Name: chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo
Uploaded: 2021-02-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Författarna tackar S. Prettin för expertteknisk hjälp. Detta arbete stöddes av ett bidrag från Helmholtz Association of German Research Centers (HGF) som tillhandahölls som en del av Helmholtz Alliance ''Immunotherapy of Cancers' (HCC_WP2b).

Alla beskrivna djurförsök godkändes av den lokala myndigheten (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; filnummer 33.12-42502-04-10/0108) och utfördes i enlighet med nationella och institutionella riktlinjer.
1. Produktion av αDEC-205 från hybridom cellinjen NLDC-145
<ol><li>För antikroppsproduktion, tina kryopreserverade NLDC-145-celler som producerar αDEC-205 vid 37 °C i ett vattenbad. Expandera cellerna vid 37 °C och 5% CO2. Två...

<ol>
	<li>Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+complete+repertoire+of+conventional+dendritic+cell+functions+for+cancer+immunotherapy.">Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy.</a> Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Wculek, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+cancer+immunology+and+immunotherapy.">Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy.</a> Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).</li><li>Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell-targeted+vaccines--hope+or+hype.">Dendritic cell-targeted vaccines--hope or hype.</a> Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).</li><li>Bonifaz, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+targeting+of+antigens+to+maturing+dendritic+cells+via+the+DEC-205+receptor+improves+T+cell+vaccination.">In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination.</a> Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).</li><li>Boscardin, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+targeting+to+dendritic+cells+elicits+long-lived+T+cell+help+for+antibody+responses.">Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses.</a> Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).</li><li>Hossain, M. K., Wall, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Dendritic+Cell+Receptors+as+Targets+for+Enhancing+Anti-Cancer+Immune+Responses.">Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses.</a> Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).</li><li>Johnson, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+melanoma+growth+by+targeting+of+antigen+to+dendritic+cells+via+an+anti-DEC-205+single-chain+fragment+variable+molecule.">Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule.</a> Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).</li><li>Trumpfheller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbial+mimic+poly+IC+induces+durable+and+protective+CD4++T+cell+immunity+together+with+a+dendritic+cell+targeted+vaccine.">The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).</li><li>Idoyaga, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparable+T+helper+1+(Th1)+and+CD8+T-cell+immunity+by+targeting+HIV+gag+p24+to+CD8+dendritic+cells+within+antibodies+to+Langerin,+DEC205,+and+Clec9A.">Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).</li><li>Sancho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+therapy+in+mice+via+antigen+targeting+to+a+novel,+DC-restricted+C-type+lectin.">Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+antigen+delivery+to+dendritic+cells+elicits+robust+antiviral+T+cell-mediated+immunity+in+the+liver.">Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver.</a> Scientific Reports. 7, 43985 (2017).</li><li>Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans'+cells,+veiled+cells,+and+interdigitating+cells+in+the+mouse+recognized+by+a+monoclonal+antibody.">Langerhans' cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STING+activator+c-di-AMP+exerts+superior+adjuvant+properties+than+the+formulation+poly(I:C)/CpG+after+subcutaneous+vaccination+with+soluble+protein+antigen+or+DEC-205-mediated+antigen+targeting+to+dendritic+cells.">The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells.</a> Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).</li></ol>

Kemisk konjugation av en endocytosreceptorspecifik antikropp och ett proteinantigen ger ett effektivt och, viktigast av allt, också flexibelt tillvägagångssätt för in vivo DC-inriktning i prekliniska musmodeller. Med vårt protokoll tillhandahåller vi ett effektivt tillvägagångssätt för framgångsrik konjugation av modellantigenet OVA till en DEC-205-specifik IgG-antikropp.
I vårt protokoll renas αDEC-205 från en hybridomcelllinje och tidigare har vi renat antikroppen med...

Dendritiska celler (DC) är centrala aktörer i immunsystemet. De är en mångsidig grupp celler specialiserade på antigenpresentation och deras huvudsakliga funktion är att överbrygga medfödd och adaptiv immunitet1,2. Viktigt är att DC inte bara spelar en viktig roll i effektiva och specifika patogenstyrda svar utan också är involverade i många aspekter av antitumörimmunitet1,3.
På grund av deras exklusiva roll i värdimmunitet kom DC i fokus som målceller för vaccination4. Ett tillvägagångssätt är att rikta antigener till DC in vivo för att inducera antigenspecifika immunsvar och under de senaste åren har ett stort antal studier ägnats åt att definiera lämpliga receptorer och inriktningsstrategier1,4. Ett exempel är C-typ lektinreceptorn DEC-205, som kan riktas mot DEC-205-specifika antikroppar för att inducera endocytos. Viktigt är att DEC-205-inriktning i kombination med lämpliga adjuvanser har visat sig effektivt inducera långlivade och skyddande CD4+ och CD8+ T-celler, liksom antikroppssvar, även mot tumörantigener3,5,6,7,8,9.
Det finns ett antal studier som visar att konjugerade antigener riktade till DC är överlägsna fria icke-konjugerade antigen3,5,10,11,12. Detta gör konjugationen av antigenet till respektive DC-inriktning moiety ett centralt steg i DC-inriktningsmetoder. När det gäller dc-inriktning via antikroppar eller antikroppsfragment kan antigener vara antingen kemiskt eller genetiskt kopplade och endera strategin ger sina egna (dis)fördelar1. Å ena sidan finns det i genetiskt konstruerade antikropps-antigenkonstruktioner en kontroll över antigendosen samt den plats som ger överlägsen jämförbarhet mellan del1. Samtidigt behöver dock kemisk konjugation mindre förberedelse och ger större flexibilitet, särskilt när man försöker testa och jämföra olika antigener och/eller vaccinationsstrategier i experimentella och prekliniska modeller.
Här presenterar vi ett protokoll för effektiv och tillförlitlig kemisk konjugation av ovalbumin (OVA) som modellproteinantigen till en DEC-205-specifik IgG2a-antikropp (αDEC-205) lämplig för in vivo DC-inriktning hos möss. Först renas αDEC-205 från NLDC-145 hybridomceller13. För kemisk konjugation används heterobifunctional tvärlänk sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC), som innehåller NHS (N-hydroxysuccinimide) ester- och maleimidegrupper, vilket möjliggör kovalent konjugation av amine- och sulfhydrylinnehållande molekyler. Specifikt reagerar de primära aminer av antikroppen initialt med sulfo-SMCC och den resulterande maleimidaktiverade αDEC-205 reagerar sedan med det sulfhydrylinnehållande OVA-proteinet reducerat genom TCEP-HCl (Tris(2-karboxytyl) fosfinhydroklorid). Slutprodukten är kemiskt konjugerad αDEC-205/OVA(figur 1). Utöver kemisk konjugation i sig beskriver vårt protokoll avlägsnande av överskott av OVA från konjugat samt verifiering av framgångsrik konjugation genom western blot analys och en specifik enzym-linked immunosorbent analys. Vi har framgångsrikt använt detta tillvägagångssätt tidigare för att kemiskt konjugera OVA och andra proteiner eller immunogenic peptider till αDEC-205. Vi visar effektiv bindning till CD11c+ celler in vitro samt effektiv induktion av cellulär och humoral immunitet in vivo.
Visst finns det nackdelar med denna metod som i parti-till-parti jämförbarhet och i den exakta doseringen av antigenet inom den slutliga konjugaten. Icke desto mindre ger kemisk konjugation experimentell flexibilitet i valet av antikropp och proteinantigen jämfört med genetiskt konstruerade konstruktioner. Därför anser vi att detta tillvägagångssätt är särskilt värdefullt vid utvärdering av olika antigener för deras effektivitet i DC-inriktning i prekliniska musmodeller, viktigt även i samband med specifika antitumör immunsvar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibody buffer 2 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody buffer 5 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % FBS in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 4 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 10 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T25</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>690175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T75</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR&#160; filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T175</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>661175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal concentrator MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2001</td>
			<td>Vivaspin 20 centrifugal concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88532</td>
			<td>Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>525-2314</td>
			<td>PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coating buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desalting columns MWCO 7 kDa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89891</td>
			<td>Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent ELISA (HRPO substrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>T8665-100ML</td>
			<td>3,3&#8242;,5,5&#8242;-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent western blot (HRPO substrate)</td>
			<td>Roche/Merck</td>
			<td>12 015 200 01</td>
			<td>Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa</td>
			<td>SERVA Electrophoresis</td>
			<td>44110</td>
			<td>Visking dialysis tubing, 16 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA 96-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td>MaxiSorp Nunc-Immuno Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum</td>
			<td>PAN-BIOtech</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>FBS Good forte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISF-1 medium</td>
			<td>Biochrom/bioswisstec</td>
			<td>F 9061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145.2</td>
			<td>powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLDC-145 hybridoma</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-290</td>
			<td>if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-reducing SDS sample buffer 4 x&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 &#181;l 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 &#181;l of 5 % Bromphenol Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ovalbumin</td>
			<td>Hyglos (via BioVendor)</td>
			<td>321000</td>
			<td>EndoGrade OVA ultrapure with &#60;0.1 EU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles</td>
			<td>Nunc In Vitro</td>
			<td>734-2394</td>
			<td>standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm&#178;, 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109535</td>
			<td>pH indicator strips 0-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG(H+L)-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-062</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG+IgM-HRPO antibody&#160; (ELISA)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-068</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rabbit-IgG-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>111-035-045&#160;</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA (ELISA)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181688</td>
			<td>used at 3 ng/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA antibody (western blot)</td>
			<td>OriGene</td>
			<td>R1101</td>
			<td>used at 1:3,000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose column</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>P3296</td>
			<td>5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td>PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber plug</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5230217</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN rubber stoppers (lower &#934; 17 mm; upper &#934; 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone tube</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5430925</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN (inside &#934; 1 mm; outer &#934; 3 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim-Fast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopping solution (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M H2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22322</td>
			<td>Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter unit 0.22 &#181;m&#160;</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe 10 ml</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Disposable syringes Injekt&#174; Solo B.Braun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican&#174; cannulas</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td></td>
			<td>Sterican&#174; G 20 x 1 1/2&#34;&#34;; 0.90 x 40 mm; yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A35349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing connector</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo

Riktad antigen leverans till kors-presentera dendritiska celler (DC) in vivo inducerar effektivt T effector cell svar och visar ett värdefullt tillvägagångssätt i vaccin design. Antigen levereras till DC via antikroppar som är specifika för endocytosreceptorer som DEC-205 som inducerar upptag, bearbetning och MHC klass I- och II-presentation.
Effektiv och tillförlitlig konjugation av önskat antigen till en lämplig antikropp är ett kritiskt steg i DC-inriktning och beror bland annat på antigenets format. Kemisk konjugation av protein i full längd till renade antikroppar är en möjlig strategi. Tidigare har vi framgångsrikt etablerat korslänkning av modellen antigen ovalbumin (OVA) och en DEC-205-specifik IgG2a antikropp (αDEC-205) för in vivo DC inriktning studier på möss. Det första steget i protokollet är rening av antikroppen från supernatanten av NLDC (icke-lymfoida dendritiska celler)-145 hybridom genom affinitetskromatografi. Den renade antikroppen aktiveras för kemisk konjugation av sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidometyl] cyklohexan-1-karboxoxylat) samtidigt som sulfhydrylgrupperna i OVA-proteinet exponeras genom inkubation med TCEP-HCl (tris (2-karboxytyl) fosfinhydroklorid). Överskott av TCEP-HCl och sulfo-SMCC avlägsnas och antigenet blandas med den aktiverade antikroppen för koppling över natten. Den resulterande konjugatet αDEC-205/OVA är koncentrerad och befriad från obundet OVA. Framgångsrik konjugation av OVA till αDEC-205 verifieras av western blot analys och enzym-linked immunosorbent assay (ELISA).
Vi har framgångsrikt använt kemiskt tvärbundna αDEC-205/OVA för att inducera cytotoxiska T-cellssvar i levern och för att jämföra olika adjuvanser för deras potential att inducera humoral och cellulär immunitet efter in vivo-inriktning på DEC-205+ DC. Utöver detta erbjuder sådana kemiskt kopplade antikropps-/antigenkonjugater värdefulla verktyg för effektiv induktion av vaccinsvar på tumörantigener och har visat sig vara överlägsna klassiska immuniseringsmetoder när det gäller förebyggande och behandling av olika typer av tumörer.

Kemisk konjugation av αDEC-205 till OVA-protein med hjälp av detta protokoll möjliggör vanligtvis effektiv generering av αDEC-205/OVA för in vivo DC-inriktningsmetoder. Det finns olika strategier för att verifiera själva tekniken och för att testa funktionaliteten hos den resulterade konjugaten. Western blot analys och ELISA används för att verifiera framgångsrik konjugation och samtidigt upptäcka potentiellt vänsterfri OVA (figur 2). <...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Vi beskriver ett protokoll för kemisk konjugation av modellen antigen ovalbumin till en endocytosis receptor-specifika antikropp för in vivo dendritic cell inriktning. Protokollet omfattar rening av antikroppen, kemisk konjugation av antigenet samt rening av konjugat och verifiering av effektiv konjugation.

Kemisk konjugation av en renad DEC-205-riktad antikropp med fulllängdsprotein för inriktning på mus dendritiska celler in vitro och in vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

Detta protokoll för vilket alla experimentella tillstånd noggrant har optimerats kan användas för att underlätta en framgångsrik och effektiv kemisk konjugation av DEC-205-antikroppen mot OVA-antigen. De främsta fördelarna med denna teknik är att den tillåter ett flexibelt urval av proteinantigen och antikroppar, och att den inte förlitar sig på genetisk fusion av dessa komponenter. Vi har också använt detta protokoll för att generera konjugat av hepatit C-virusproteiner och anti-DEC-205 för in vivo DC-inriktning.Detta kan också vara värdefullt för antitumörvaccinationsmetoder. För att starta anti-DEC-205 produktion, återanvända en milliliter volym på en till fem miljoner tinade cryo-konserverade NLDC 145 celler i nio milliliter av 37 grader Celsius ISF-1 medium kompletterat med 1%penicillin och streptomycin, och frö cellerna i en 25 kvadratcentimeter cell kulturkolv för inkubation vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid i 24 till 48 timmar. När cellerna når 70% sammanflöde, överför hela cellupphängningen till ett koniskt rör på 15 milliliter och samla cellerna genom centrifugering.Återanvänd pelleten i 12 milliliter färskt komplett 37 grader ISF-1-medium och plätera cellerna i en 75 kvadratcentimeterkolv. Efter 48 till 72 timmars kultur, dela upp den 70% sammanflätade kulturen mellan var och en av två nya 75 kvadratcentimeterkolvar och tillsätt sex milliliter färskt komplett ISF-1-medium till varje kolv. När kulturerna når 70% sammanflöde, använd en 10 milliliter pipett för att spola cellodlingskolvens bottnar och odlingsytor med cellfjädringen för att samla alla celler och överföra 10 milliliter av varje expanderad NLDC 145-cellsupphängning till enskilda PETG-rullflaskor.Tillsätt sedan 140 milliliter komplett ISF-1-medium till varje rullflaskakultur och odla rullflaskorna vid 37 grader Celsius, 5% koldioxid och 25 rundor per minut i tre dagar. För antikroppsrening från NLDC 145-supernatanten, placera änden av ett silikonrör i den supernatantfyllda bägaren och låt 800 milliliter supernatant köra droppevis genom en Protein G Sepharose-kolumn. För elution, tillsätt 100 mikroliter av 1,5 molar Tris-HCL i vart och ett av tjugo 1,5 milliliterrör och ta bort gummipluggen från kolonnen.Överför en milliliter med 0,1 molarglycin till kolonnens övre kammare och samla in antikroppen som innehåller eluaent i ett av de beredda 1,5 mlsrören och upprepa för varje rör. När hela antikroppen har samlats in och de antikroppsinnehållande elutionerna har poolats, stäng botten av en 20 centimeter lång dialysrör med en lämplig dialysrörsstängning och rör försiktigt antikropps elutionen i slangen. Stäng toppen av dialysslangen med en andra klämma och fixera dialysslangens övre klämmor på ett flytande stativ.Tillsätt en magnetisk omrörning till en bägare av PBS och placera bägaren på en magnetisk omrörare. Efter över natten dialys vid fyra grader Celsius, öppna en klämma för att tillåta lastning av hela dialysatet till en centrifugalkoncentrator med en 10 kiloDalton molekylviktsavbrott och centrifugera koncentratorn i 30 minuter vid 693 gånger G och fyra grader Celsius. I slutet av spinnet laddar du centrifugalkoncentratorn med 10 ml PBS för en andra centrifugering tills en slutlig volym antikroppslösning erhålls.För att konjugera OVA till anti-DEC-205-antikroppen, tillsätt 200 mikroliter PBS kompletterat med 500 mikrogram OVA-protein, 240 mikroliter av en nyberedd TCEP-HCL-lösning och 560 mikroliter sterilt ultrapurvatten till ett 1,5 milliliter rör för en 1,5 timmars inkubation vid rumstemperatur. Lägg samtidigt till 2,5 milligram anti-DEC-205 i 900 mikroliter PBS och 100 mikroliter nyberedd sulfo-SMCC till ett andra 1,5 milliliterrör för en 30-minuters inkubation vid 37 grader Celsius vid 550 varv per minut i ett värmeblock. I slutet av inkubationerna, placera avsaltningskolonner med lossade lock och vridna av bottnar i enskilda 15 milliliter koniska rör och centrifugera kolonnerna för att ta bort vätskan.Efter centrifugering placerar du kolonnerna i nya rör med kapsylarna borttagna och laddar långsamt antikroppen sulfo-SMCC och OVA TCEP-HCL-lösningar till mitten av den kompakta hartsbädden i en kolumn per lösning. Efter centrifugering kasserar du kolonnerna och blandar omedelbart antikropps- och OVA-lösningarna med skonsam pipettering. Ladda anti-DEC-205/OVA-lösningen på en centrifugalproteinkoncentrator och fyll koncentratorn med PBS till en volym på 15 milliliter.Centrifugera koncentratorn i fem minuter vid 2 000 gånger G och rumstemperatur och fyll koncentratorn med ytterligare 10 ml PBS. Efter centrifugering av koncentrationen i minst åtta minuter under samma centrifugförhållanden, samla försiktigt upp det koncentrerade provet från den övre kammaren. För att verifiera framgången för konjugationen genom western blot-analys, ladda en alikvot ur varje prov på en proteinstandard på en SDS-gel och kör gelén enligt standard SDS-PAGE analysprotokoll.Efter gel blotting, fläcka membranen med pepparrotsperoxidaskonjugerade antikroppar för att upptäcka anti-DEC-205 eller OVA enligt standardprotokoll. Membranen kan sedan analyseras för närvaron av respektive protein i varje prov. För att kontrollera att ELISA:s konjugation är lyckad, belägga en lämplig ELISA-platta med 96 brunnar med 100 mikroliter av anti-OVA-antikroppen per brunn och späd ut anti-DEC-205/OVA med ett förhållande på 1 till 2 och blockera bufferten för att erhålla utspädningar från sex mikrogram per milliliter till 93,8 nanogram per milliliter.Tillsätt 100 mikroliter av varje utspädning i lämpliga brunnar på den antikroppsbelagda plattan under en timmes inkubation vid rumstemperatur. I slutet av inkubationen tillsätt 100 mikroliter av pepparrotperoxidaskonjugerad antikropp mot anti-DEC-205/OVA-konjugat till plattan för en timmes inkubation vid rumstemperatur och tillsätt sedan 50 mikroliter pepparrotperoxidassubstrat till varje brunn för att möjliggöra analys av färgreaktionen med spektrofotometri. Parallell västerländsk blot analys kan användas för att upptäcka både konjugerade OVA samt konjugerad anti-DEC-205.Färgning för OVA skulle möjliggöra detektion av överflödigt fritt OVA om det finns, och färgning för anti-DEC-205 verifierar framgången för konjugationen genom en ökning av molekylvikten mellan naken anti-DEC-205 och konjugat. ELISA kan också användas för att bedöma framgången för konjugationen med en positiv koppling mellan den detekterade signalen och den analyserade mängden protein som indikerar den framgångsrika genereringen av anti-DEC-205/OVA konjugant. Flöde cytometri och immunofluorescens analys tydligt visar att anti-DEC-205 kärnan effektivt binder benmärg-härledda CD11c-positiva celler.Vaccination med anti-DEC-205/OVA i kombination med adjuvans inducerar en ökning av OVA-specifika IgG-titrar hos musmottagare jämfört med vaccination med OVA och enbart adjuvans. Dessutom inducerar anti-DEC-205/OVA effektivt överspecifika CD4- och CD8- positiva T-cellssvar med anti-DEC- 205/OVA-inducerade CD8- positiva T-cellssvar som väsentligt överstiger det som induceras av enbart OVA. För en lyckad konjugation av OVA-antigen till anti-DEC-205-antikropp är det viktigt att förbereda materialen enligt demonstrerade och att utföra konjugationsstegen under konsekventa förhållanden.Efter framgångsrik konjugation av antigenet och antikroppen är många efterföljande metoder möjliga, inklusive bindande analys och induktion av patogen eller tumör-relaterade immunitet in vivo.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

I vitro Imaging och kvantifiering av det målsökande drog Effektivitet av fluorescerande GnRH-analoger

GnRH analogues are effective targeting moieties and able to deliver anticancer agents selectively into malignant tumor cells which highly express GnRH ...

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Om dubbla motstånd mot EGFR-TKI och träffade-TKI i lunga adenokarcinom celler In Vitro med en 2-stegs-dosupptrappning procedur

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Räknar protein i enstaka celler med adresserbara Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Flytta uppåt: Ett enkelt och flexibelt In Vitro tredimensionella Invasion Assay protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR bedömning av pH, pO2, Redox Status, och koncentrationer av fosfat och glutation i den tumör mikromiljö

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolering protokoll mus monocyt-derived dendritiska celler och deras efterföljande In Vitro -aktivering med tumör immunkomplex

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

En GPC3-inriktning Bispecific antikropp, GPC3-S-Fab, med potenta cytotoxicitet

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphopeptide anrikning tillsammans med etikett-fri kvantitativa masspektrometri att undersöka Phosphoproteome vid prostatacancer

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

In vivo Immunofluorescenslokalisering för bedömning av terapeutisk och diagnostisk antikropps biodistribution i cancer forskning

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

In Vivo Targeting av Xenografted Human Cancer Cells med functionalized Fluorescent Silica Nanopartiklar i Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...