recolectar todas las células y transferir 10 mililitros de cada suspensión de células NLDC 145 expandida en botellas de rodillos PETG individuales.Luego agregue 140 mililitros de medio ISF-1 completo a cada cultivo de botella de rodillo y cultive las botellas de rodillos a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono y 25 rondas por minuto durante tres días. Para la purificación de anticuerpos del sobrenadante NLDC 145, coloque el extremo de un tubo de silicio en el vaso de precipitados lleno de sobrenadante y permita que 800 mililitros de sobrenadante pasen gota a gota a través de una columna de sefalrosa de proteína G. Para la elución, agregue 100 microlitros de 1.5 molares Tris-HCL en cada uno de los veinte tubos de 1.5 mililitros y retire el tapón de goma de la columna.Transfiera un mililitro de glicina molar 0,1 a la cámara superior de la columna y recoja el anticuerpo que contiene el eluyente en uno de los tubos preparados de 1,5 mililitros y repita para cada tubo. Cuando se haya recolectado todo el anticuerpo y se hayan agrupado las eluciones que contienen anticuerpos, cierre la parte inferior de un tubo de diálisis de 20 centímetros de longitud con un cierre de tubo de diálisis apropiado y pipetee cuidadosamente la elución de anticuerpos en el tubo. Cierre la parte superior del tubo de diálisis con una segunda abrazadera y fije la abrazadera superior del tubo de diálisis a un soporte flotante.Agregue una barra de agitación magnética a un vaso de precipitados de PBS y coloque el vaso de precipitados en un agitador magnético. Después de la diálisis nocturna a cuatro grados Centígrados, abra una abrazadera para permitir la carga del dializado completo en un concentrador centrífugo con un corte de peso molecular de 10 kiloDalton y centrifugue el concentrador durante 30 minutos a 693 veces G y cuatro grados Celsius. Al final del centrifugado, cargue el concentrador centrífugo con 10 mililitros de PBS para una segunda centrifugación hasta obtener un volumen final de solución de anticuerpos de uno a 1,5 mililitros.Para conjugar OVA con el anticuerpo anti-DEC-205, agregue 200 microlitros de PBS suplementados con 500 microgramos de proteína OVA, 240 microlitros de una solución de TCEP-HCL recién preparada y 560 microlitros de agua ultrapura estéril a un tubo de 1.5 mililitros para una incubación de 1.5 horas a temperatura ambiente. Al mismo tiempo, agregue 2.5 miligramos de anti-DEC-205 en 900 microlitros de PBS y 100 microlitros de sulfo-SMCC recién preparado a un segundo tubo de 1.5 mililitros para una incubación de 30 minutos a 37 grados Celsius a 550 revoluciones por minuto en un bloque de calentamiento. Al final de las incubaciones, coloque las columnas de desalinización con tapas aflojadas y fondos retorcidos en tubos cónicos individuales de 15 mililitros, y centrifute las columnas para eliminar el líquido.Después de la centrifugación, coloque las columnas en tubos nuevos con las tapas retiradas y cargue lentamente las soluciones de anticuerpos sulfo-SMCC y OVA TCEP-HCL en el centro del lecho de resina compacto de una columna por solución. Después de centrifugar, deseche las columnas e inmediatamente mezcle las soluciones de anticuerpos y OVA con pipeteo suave. Cargue la solución anti-DEC-205/OVA en un concentrador centrífugo de proteínas y llene el concentrador con PBS a un volumen de 15 mililitros.Centrifugue el concentrador durante cinco minutos a 2.000 veces G y temperatura ambiente y llene el concentrador con 10 mililitros adicionales de PBS. Después de centrifugar la concentración durante al menos ocho minutos en las mismas condiciones de centrifugación, recoja suavemente la muestra concentrada de la cámara superior. Para verificar el éxito de la conjugación mediante el análisis de Western blot, cargue una alícuota de cada muestra en un estándar de proteína en un gel SDS y ejecute el gel de acuerdo con los protocolos de análisis estándar SDS-PAGE.Después de la eliminación en gel, tiñe las membranas con anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano picante para detectar anti-DEC-205 u OVA de acuerdo con los protocolos estándar. Las membranas pueden ser analizadas para la presencia de la proteína respectiva en cada muestra. Para verificar el éxito de la conjugación por ELISA, cubra una placa ELISA apropiada de 96 pocillos con 100 microlitros del anticuerpo anti-OVA por pocillo y diluya en serie anti-DEC-205/OVA en una proporción de uno a dos y bloquee el tampón para obtener diluciones de seis microgramos por mililitro a 93,8 nanogramos por mililitro.Agregue 100 microlitros de cada dilución a los pocillos apropiados de la placa recubierta de anticuerpos durante una incubación de una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, agregue 100 microlitros de anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante contra el anti-DEC-205 / OVA conjugado a la placa durante una incubación de una hora a temperatura ambiente, luego agregue 50 microlitros de sustrato de peroxidasa de rábano picante a cada pozo para permitir el análisis de la reacción de color por espectrofotometría. El análisis paralelo de Western blot se puede utilizar para detectar tanto OVA conjugado como anti-DEC-205 conjugado.La tinción para OVA permitiría la detección de exceso de OVA libre si está presente, y la tinción para anti-DEC-205 verifica el éxito de la conjugación a través de un aumento en el peso molecular entre el anti-DEC-205 desnudo y el conjugado. ELISA también se puede utilizar para evaluar el éxito de la conjugación con una asociación positiva entre la señal detectada y la cantidad analizada de proteína que indica la generación exitosa de conjugante anti-DEC-205/OVA. La citometría de flujo y el análisis de inmunofluorescencia muestran claramente que el núcleo anti-DEC-205 se une de manera eficiente a las células CD11c positivas derivadas de la médula ósea.La vacunación con anti-DEC-205/OVA junto con adyuvante induce un aumento en los títulos de IgG específicos de OVA en los receptores de ratón en comparación con la vacunación con OVA y adyuvante solo. Además, anti-DEC-205/OVA induce eficientemente respuestas de células T CD4 y CD8 positivas sobreespecíficas con las respuestas de células T CD8 positivas inducidas por ANTI-DEC-205/OVA que exceden significativamente las inducidas por OVA solo. Para una conjugación exitosa del antígeno OVA al anticuerpo anti-DEC-205, es importante preparar los materiales como se ha demostrado y realizar los pasos de conjugación en condiciones consistentes.Después de la conjugación exitosa del antígeno y el anticuerpo, son posibles numerosos enfoques posteriores, incluido el análisis de unión y la inducción de inmunidad patógena o relacionada con tumores in vivo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

En Vitro Imágenes y cuantificación de la eficiencia de la focalización de Drogas de los análogos de GnRH marcado con fluorescencia

GnRH analogues are effective targeting moieties and able to deliver anticancer agents selectively into malignant tumor cells which highly express GnRH ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establecer la doble resistencia y TKI de EGFR TKI se reunió en pulmón Adenocarcinoma células In Vitro con un procedimiento de escalamiento de dosis de 2-step

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Recuento de proteínas en las células con Microarrays de gota direccionable

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Mover hacia arriba: Un Simple y Flexible In Vitro invasión tridimensional protocolo

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

En Vivo EPR evaluación de pH, pO2, estado Redox y concentraciones de fosfato y glutatión en el microambiente tumoral

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Protocolo de aislamiento de células dendríticas derivadas de monocitos de ratón y su activación posterior In Vitro con complejos inmunes Tumor

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

Metas de GPC3 tienen anticuerpos, GPC3-S-Fab, con potente citotoxicidad

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Enriquecimiento de fosfopéptidos acoplada con espectrometría de masa libre de etiqueta cuantitativa para investigar la Phosphoproteome en cáncer de próstata

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

Localización de Inmunofluorescencia In Vivo para la Evaluación de la Biodistribución de Anticuerpos Terapéuticos y Diagnóstico en la Investigación del Cáncer

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...