Name: chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo
Uploaded: 2021-02-05T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Yazarlar uzman teknik yardımı için S. Prettin'e teşekkür eder. Bu çalışma Helmholtz Alman Araştırma Merkezleri Birliği'nin (HGF) Helmholtz İttifakı ''Kanserlerin İmmünoterapisi' (HCC_WP2b) kapsamında sağlanan bir hibe ile desteklendi.

Açıklanan hayvan deneylerinin tümü yerel devlet kurumu (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; dosya numarası 33.12-42502-04-10/0108) tarafından onaylanmış ve ulusal ve kurumsal yönergelere göre gerçekleştirilmiştir.
1. NLDC-145 hibridoma hücre hattından αDEC-205 üretimi
<ol><li>Antikor üretimi için, bir su banyosunda 37 °C'de αDEC-205 üreten NLDC-145 hücrelerini çözün. Hücreleri 37 °C ve %5 CO'da genişletin2. ?...

<ol>
	<li>Amon, L., Hatscher, L., Heger, L., Dudziak, D., Lehmann, C. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+the+complete+repertoire+of+conventional+dendritic+cell+functions+for+cancer+immunotherapy.">Harnessing the complete repertoire of conventional dendritic cell functions for cancer immunotherapy.</a> Pharmaceutics. 12 (7), 12070663 (2020).</li><li>Banchereau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annual Review of Immunology. 18, 767-811 (2000).</li><li>Wculek, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+in+cancer+immunology+and+immunotherapy.">Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy.</a> Nature Reviews: Immunology. 20 (1), 7-24 (2020).</li><li>Kastenmuller, W., Kastenmuller, K., Kurts, C., Seder, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell-targeted+vaccines--hope+or+hype.">Dendritic cell-targeted vaccines--hope or hype.</a> Nature Reviews: Immunology. 14 (10), 705-711 (2014).</li><li>Bonifaz, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+targeting+of+antigens+to+maturing+dendritic+cells+via+the+DEC-205+receptor+improves+T+cell+vaccination.">In vivo targeting of antigens to maturing dendritic cells via the DEC-205 receptor improves T cell vaccination.</a> Journal of Experimental Medicine. 199 (6), 815-824 (2004).</li><li>Boscardin, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+targeting+to+dendritic+cells+elicits+long-lived+T+cell+help+for+antibody+responses.">Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived T cell help for antibody responses.</a> Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 599-606 (2006).</li><li>Hossain, M. K., Wall, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Dendritic+Cell+Receptors+as+Targets+for+Enhancing+Anti-Cancer+Immune+Responses.">Use of Dendritic Cell Receptors as Targets for Enhancing Anti-Cancer Immune Responses.</a> Cancers. 11 (3), 11030418 (2019).</li><li>Johnson, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+melanoma+growth+by+targeting+of+antigen+to+dendritic+cells+via+an+anti-DEC-205+single-chain+fragment+variable+molecule.">Inhibition of melanoma growth by targeting of antigen to dendritic cells via an anti-DEC-205 single-chain fragment variable molecule.</a> Clinical Cancer Research. 14 (24), 8169-8177 (2008).</li><li>Trumpfheller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microbial+mimic+poly+IC+induces+durable+and+protective+CD4++T+cell+immunity+together+with+a+dendritic+cell+targeted+vaccine.">The microbial mimic poly IC induces durable and protective CD4+ T cell immunity together with a dendritic cell targeted vaccine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2574-2579 (2008).</li><li>Idoyaga, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparable+T+helper+1+(Th1)+and+CD8+T-cell+immunity+by+targeting+HIV+gag+p24+to+CD8+dendritic+cells+within+antibodies+to+Langerin,+DEC205,+and+Clec9A.">Comparable T helper 1 (Th1) and CD8 T-cell immunity by targeting HIV gag p24 to CD8 dendritic cells within antibodies to Langerin, DEC205, and Clec9A.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (6), 2384-2389 (2011).</li><li>Sancho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+therapy+in+mice+via+antigen+targeting+to+a+novel,+DC-restricted+C-type+lectin.">Tumor therapy in mice via antigen targeting to a novel, DC-restricted C-type lectin.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (6), 2098-2110 (2008).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+antigen+delivery+to+dendritic+cells+elicits+robust+antiviral+T+cell-mediated+immunity+in+the+liver.">Targeted antigen delivery to dendritic cells elicits robust antiviral T cell-mediated immunity in the liver.</a> Scientific Reports. 7, 43985 (2017).</li><li>Kraal, G., Breel, M., Janse, M., Bruin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Langerhans'+cells,+veiled+cells,+and+interdigitating+cells+in+the+mouse+recognized+by+a+monoclonal+antibody.">Langerhans' cells, veiled cells, and interdigitating cells in the mouse recognized by a monoclonal antibody.</a> Journal of Experimental Medicine. 163 (4), 981-997 (1986).</li><li>Volckmar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+STING+activator+c-di-AMP+exerts+superior+adjuvant+properties+than+the+formulation+poly(I:C)/CpG+after+subcutaneous+vaccination+with+soluble+protein+antigen+or+DEC-205-mediated+antigen+targeting+to+dendritic+cells.">The STING activator c-di-AMP exerts superior adjuvant properties than the formulation poly(I:C)/CpG after subcutaneous vaccination with soluble protein antigen or DEC-205-mediated antigen targeting to dendritic cells.</a> Vaccine. 37 (35), 4963-4974 (2019).</li></ol>

Endositoz reseptörüne özgü antikor ve protein antijeninin kimyasal konjugasyonu, klinik öncesi fare modellerinde in vivo DC hedeflemesi için verimli ve daha da önemlisi esnek bir yaklaşım sağlar. Protokolümüzle, model antijen OVA'nın DEC-205'e özgü bir IgG antikoru için başarılı bir şekilde konjugasyonu için verimli bir yaklaşım sağlıyoruz.
Protokolümüze göre, αDEC-205 bir hibridoma hücre hattından arındırıldır ve geçmişte, tanımlandığı gibi G ...

Dendritik hücreler (DC) bağışıklık sisteminin merkezi oyuncularıdır. Antijen sunumu konusunda uzmanlaşmış çeşitli bir hücre grubudur ve başlıca işlevleri doğuştan gelen ve uyarlanabilir bağışıklık arasında köprü yapmaktır1,2. Daha da önemlisi, DC sadece verimli ve spesifik patojene yönelik yanıtlarda önemli bir rol oynamakla kalmaz, aynı zamanda antitümör bağışıklığının birçok yönüne de katılır1,3.
Konak bağışıklığındaki özel rolleri nedeniyle, DC aşılama için hedef hücreler olarak odak noktasına geldi4. Bir yaklaşım, antijene özgü immün yanıtları teşvik etmek için antijenleri DC in vivo'ya hedeflemektir ve son yıllarda, çok sayıda çalışma uygun reseptörleri tanımlamaya ve stratejileri hedeflemeye adanmıştır1,4. Örneklerden biri, endositoz indükleyen DEC-205 spesifik antikorlar tarafından hedeflenebilen C tipi lektin reseptörü DEC-205'tir. Daha da önemlisi, UYGUN adjuvanlarla kombinasyondaki DEC-205 hedeflemesinin, tümör antijenleri 3 ,5,6,7, 8, 9'akarşı antikor yanıtlarının yanı sıra uzun ömürlü ve koruyucu CD4 + veCD8+ T hücrelerini verimli bir şekilde teşvik ettiği gösterilmiştir.
DC'ye yönelik konjuge antijenlerin serbest konjuge edilmemiş antijen 3 ,5,10,11,12'denüstün olduğunu gösteren bir dizi çalışma vardır. Bu, antijenin ilgili DC hedefleme moiety'ye konjugasyonunu DC hedefleme yaklaşımlarında merkezi bir adım haline getirir. Antikorlar veya antikor parçaları aracılığıyla DC hedeflemesi durumunda, antijenler kimyasal veya genetik olarak bağlanabilir ve strateji kendi (dis) avantajlarını sağlar1. Bir yandan, genetik olarak tasarlanmış antikor-antijen yapılarında, antijen dozu üzerinde bir kontrol ve lotlar arasında üstün karşılaştırılma sağlayan konumvardır 1. Bununla birlikte, kimyasal konjugasyon daha az hazırlık gerekir ve özellikle deneysel ve klinik öncesi modellerde farklı antijenleri ve / veya aşılama stratejilerini test etmeye ve karşılaştırmaya çalışırken daha fazla esneklik sağlar.
Burada, ovalbumin (OVA) model protein antijeni olarak, farelerde in vivo DC hedeflemeye uygun bir DEC-205 spesifik IgG2a antikoru (αDEC-205) için verimli ve güvenilir kimyasal konjugasyon için bir protokol sunuyoruz. İlk olarak, αDEC-205 NLDC-145 hibridoma hücrelerinden arındırılır13. Kimyasal konjugasyon için, NHS (N-hydroxysuccinimide) ester ve maleimid gruplarını içeren heterobifunctional crosslinker sülfosinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] sikloheksane-1-karboksilat (sulfo-SMCC), amin ve sülfhidrit içeren moleküllerin kovalansiyel konjugasyonuna izin veren kullanılır. Spesifik olarak, antikorun birincil aminleri başlangıçta sülfo-SMCC ile reaksiyona girer ve ortaya çıkan maleimid-aktive αDEC-205 daha sonra TCEP-HCl (Tris (2-karboksit) fosfin hidroklorür yoluyla azaltılmış sülfhidrit içeren OVA proteini ile reaksiyona girer. Nihai ürün kimyasal olarak konjuge αDEC-205/OVA(Şekil 1). Kimyasal konjugasyonun kendisinin ötesinde, protokolümüz fazla OVA'nın konjugeden çıkarılmasını ve batı blot analizi ve belirli bir enzime bağlı immünorbent test yoluyla başarılı konjugasyonun doğrulanmasını açıklar. Ova ve diğer proteinleri veya immünojenik peptitleri αDEC-205'e kimyasal olarak konjuge etmek için bu yaklaşımı geçmişte başarıyla çalıştırdık. CD11c+ hücreler in vitro'ya verimli bağlamanın yanı sıra hücresel ve humoral bağışıklığın verimli indüksiyonunu vivo.
Elbette, bu yöntemin dezavantajları vardır, örneğin çok-çok karşılaştırılma ve antijenin son konjuge içinde tam olarak yapılması gibi. Bununla birlikte, kimyasal konjugasyon, genetik olarak tasarlanmış yapılara kıyasla antikor ve protein antijen seçiminde deneysel esneklik sağlar. Bu nedenle, bu yaklaşımın özellikle klinik öncesi fare modellerinde DC hedeflemesinde verimliliği için farklı antijenlerin değerlendirilmesinde, özellikle de spesifik antitümör immün yanıtlar bağlamında değerli olduğuna inanıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>antibody buffer 2 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>antibody buffer 5 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % FBS in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 4 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4 % (w/v) Slim-Fast Chocolate powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blocking buffer 10 %</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 % milk powder (w/v) in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T25</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>690175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (690195 )</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T75</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>658175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR&#160; filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (658195)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture flask T175</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>661175</td>
			<td>we use standard CELLSTAR filter cap cell culture flasks; alternatively use suspension culture flask (661195)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal concentrator MWCO 10 kDa</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS2001</td>
			<td>Vivaspin 20 centrifugal concentrator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal protein concentrator MWCO 100 kDa, 5 - 20 ml</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88532</td>
			<td>Pierce Protein Concentrator, PES 5 -20 ml; we use the Pierce Concentrator 150K MWCO 20mL (catalog number 89921), which is however no longer available&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge bottles</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>525-2314</td>
			<td>PPCO (polypropylene copolymer) with PP (polypropylene) screw closure, 500 ml; obtained from VWR, Germany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coating buffer (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1 M sodium bicarbonate (NaHCO3) in H2O (pH 9.6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desalting columns MWCO 7 kDa</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89891</td>
			<td>Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent ELISA (HRPO substrate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Merck</td>
			<td>T8665-100ML</td>
			<td>3,3&#8242;,5,5&#8242;-Tetramethylbenzidine (TMB) liquid substrate system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>detection reagent western blot (HRPO substrate)</td>
			<td>Roche/Merck</td>
			<td>12 015 200 01</td>
			<td>Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis tubing MWCO 12 - 14 kDa</td>
			<td>SERVA Electrophoresis</td>
			<td>44110</td>
			<td>Visking dialysis tubing, 16 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA 96-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>442404</td>
			<td>MaxiSorp Nunc-Immuno Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum</td>
			<td>PAN-BIOtech</td>
			<td>P40-47500</td>
			<td>FBS Good forte</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISF-1 medium</td>
			<td>Biochrom/bioswisstec</td>
			<td>F 9061-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T145.2</td>
			<td>powdered milk, blotting grade, low in fat; alternatively we have also used conventional skimmed milk powder from the supermarket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NLDC-145 hybridoma</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HB-290</td>
			<td>if not already at hand, the hybridoma cells can be acquired from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>non-reducing SDS sample buffer 4 x&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for 12 ml: 4 ml of 10 % SDS, 600 &#181;l 0.5 M Tris-HCl (ph 6.8), 3.3 ml sterile H2O, 4 ml glycerine, 100 &#181;l of 5 % Bromphenol Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ovalbumin</td>
			<td>Hyglos (via BioVendor)</td>
			<td>321000</td>
			<td>EndoGrade OVA ultrapure with &#60;0.1 EU/mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Gibco Penicillin/Streptomycin 10.000 U/ml; alternatively Gibco Penicillin/Streptomycin 5.000 U/ml (15070-063) can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG polyethylene terephthalate glycol cell culture roller bottles</td>
			<td>Nunc In Vitro</td>
			<td>734-2394</td>
			<td>standard PDL-coated, vented (1.2X), 1050 cm&#178;, 100 - 500 ml volume; obtained from VWR, Germany&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips</td>
			<td>Merck</td>
			<td>109535</td>
			<td>pH indicator strips 0-14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG(H+L)-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-062</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:5000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rat-IgG+IgM-HRPO antibody&#160; (ELISA)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>112-035-068</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal goat &#945;rabbit-IgG-HRPO (western blot)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch&#160;</td>
			<td>111-035-045&#160;</td>
			<td>obtained from Dianova, Germany; used at 1:2000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA (ELISA)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab181688</td>
			<td>used at 3 ng/&#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyclonal rabbit &#945;OVA antibody (western blot)</td>
			<td>OriGene</td>
			<td>R1101</td>
			<td>used at 1:3,000 for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose column</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>P3296</td>
			<td>5 ml Protein G Sepharose, Fast Flow are packed onto an empty column PD-10 (Merck, GE 17-0435-01)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein standard</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td>PageRuler Prestained Protein ladder 10 - 180 kDa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>immobilon-P PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber plug</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5230217</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN rubber stoppers (lower &#934; 17 mm; upper &#934; 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silicone tube</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5430925</td>
			<td>DEUTSCH &#38; NEUMANN (inside &#934; 1 mm; outer &#934; 3 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim-Fast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>we have used regular Slim-Fast Chocolate freely available at the pharmacy as in this western blot approach it yielded better results than milk powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stopping solution (ELISA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1M H2SO4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfo-SMCC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22322</td>
			<td>Pierce Sulfo-SMCC Cross-Linker; alternatively use catalog number A39268 (10 x 2 mg)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter unit 0.22 &#181;m&#160;</td>
			<td>Merck/Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 &#181;m, PVDF, 33 mm, gamma sterilized&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe 10 ml</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Disposable syringes Injekt&#174; Solo B.Braun</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterican&#174; cannulas</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td></td>
			<td>Sterican&#174; G 20 x 1 1/2&#34;&#34;; 0.90 x 40 mm; yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBS-T</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tris-buffered saline containing 0.1 % (v/v) Tween 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A35349</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubing connector</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td></td>
			<td>Kleinfeld miniature tubing connectors for silicone tube</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chemical conjugation of a purified dec-205-directed antibody with full-length protein for targeting mouse dendritic cells in vitro and in vivo

Çapraz sunum dendritik hücrelere (DC) hedeflenen antijen in vivo, T efektör hücre yanıtlarını verimli bir şekilde indükler ve aşı tasarımında değerli bir yaklaşım sergiler. Antijen, DEC-205 gibi endositoz reseptörlerine özgü antikorlar aracılığıyla DC'ye teslim edilir ve bu da alımı, işlenmesini ve MHC sınıfı I ve II sunumlarını teşvik eder.
İstenilen antijenin uygun bir antikora verimli ve güvenilir bir şekilde konjugasyonu DC hedeflemesinde kritik bir adımdır ve diğer faktörlerin yanı sıra antijenin formatına bağlıdır. Tam boy proteinin saflaştırılmış antikorlara kimyasal konjugasyonu olası bir stratejidir. Geçmişte, farelerde in vivo DC hedefleme çalışmaları için antijen ovalbumin (OVA) ve DEC-205'e özgü IgG2a antikorunun (αDEC-205) çapraz bağlamasını başarıyla kurduk. Protokolün ilk adımı, antikorun NLDC (lenfoid olmayan dendritik hücreler)-145 hibridomanın afinite kromatografisi ile üstnatantından arındırılmasıdır. Saflaştırılmış antikor, sülfo-SMCC (sülfoksinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] sikloheksan-1-karboksila) tarafından kimyasal konjugasyon için aktive edilir.te) aynı zamanda OVA proteininin sülfhidrit grupları TCEP-HCl (tris (tris (2-karboksit) fosfin hidroklorür ile inkübasyon yoluyla maruz kalır. Aşırı TCEP-HCl ve sülfo-SMCC çıkarılır ve antijen gece kaplin için aktif antikor ile karıştırılır. Elde edilen αDEC-205/OVA konjuge konsantre edilir ve ilişkisiz OVA'dan kurtulur. OVA'nın αDEC-205'e başarılı bir şekilde konjugasyonu batı blot analizi ve enzime bağlı immünosorbent tahlil (ELISA) ile doğrulanır.
Karaciğerde sitotoksik T hücre yanıtlarını teşvik etmek ve DEC-205+ DC'nin in vivo hedeflemesini takiben humoral ve hücresel bağışıklığı teşvik etme potansiyelleri için farklı yardımcıları karşılaştırmak için kimyasal olarak çapraz bağlı αDEC-205/OVA'yı başarıyla kullandık. Bunun ötesinde, bu tür kimyasal olarak birleştirilmiş antikor/ antijen konjugeleri, tümör antijenlerine aşı yanıtlarının verimli bir şekilde indüksiyonu için değerli araçlar sunar ve çeşitli tümör türlerinin önlenmesi ve tedavisi ile ilgili klasik bağışıklama yaklaşımlarından daha üstün olduğu kanıtlanmıştır.

Bu protokol kullanılarak αDEC-205 ila OVA proteininin kimyasal konjugasyonu tipik olarak in vivo DC hedefleme yaklaşımları için verimli αDEC-205/OVA üretimine izin verecektir. Tekniğin kendisini doğrulamak ve verilen konjugenin işlevselliğini test etmek için farklı stratejiler vardır. Batı blot analizi ve ELISA başarılı konjugasyonu doğrulamak ve aynı zamanda potansiyel olarak serbest OVA'yı tespit etmek için kullanılır (Şekil 2</str...

Watch this Scientific Journal Video about Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo at JoVE.com

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Model antijen ovalbumin'in in vivo dendritik hücre hedeflemesi için endositoz reseptörüne özgü antikora kimyasal konjugasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, antikorun saflaştırılmasını, antijenin kimyasal konjugasyonunu, ayrıca konjugenin saflaştırılmasını ve verimli konjugasyonun doğrulanmasını içerir.

Vitro ve In Vivo'da Fare Dendritik Hücrelerini Hedeflemek için Tam Uzunlukta Proteinli Saflaştırılmış DEC-205 Yönlendirilmiş Antikorun Kimyasal Konjugasyonu

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

Tüm deneysel durumun dikkatlice optimize edildiği bu protokol, DEC-205 antikorunun OVA antijenine başarılı ve verimli bir kimyasal konjugasyonunu kolaylaştırmak için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajları, protein antijen ve antikorunun esnek bir şekilde seçilmesine izin vemesi ve bu bileşenlerin genetik füzyona dayanmamasıdır. Bu protokolü ayrıca in vivo DC hedeflemesi için hepatit C virüs proteinleri ve anti-DEC-205 konjugeleri üretmek için de kullandık.Bu aynı şekilde anti-tümör aşılama yaklaşımları için de değerli olabilir. Anti-DEC-205 üretimine başlamak için, %1 penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş 37 santigrat derece ISF-1 ortamının dokuz mililitresinde bir ila beş milyon çözünülmüş kriyo korunmuş NLDC 145 hücresinin bir mililitre hacmini yeniden depola, ve hücreleri 37 santigrat derecede inkübasyon için 25 santimetrekarelik bir hücre kültürü şişesine ve 24 ila 48 saat boyunca% 5 karbondioksite tohumlar. Hücreler% 70 izdiah süresine ulaştığında, tüm hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın.Peletin 12 mililitre taze tam 37 derece ISF-1 orta derecesinde yeniden ıslatın ve hücreleri 75 santimetrekarelik bir şişede yeniden plakalayın. 48 ila 72 saatlik kültürden sonra, %70'lik birikme kültürünü iki yeni 75 santimetrekare şişenin her biri arasında bölün ve her şişeye altı mililitre taze komple ISF-1 ortamı ekleyin. Kültürler% 70 izdiah ulaştığında, tüm hücreleri toplamak ve her genişletilmiş NLDC 145 hücre süspansiyonunun 10 mililitresini ayrı PETG silindir şişelerine aktarmak için hücre kültürü şişe altlarını ve kültür yüzeylerini hücre süspansiyonu ile yıkamak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın.Daha sonra her makara şişesi kültürüne ve kültürüne 37 santigrat derecede, % 5 karbondioksit ve üç gün boyunca dakikada 25 mermi ile 140 mililitre tam ISF-1 ortamı ekleyin. NLDC 145 süperndanktan antikor saflaştırması için, silikon tüpün ucunu süpernatan dolgulu kabın içine yerleştirin ve 800 mililitre süpernatantın bir Protein G Sepharose sütununda damla yönünde çalışmasına izin verin. Elution için, yirmi 1,5 mililitre tüpün her birine 1,5 molar Tris-HCL'nin 100 mikrolitresini ekleyin ve kauçuk fişi kolondan çıkarın.Bir mililitre 0,1 molar glisini sütunun üst odasına aktarın ve eluent içeren antikorları hazırlanan 1,5 mililitre tüplerden birine toplayın ve her tüp için tekrarlayın. Tüm antikor toplandığında ve antikor içeren elutionlar birikmişse, 20 santimetre uzunluğundaki diyaliz tüpünün altını uygun bir diyaliz boru kapatma ile kapatın ve antikor elüasyonunu dikkatlice boruya boru haline alın. Diyaliz tüpünün üst kısmını ikinci bir kelepçe ile kapatın ve diyaliz tüpünün üst kelepçesini yüzen bir standa sabitleyin.Pbs'in bir kabına manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin ve beheri manyetik bir karıştırıcının üzerine yerleştirin. Dört santigrat derecede gece diyalizden sonra, tam kadrandatın 10 kiloDalton moleküler ağırlık kesmeli bir santrifüj konsantratöre yüklenmesine izin vermek için bir kelepçe açın ve yoğunlaştırıcıyı 693 kez G ve dört santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin. Dönüşün sonunda, son bir ila 1,5 mililitre antikor çözeltisi elde edilene kadar ikinci bir santrifüjleme için santrifüj konsantratörü 10 mililitre PBS ile yükleyin.OVA'yı anti-DEC-205 antikora çekmek için, oda sıcaklığında 1,5 saatlik bir inkübasyon için 1,5 mililitrelik bir tüpe 500 mikrogram OVA proteini, 240 mikrolitre taze hazırlanmış bir TCEP-HCL çözeltisi ve 560 mikrolitre steril ultra saf su ile desteklenmiş 200 mikrolitre PBS ekleyin. Aynı zamanda, bir ısıtma bloğunda dakikada 550 devirde 37 santigrat derecede 30 dakikalık bir inkübasyon için ikinci bir 1,5 mililitrelik tüpe 900 mikrolitre PBS'de 2,5 miligram anti-DEC-205 ve taze hazırlanmış 100 mikrolitre sülfo-SMCC ekleyin. Kuluçkaların sonunda, tuzdan arındırıcı sütunları gevşetilmiş kapaklarla yerleştirin ve altlardan bükülmüş 15 mililitrelik konik tüplere yerleştirin ve sıvıyı çıkarmak için sütunları santrifüj edin.Santrifüjlemeden sonra, kolonları kapakları çıkarılmış yeni tüplere yerleştirin ve antikor sülfo-SMCC ve OVA TCEP-HCL çözeltilerini yavaşça çözelti başına bir sütunluk kompakt reçine yatağının ortasına yükleyin. Santrifüjlemeden sonra, kolonları atın ve antikor ve OVA çözeltilerini hemen hafif pipetleme ile karıştırın. Anti-DEC-205/OVA çözeltisini bir santrifüj protein konsantratörüne yükleyin ve konsantratörü PBS ile 15 mililitre hacme doldurun.Konsantratörü 2.000 kat G ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüjleyin ve konsantratöre 10 mililitre PBS daha doldurun. Konsantrasyonu aynı santrifüj koşullarında en az sekiz dakika santrifüjledikten sonra, konsantre numuneyi üst odadan hafifçe toplayın. Batı blot analizi ile konjugasyonun başarısını doğrulamak için, bir protein standardı üzerindeki her numuneden bir aliquot'u bir SDS jeline yükleyin ve jeli standart SDS-PAGE analiz protokollerine göre çalıştırın.Jel şişkinliğinden sonra, standart protokollere göre anti-DEC-205 veya OVA'yı tespit etmek için membranları yaban turpu peroksidaz konjuge antikorlarla lekelayın. Membranlar daha sonra her numunede ilgili proteinin varlığı için analiz edilebilir. ELISA tarafından konjugasyonun başarısını doğrulamak için, uygun bir 96 kuyu elisa plakasını kuyu başına 100 mikrolitre anti-OVA antikoru ile kaplayın ve anti-DEC-205/OVA'yı bir ila iki oranda seri olarak seyreltin ve mililitre başına altı mikrogramdan 93,8 nanograma kadar seyreltme elde etmek için tamponu engelleyin.Oda sıcaklığında bir saatlik kuluçka için antikor kaplı plakanın uygun kuyularına her seyreltmeden 100 mikrolitre ekleyin. Kuluçkanın sonunda, oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyon için plakaya anti-DEC-205/OVA konjuge antikora karşı 100 mikrolitre yaban turpu peroksidaz konjuge antikoru ekleyin, ardından spektrofotometri ile renk reaksiyonunun analiz edilmesine izin vermek için her kuyuya 50 mikrolitre yaban turpu peroksidaz substratı ekleyin. Paralel Batı blot analizi, hem konjuge OVA'yı hem de eşli anti-DEC-205'i tespit etmek için kullanılabilir.OVA için boyama, mevcutsa fazla serbest OVA'nın tespit edilmesine izin verecektir ve anti-DEC-205 için boyama, çıplak anti-DEC-205 ile konjuge arasındaki moleküler ağırlıktaki artışla konjugasyonun başarısını doğrular. ELISA, tespit edilen sinyal ile anti-DEC-205/OVA konjugantının başarılı bir şekilde üretilmesini gösteren analiz edilen protein miktarı arasındaki pozitif ilişki ile konjugasyonun başarısını değerlendirmek için de kullanılabilir. Akış sitometrisi ve immünofluoresans analizi, anti-DEC-205 çekirdeğinin kemik iliği türevi CD11c pozitif hücreleri verimli bir şekilde bağladığını açıkça göstermektedir.Anti-DEC-205/OVA ile adjuvan ile aşılama, fare alıcılarında OVA ve adjuvan ile aşılamaya kıyasla OVA'ya özgü IgG titrelerinde artışa neden olan bir artışa nedendir. Ayrıca, anti-DEC-205/OVA, sadece OVA tarafından indükleneni önemli ölçüde aşan anti-DEC-205/OVA kaynaklı CD8-pozitif T hücre yanıtları ile aşırı spesifik CD4 ve CD8 pozitif T hücre yanıtlarını etkili bir şekilde indükler. OVA antijeninin anti-DEC-205 antikora başarılı bir konjugasyonu için, malzemelerin gösterildiği gibi hazırlanması ve konjugasyon adımlarının tutarlı koşullar altında gerçekleştirilmesi önemlidir.Antijen ve antikorun başarılı bir şekilde konjugasyonundan sonra, bağlayıcı analiz ve patojen veya tümöre bağlı bağışıklığın indüksiyonu da dahil olmak üzere çok sayıda sonraki yaklaşım mümkündür.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

In Vitro Imaging and Quantification of the Drug Targeting Efficiency of Fluorescently Labeled GnRH Analogues

In Vitro Görüntüleme ve floresan etiketli GnRH Analoglarının İlaç Hedefleme Etkinliğinin nicelleştirmesinde

GnRH analogues are effective targeting moieties and able to deliver anticancer agents selectively into malignant tumor cells which highly express GnRH ...

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

2-adım doz-yükseltme yordamını akciğer adenokarsinom hücre Vitro EGFR-TKI ve bir araya geldi-TKI çift direnç kurulması

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Proteinler adresli damlacık Microarrays ile tek kişilik hücrelerde sayma

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Vivo EPR pH, pO2, Redox durumu ve fosfat konsantrasyonları ve glutatyon tümör Microenvironment olarak değerlendirilmesi

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Yalıtım Protokolü fare monosit kaynaklı dendritik hücreler ve onların sonraki Vitro harekete geçirmek ile tümör bağışıklık kompleksleri

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

GPC3 hedefleme Bispecific antikor, GPC3-S-Fab, güçlü sitotoksisite

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Prostat kanserinde Phosphoproteome araştırmak için etiket içermeyen nicel kütle spektrometresi ile birleştiğinde Phosphopeptide zenginleştirme

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

Kanser Araştırmalarında Terapötik ve Tanısal Antikor Biyodağılımının Değerlendirilmesi için In Vivo Immunofluoresence Lokalizasyonu

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Zebrabalığında Fonksiyonel Floresan Silika Nano partikülleri ile Ksenogreftli İnsan Kanser Hücrelerinin Vivo Hedeflemesinde

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...