Name: in-nucleus hi-c in drosophila cells
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af UNAM Technology Innovation and Research Support Program (PAPIIT) tilskud nummer IN207319 og Science and Technology National Council (CONACyT-FORDECyT) tilskud nummer 303068. A.E.-L. er en kandidatstuderende støttet af Science and Technology National Council (CONACyT) CVU nummer 968128.

1. Fiksering
<ol><li>Start med 10 millioner Schneiders linje 2 plus (S2R+) celler til at forberede 17,5 mL af en celleaffjedring i Schneider-mediet, der indeholder 10% føtal kvægserum (FBS) ved stuetemperatur (RT).</li>
	<li>Der tilsættes methanolfri formaldehyd for at opnå en endelig koncentration på 2 %. Bland og inkuber i 10 minutter på RT, idet du sørger for at blande hvert minut. BEMÆRK: Formaldehyd er et farligt kemikalie. Følg de relevante sundheds- og sikkerhedsbestemmelser, og arbejd i røghætten....

<ol>
	<li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+territories,+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells.">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li><li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485, 376-380 (2012).</li><li>Sexton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+folding+and+functional+organization+principles+of+the+Drosophila+genome.">Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome.</a> Cell. 148 (3), 458-472 (2012).</li><li>Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+domains:+the+unit+of+chromosome+organization.">Chromatin domains: the unit of chromosome organization.</a> Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).</li><li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+3D+genome.">Organization and function of the 3D genome.</a> Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).</li><li>Lupi&#225;&#241;ez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+TADs:+how+alterations+of+chromatin+domains+result+in+disease.">Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease.</a> Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).</li><li>Phillips, J. E., Corces, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF:+master+weaver+of+the+genome.">CTCF: master weaver of the genome.</a> Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).</li><li>Hong, S., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+characterization+of+chromatin+domain+boundary-associated+genomic+elements.">Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements.</a> Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).</li><li>Zuin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+and+CTCF+differentially+affect+chromatin+architecture+and+gene+expression+in+human+cells.">Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+inversion+of+CTCF+sites+alters+genome+topology+and+enhancer/promoter+function.">CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function.</a> Cell. 162, 900-910 (2015).</li><li>Lupi&#225;&#241;ez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions.">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161, 1012-1025 (2015).</li><li>Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+transcription+in+shaping+the+spatial+organization+of+the+genome.">The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).</li><li>Merkenschlager, M., Nora, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+and+cohesin+in+genome+folding+and+transcriptional+gene+regulation.">CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).</li><li>Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+and+cohesin+regulate+chromatin+loop+stability+with+distinct+dynamics.">CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics.</a> Elife. 6, 1-10 (2017).</li><li>Van Bortle, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulator+function+and+topological+domain+border+strength+scale+with+architectural+protein+occupancy.">Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy.</a> Genome Biology. 15, 82 (2014).</li><li>Ram&#237;rez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies.">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> Nature Communications. 9, 189 (2018).</li><li>Ulianov, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+chromatin+and+transcription+play+a+key+role+in+chromosome+partitioning+into+topologically+associating+domains.">Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains.</a> Genome Research. 26, 70-84 (2016).</li><li>Rowley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionarily+conserved+principles+predict+3D+chromatin+organization.">Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization.</a> Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).</li><li>Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actual+ligation+frequencies+in+the+chromosome+conformation+capture+procedure.">Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure.</a> PLoS One. 8, 60403 (2013).</li><li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disclosure+of+a+structural+milieu+for+the+proximity+ligation+reveals+the+elusive+nature+of+an+active+chromatin+hub.">Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub.</a> Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).</li><li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+Hi-C+reveals+cell-to-cell+variability+in+chromosome+structure.">Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure.</a> Nature. 502, 59-64 (2013).</li><li>Rao, S. S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping.">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li><li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Hi-C+results+using+in-solution+versus+in-nucleus+ligation.">Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation.</a> Genome Biology. 16, 175 (2015).</li><li>Arzate-Mej&#237;a, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+dissection+of+domain+boundaries+affect+genome+topology+and+gene+transcription+in+Drosophila.">In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila.</a> Nature Communications. 11, 894 (2020).</li><li>Schoenfelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+capture+Hi-C:+high-resolution,+genome-wide+profiling+of+promoter+interactions.">Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).</li><li>Servant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiC-Pro:+an+optimized+and+flexible+pipeline+for+Hi-C+processing.">HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing.</a> Genome Biology. 16, 259 (2015).</li><li>Philip, E., M&#229;ns, M., Sverker, L., Max, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+Summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 10, 1093 (2016).</li><li>Wingett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiCUP:+pipeline+for+mapping+and+processing+Hi-C+data.">HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data.</a> F1000 Research. 4, 1310 (2015).</li><li>Imakaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+correction+of+Hi-C+data+reveals+hallmarks+of+chromosome+organization.">Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization.</a> Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).</li><li>Akdemir, K. C., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiCPlotter+integrates+genomic+data+with+interaction+matrices.">HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices.</a> Genome Biolog. 16, 198 (2015).</li><li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies.">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> Nature Communications. 9, 189 (2018).</li><li>Ando-Kuri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+and+promoter-centric+3D+genome+organization+temporally+resolved+during+a+circadian+cycle.">The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Cuellar-Partida, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+priors+for+identifying+active+transcription+factor+binding+sites.">Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites.</a> Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9, 137 (2008).</li><li>Ong, C. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribosyl)ation+regulates+insulator+function+and+intrachromosomal+interactions+in+Drosophila.">Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila.</a> Cell. 155 (1), 148-159 (2013).</li><li>Fres&#225;n, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulator+protein+CTCF+regulates+Drosophila+steroidogenesis.">The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis.</a> Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).</li><li>Quinodoz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+promotes+the+formation+of+spatial+compartments+in+the+nucleus.">RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus.</a> Cell. 174, 744-757 (2018).</li><li>Olivares-Chauvet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+pairwise+and+multi-way+chromosomal+conformations+using+chromosomal+walks.">Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks.</a> Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).</li><li>Beagrie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+multi-enhancer+contacts+captured+by+genome+architecture+mapping.">Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping.</a> Nature. 543, 519-524 (2017).</li><li>Redolfi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DamC+reveals+principles+of+chromatin+folding+in+vivo+without+crosslinking+and+ligation.">DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).</li><li>Maxwell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiChIP:+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture.">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13, 919-922 (2016).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-BERST:+Defining+subnuclear+proteomic+landscapes+at+genomic+elements+with+dCas9-APEX2.">C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2.</a> Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).</li></ol>

Den in-nukleus Hi-C-metode, der præsenteres her, har gjort det muligt detaljeret udforskning af Drosophila-genomtopologien i høj opløsning, hvilket giver et overblik over genomiske interaktioner på forskellige genomiske skalaer, fra kromatinsløjfer mellem regulerende elementer som initiativtagere og forstærkere til TAD'er og identifikation af store rum25. Den samme teknologi er også blevet anvendt effektivt på pattedyrvæv med nogle modifikationer33. For eksempel, n...

I eukaryoter er genomet opdelt i kromosomer, der besætter specifikke områder i det nukleare rum under interfase1. Kromatin danner kromosomer kan opdeles i to hovedstater: en af tilgængelige chromatin, der er transskriptionalt eftergivende, og den anden af kompakt chromatin, der er transskriptionalt undertrykkende. Disse chromatin stater adskille og sjældent blandes i det nukleare rum, danner to forskellige rum i kernen2. På sub-megabaseskalaen adskiller grænser domæner for højfrekvente chromatininteraktioner, kaldet TAD'er, der markerer kromosomal organisation3,4,5. Hos pattedyr er TAD-grænser besat af sammenhænge og CCCTC-bindende faktor (CTCF)6,7,8. Den cohesin komplekse ekstruderer chromatin og stopper ved CTCF-bindingssteder, der bortskaffes i konvergent orientering i den genomiske sekvens for at danne stabile chromatinsløjfer9,10,13,14. Genetisk forstyrrelse af CTCF DNA-bindingsstedet ved grænserne eller reduktionen af CTCF og cohesinproteintæthed resulterer i unormale interaktioner mellem regulatoriske elementer , tab afTAD-dannelseog deregulering af genekspression 9,10,11,13,14.
I Drosophila er grænserne mellem TAD'er besat af flere APs, herunder grænseelementrelateret faktor 32 kDa (BEAF-32), Motif 1 bindende protein (M1BP), centrosomalprotein 190 (CP190), suppressor af hårvinge (SuHW) og CTCF og beriges med aktive histoneændringer og Polymerase II16,17,18. Det er blevet foreslået, at i Drosophila vises TAD'er som en konsekvens af transskription13,17,19, og den nøjagtige rolle for uafhængige APs i grænsedannelse og isoleringsegenskaber undersøges stadig. Om domæner i Drosophila er en eneste konsekvens af sammenlægningen af regioner med lignende transskriptionsstater, eller om APs, herunder CTCF, bidrager til grænsedannelse, er således endnu ikke fuldt ud karakteriseret. Udforskning af genomiske kontakter ved høj opløsning har været mulig gennem udvikling af kromosom kropsbygningsfangstteknologier kombineret med næste generations sekventering. Hi-C-protokollen blev først beskrevet med ligationstrinnet udført "i opløsning"2 i et forsøg på at undgå falske ligationsprodukter mellem kromatinefragmenter. Flere undersøgelser pegede imidlertid på erkendelsen af, at det nyttige signal i dataene kom fra ligationsprodukter dannet ved delvist lysede kerner, der ikke var i opløsning20,21.
Protokollen blev derefter ændret til at udføre ligationen inde i kernen som en del af encellet Hi-C eksperiment22. In-nukleus Hi-C-protokollen blev efterfølgende indarbejdet i cellepopulationen Hi-C for at give en mere ensartet dækning over hele spektret af genomiske afstande og producere data med mindre teknisk støj23,24. Protokollen, der er beskrevet i detaljer her, er baseret på befolkningen i kernen Hi-C protokol23,24 og blev brugt til at undersøge konsekvenserne af genetisk fjernelse af DNA-bindende motiver for CTCF og M1BP fra en domænegrænse ved Notch genet locus i Drosophila25. Resultaterne viser, at en ændring af DNA-bindende motiver for APs på grænsen har drastiske konsekvenser for Notch domæne dannelse, større topologiske defekter i regionerne omkring Notch locus, og genekspression deregulering. Dette indikerer, at genetiske elementer ved domænegrænser er vigtige for vedligeholdelsen af genomtopologi og genekspression i Drosophila25.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% (vol/vol) paraformaldehyde solution</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dATP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>CA1524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClaI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0197S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVARIS Ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>LE220-M220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut Smart</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B72002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptabidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Dna PolI large fragment</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow exo(-)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0210S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B020S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MboI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0147M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40-Igepal</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CA-420</td>
			<td>Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE adapter 1.0</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>5&#39;-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG 
			GAATGCCGAG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE adapter 2.0</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>5&#39;-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT 
			CTTCCGATCT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE PCR primer 1.0</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>5&#39;-AATGATACGGCGACCACCGAGAT 
			CTACACTCTTTCCCTACACGACG 
			CTCTTCCGATCT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE PCR primer 2.0</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>5&#39;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 
			ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA 
			ACCGCTCTTCCGATCT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1 (known interaction, Figure 2A)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5&#39;-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2 (known interactions, Figure 2A)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5&#39;-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablet</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109142001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRI Beads</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>B23318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15224-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase (PNK)&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqPhusion</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-ionic surfactant for quenching of SDS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in-nucleus hi-c in drosophila cells

Genomet er organiseret i topologisk associerende domæner (TAD'er) afgrænset af grænser, der isolerer interaktioner mellem domæner. I Drosophila undersøges de mekanismer, der ligger til grund for TAD-dannelsen og -grænserne, stadig. Anvendelsen af den in-nukleus Hi-C-metode, der er beskrevet her, bidrog til at dissekere funktionen af arkitektoniske protein (AP)-bindingssteder ved TAD-grænser, der isolerer Notch-genet. Genetisk modifikation af domænegrænser, der forårsager tab af APs, resulterer i TAD-fusion, transskriptionelle defekter og langtrækkende topologiske ændringer. Disse resultater gav dokumentation for genetiske elementers bidrag til domænegrænsedannelse og genudtrykskontrol i Drosophila. Her er in-nucleus Hi-C-metoden blevet beskrevet i detaljer, hvilket giver vigtige checkpoints til at vurdere kvaliteten af eksperimentet sammen med protokollen. Også vist er de nødvendige antal sekventeringslæsninger og gyldige Hi-C-par til at analysere genomiske interaktioner på forskellige genomiske skalaer. CRISPR/Cas9-medieret genetisk redigering af regulatoriske elementer og profilering i høj opløsning af genomiske interaktioner ved hjælp af denne in-nukleus Hi-C-protokol kan være en stærk kombination til undersøgelse af genetiske elements strukturelle funktion.

Nedenfor beskrives resultaterne af en vellykket Hi-C-protokol (se en oversigt over Hi-C-protokolarbejdsgangen i Figur 1A). Der er flere kvalitetskontrol checkpoints under in-kernen Hi-C eksperiment. Prøve aliquots blev indsamlet før (UD) og efter (D) kromatin begrænsning trin samt efter ligation (L). Crosslinks blev vendt, og DNA blev renset og kørt på en agarose gel. En smøre på 200-1000 bp blev observeret, når begrænsning med Mbo I var en succes(Figur 1B</stro...

Watch this Scientific Journal Video about In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells at JoVE.com

In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells

Genomet er organiseret i det nukleare rum i forskellige strukturer, der kan afsløres gennem kromosom kropsbygningsfangstteknologier. In-nucleus Hi-C-metoden giver en genomdækkende samling af chromatininteraktioner i Drosophila-cellelinjer, som genererer kontaktkort, der kan udforskes ved megabaseopløsning på begrænsningsfragmentniveau.

In-Nucleus Hi-C i Drosophila Cells

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, ...

Kernen Hi-C protokoller tillader udforskning af kromosomale bekræftelse ved forskellige opløsning for karakterisering af chromatin sløjfer, domæner, og rum organisere genomet. Denne protokol giver høj opløsning profilering af genomiske interaktioner på forskellige skalaer, hvilket giver en mere ensartet dækning over hele spektret af genomiske afstande og data med mindre teknisk støj. At kombinere denne protokol med genetisk redigering er en stærk strategi for test af genetiske elementers strukturelle funktion.Det kan også anvendes til karakterisering af strukturelle variationer, der fører til sygdom. Kernen Hi-C-protokollen kan anvendes til at udforske genomorganisationen af ethvert eukaryote genom. Gør SDS og Triton behandling opdeler eventuelle nukleare klumper ved pipettering som aggregater forstyrre enzymatisk reaktion effektivitet, og sørg for at udføre passende kvalitetskontrol foranstaltning forud for sekventering.Begynd med at tilsætte methanolfri formaldehyd til en gang 10 til de syv Schneiders Line 2 Plus Drosophila-celler i 17,5 milliliter Schneider-medium suppleret med 10% FBS til en endelig koncentration på 2%Inkuber cellerne i 10 minutter ved stuetemperatur med blanding hvert 60. og tilsæt glycin til en endelig koncentration på 0,125 molar med blanding. Efter fem minutter ved stuetemperatur og 15 minutter på is opsamles cellerne ved centrifugering, og pelletpens forsigtigt opsuges i 25 milliliter kold PBS, og cellerne opsamles med en anden centrifugering. Ved afslutningen af centrifugeringen opsuges cellerne i en milliliter iskold lysisbuffer til optælling og justeres cellerne til en 1 gange 10 til de seks celler pr. milliliterkoncentration.Inkuber cellerne på is i 30 minutter, invertere røret hvert andet minut for at blande og samle cellerne med en anden centrifugering. Genbrug pellet i en milliliter frisk iskold lysis buffer. Efter centrifugering vaskes lysatet med en milliliter 1,25X begrænsningsbuffer.Centrifuge igen for at indsamle lysatet. Genbrug pellet i 360 mikroliter af frisk begrænsning buffer og 11 mikroliter på 10% SDS med omhyggelig pipettering og inkubere i 45 minutter ved 37 grader Celsius og 7 til 950 omdrejninger i minuttet med lejlighedsvis pipetting. Ved afslutningen af inkubationen skal du stoppe gennemtrængningen med 75 mikroliter non-ionic overfladeaktivt middel og returnere røret til inkubatoren i yderligere 45 minutter med rysten ved 950 omdrejninger i minuttet med lejlighedsvis pipettering.For chromatin fordøjelse, tilsæt 200 enheder af Mbo1 til røret for en fire til 16-timers inkubation ved 37 grader Celsius med rotation. I slutningen af inkubationen inaktiveres enzymet med 20 minutters inkubation ved 60 grader Celsius. For at udfylde begrænsningsfragmentets udhæng og for at mærke DNA-enderne med biotin, der tilsættes 1,5 mikroliter hver af 10 millimolar dCTP, dGTP, dTTP, 20 mikroliter på 0,4 millimolar biotin dATP, 17,5 mikroliter tris lav EDTA buffer, og 10 mikroliter af fem enheder pr mikroliter DNA polymerase et stort fragment til røret med omhyggelig blanding.Inkuber reaktionen i 75 minutter ved 37 grader Celsius med rysten ved 700 omdrejninger i minuttet hvert 10. sekund i 30 sekunder. I slutningen af inkubationen tilsættes ligationsblandingen til kromatinen og justeres til et milliliter endeligt reaktionsvolumen med grundig blid blanding og inkubat natten over ved 16 grader Celsius. For at nedbryde prøveproteinerne tilsættes 50 mikroliter på 10 milligram pr. milliliter proteinase K til røret for en to timers inkubation ved 37 grader Celsius.Ved afslutningen af inkubationen skal temperaturen øges til 65 grader Celsius natten over for at vende krydslinke prøven. Næste morgen nedbrydes RNA'et med 10 mikroliter på 10 milligram pr. milliliter RNAse A.Efter en time ved 37 grader Celsius tilsættes et volumen phenolchloroform til røret og blandes grundigt ved inversion for at opnå en homogen hvid fase. Efter at have udfældet DNA'et i henhold til standardprotokollerne, kvantificere DNA'et ved hjælp af et fluorogent farvestof, der selektivt binder sig til DNA og et fluorometer i henhold til producentens anvisninger.For at rense DNA'et fra ufordøjede og fordøjede aliquots skal du indlæse 100 nanogram ufordøjede, fordøjede og ligated prøver på en 1,5% agarose gel og kigge efter en smøre centreret omkring 500 basepar i den fordøjede prøve versus et højt molekylvægtbånd til ligatedprøven. For at kontrollere Hi-C-mærkningen og ligationens effektivitet ved forstærkning og fordøjelse af en kendt interaktion, efter PCR, skal du fordøje produkterne med Mbo1, Cla1 eller begge dele og køre prøverne på en ny 1,5 til 2%gel for at muliggøre estimering af det relative antal 3C- og Hi-C-ligationskryds. Efter at have sonikeret prøven for at opnå DNA-fragmenter fra 200 til 500 basispar, overføre 130 mikroliter med fem mikrogram DNA fra hver prøve til nye mikrocentrifugerør, der indeholder 16 mikroliter 10X ligationsbuffer, to mikroliter på 10 millimolar dATP, fem mikroliter T4 DNA-polymerase og syv mikroliter dobbeltdestilleret vand til en 30-minutters inkubation ved 20 grader Celsius.Ved afslutningen af inkubationen tilsættes fem mikroliter på 10 millimolar dNTP'er, fire mikroliter af 10X ligationsbuffer, fem mikroliter af T4 polynukleotidkinase, en mikroliter DNA-polymerase et stort fragment og 25 mikroliter dobbeltdestilleret vand til rørene i en anden 30-minutters inkubation ved 20 grader Celsius. For at vælge fragmenter for det meste i 250 til 550 base par størrelse rækkevidde, udføre sekventiel solid fase reversibel og mobilisering størrelse udvælgelse med 0,6X, derefter 0,9X i henhold til producentens anvisninger og elute DNA med 100 mikroliter af tris lav EDTA. For biotin pulldown for hvert bibliotek, vask 150 mikroliter af Streptavidin-forbundne magnetiske perler to gange med 400 mikroliter af 1X Tween buffer og rotere prøverne i tre minutter på et roterende hjul.Ved afslutningen af inkubationen opsuspendes perlerne i 300 mikroliter på 2X no Tween buffer og blandes med 300 mikroliter Hi-C materiale for en 30-minutters rotation på et roterende hjul. Ved afslutningen af inkubationen vaskes perlerne med 400 mikroliter på 0,5 X Tween buffer for en tre minutters inkubation ved 55 grader Celsius og 750 omdrejninger i minuttet efterfulgt af to skiver i 200 mikroliter af 1X begrænsningsbuffer pr. Vask. Efter den anden vask, genbruges perlerne i 100 mikroliter af dATP tailing mix for en 30-minutters inkubation ved 37 grader Celsius.Ved afslutningen af inkubationen opsuspendes perlerne i 50 mikroliter af 1X ligationsbuffer og overføres suspensionen til et nyt rør, der indeholder fire mikroliter forglødede parrede endeadaptere og to mikroliter af T4 ligase. Efter to timer ved stuetemperatur skal du fjerne supernatanten og vaske perlerne to gange med 400 mikroliter Tween buffer, og vask derefter perlerne en gang med 200 mikroliter uden Tween buffer og en gang med 100 mikroliter begrænsningsbuffer, før perlerne suspenderes igen i 40 mikroliter af 1X begrænsningsbuffer. En smøre på 200 til 1.000 base par er observeret, når begrænsning med Mbo1 er vellykket.Hvis ligationen er vellykket, observeres et højt molekylvægtbånd øverst på gelen. Fordøjelseseffektiviteten kan også bekræftes af kvantitativ PCR. En acceptabel fordøjelseseffektivitet er 80% eller højere.Som illustreret kan forstærkningen af en kendt mellemdistanceinteraktion i Hi-C-ligationsprodukter anslås ved fordøjelsen af pcr-produktet, der genvindes ved forstærkningen. En fordøjelseseffektivitet på mere end 70% anbefales for at undgå at have en stor del af ikke-nyttige læsninger til bibliotekerne efter sekventering. Antallet af PCR-cyklusser for den endelige forstærkning bør være en cyklus, der er mindre end antallet af cyklusser, for hvilke udstrygningen er synlig.Bibliotekets fordøjelsesniveau angiver overfloden af gyldige Hi-C-par og afspejler andelen af nyttige læsninger, der vil blive hentet fra biblioteket. Ved hjælp af de entydige gyldige Hi-C-par kan der udføres grundlæggende analyse af parfordelingen. Som observeret i dette repræsentative eksempel kan NOTCH-gen locus ses sammen med de arkitektoniske proteiner, domæner et og to og histoneændringer langs locus.Ved sletning af regionen, der indeholder både CTCF- og M1BP DNA-bindingssteder, kan der observeres en dramatisk ændring i chromatinkontakter. Efter Hi-C-eksperiment kan der udføres en for at nå et bestemt sæt kontakter, for eksempel fra promotorregioner. Dette er især nyttigt ved vurdering af store genomer.Som påvist kan kombinationen af Hi-C-protokollen med genetisk tilsætning bruges til at vurdere genomiske elementers strukturelle og lovgivningsmæssige funktion.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Mærkning af mitokondrie-DNA Replication i Drosophila Adult Ovarier af Edu Farvning

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Kvantificering af abdominal pigmentering i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Promotor Capture Hej-C: Høj opløsning, Genome-wide profilering af promotor interaktioner

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Rensning af lav-rigelige celler i Drosophila visuelle System

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In vivo funktionel undersøgelse af sygdoms associerede sjældne humane varianter ved hjælp af Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In vivo fremad genetisk skærm for at identificere nye neuroprotektive gener i Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Brug af Drosophila S2-celler til levende billeddannelse af celle division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Undersøgelse af den transkriptionelle rolle af en RUNX1 intronic LYDDÆMPER af crispr/Cas9 ribonucleoprotein i akutte myeloid leukæmiceller

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

En FACS-baseret protokol til at isolere RNA fra de sekundære celler af Drosophila mandlige tilbehørs kirtler

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay

Påvisning af postreplikation af huller akkumulering og reparation i humane celler ved hjælp af DNA-fiberassayet

The DNA fiber assay is a simple and robust method for the analysis of replication fork dynamics, based on the immunodetection of nucleotide analogs that ...