Name: in-nucleus hi-c in drosophila cells
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av UNAM Technology Innovation and Research Support Program (PAPIIT) tilskuddsnummer IN207319 og Science and Technology National Council (CONACyT-FORDECyT) tilskuddsnummer 303068. A.E.-L. er en masterstudent støttet av Science and Technology National Council (CONACyT) CVU nummer 968128.

1. Fiksering
<ol><li>Start med 10 millioner Schneiders linje 2 pluss (S2R+) celler for å forberede 17,5 ml cellefjæring i Schneider medium som inneholder 10% foster bovint serum (FBS) ved romtemperatur (RT).</li>
	<li>Tilsett metanolfri formaldehyd for å oppnå en endelig konsentrasjon på 2%. Bland og inkuber i 10 min på RT, pass på å blande hvert minutt. MERK: Formaldehyd er et farlig kjemikalie. Følg de aktuelle helse- og sikkerhetsforskriftene, og arbeid i avtrekkshetten.</li>
	<li>Slukk reaksjonen ved å...

<ol>
	<li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+territories,+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells.">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li><li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485, 376-380 (2012).</li><li>Sexton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+folding+and+functional+organization+principles+of+the+Drosophila+genome.">Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome.</a> Cell. 148 (3), 458-472 (2012).</li><li>Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+domains:+the+unit+of+chromosome+organization.">Chromatin domains: the unit of chromosome organization.</a> Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).</li><li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+3D+genome.">Organization and function of the 3D genome.</a> Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).</li><li>Lupi&#225;&#241;ez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+TADs:+how+alterations+of+chromatin+domains+result+in+disease.">Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease.</a> Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).</li><li>Phillips, J. E., Corces, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF:+master+weaver+of+the+genome.">CTCF: master weaver of the genome.</a> Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).</li><li>Hong, S., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+characterization+of+chromatin+domain+boundary-associated+genomic+elements.">Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements.</a> Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).</li><li>Zuin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+and+CTCF+differentially+affect+chromatin+architecture+and+gene+expression+in+human+cells.">Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+inversion+of+CTCF+sites+alters+genome+topology+and+enhancer/promoter+function.">CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function.</a> Cell. 162, 900-910 (2015).</li><li>Lupi&#225;&#241;ez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions.">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161, 1012-1025 (2015).</li><li>Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+transcription+in+shaping+the+spatial+organization+of+the+genome.">The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).</li><li>Merkenschlager, M., Nora, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+and+cohesin+in+genome+folding+and+transcriptional+gene+regulation.">CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).</li><li>Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+and+cohesin+regulate+chromatin+loop+stability+with+distinct+dynamics.">CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics.</a> Elife. 6, 1-10 (2017).</li><li>Van Bortle, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulator+function+and+topological+domain+border+strength+scale+with+architectural+protein+occupancy.">Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy.</a> Genome Biology. 15, 82 (2014).</li><li>Ram&#237;rez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies.">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> Nature Communications. 9, 189 (2018).</li><li>Ulianov, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+chromatin+and+transcription+play+a+key+role+in+chromosome+partitioning+into+topologically+associating+domains.">Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains.</a> Genome Research. 26, 70-84 (2016).</li><li>Rowley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionarily+conserved+principles+predict+3D+chromatin+organization.">Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization.</a> Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).</li><li>Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actual+ligation+frequencies+in+the+chromosome+conformation+capture+procedure.">Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure.</a> PLoS One. 8, 60403 (2013).</li><li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disclosure+of+a+structural+milieu+for+the+proximity+ligation+reveals+the+elusive+nature+of+an+active+chromatin+hub.">Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub.</a> Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).</li><li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+Hi-C+reveals+cell-to-cell+variability+in+chromosome+structure.">Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure.</a> Nature. 502, 59-64 (2013).</li><li>Rao, S. S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping.">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li><li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Hi-C+results+using+in-solution+versus+in-nucleus+ligation.">Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation.</a> Genome Biology. 16, 175 (2015).</li><li>Arzate-Mej&#237;a, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+dissection+of+domain+boundaries+affect+genome+topology+and+gene+transcription+in+Drosophila.">In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila.</a> Nature Communications. 11, 894 (2020).</li><li>Schoenfelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+capture+Hi-C:+high-resolution,+genome-wide+profiling+of+promoter+interactions.">Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).</li><li>Servant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiC-Pro:+an+optimized+and+flexible+pipeline+for+Hi-C+processing.">HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing.</a> Genome Biology. 16, 259 (2015).</li><li>Philip, E., M&#229;ns, M., Sverker, L., Max, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+Summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 10, 1093 (2016).</li><li>Wingett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiCUP:+pipeline+for+mapping+and+processing+Hi-C+data.">HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data.</a> F1000 Research. 4, 1310 (2015).</li><li>Imakaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+correction+of+Hi-C+data+reveals+hallmarks+of+chromosome+organization.">Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization.</a> Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).</li><li>Akdemir, K. C., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiCPlotter+integrates+genomic+data+with+interaction+matrices.">HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices.</a> Genome Biolog. 16, 198 (2015).</li><li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies.">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> Nature Communications. 9, 189 (2018).</li><li>Ando-Kuri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+and+promoter-centric+3D+genome+organization+temporally+resolved+during+a+circadian+cycle.">The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Cuellar-Partida, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+priors+for+identifying+active+transcription+factor+binding+sites.">Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites.</a> Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9, 137 (2008).</li><li>Ong, C. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribosyl)ation+regulates+insulator+function+and+intrachromosomal+interactions+in+Drosophila.">Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila.</a> Cell. 155 (1), 148-159 (2013).</li><li>Fres&#225;n, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulator+protein+CTCF+regulates+Drosophila+steroidogenesis.">The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis.</a> Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).</li><li>Quinodoz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+promotes+the+formation+of+spatial+compartments+in+the+nucleus.">RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus.</a> Cell. 174, 744-757 (2018).</li><li>Olivares-Chauvet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+pairwise+and+multi-way+chromosomal+conformations+using+chromosomal+walks.">Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks.</a> Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).</li><li>Beagrie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+multi-enhancer+contacts+captured+by+genome+architecture+mapping.">Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping.</a> Nature. 543, 519-524 (2017).</li><li>Redolfi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DamC+reveals+principles+of+chromatin+folding+in+vivo+without+crosslinking+and+ligation.">DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).</li><li>Maxwell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiChIP:+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture.">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13, 919-922 (2016).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-BERST:+Defining+subnuclear+proteomic+landscapes+at+genomic+elements+with+dCas9-APEX2.">C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2.</a> Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).</li></ol>

Den in-nukleus Hi-C-metoden som presenteres her, har tillatt detaljert utforskning av Drosophila genomtopologi ved høy oppløsning, og gir utsikt over genomiske interaksjoner på forskjellige genomiske skalaer, fra kromatinløkker mellom regulatoriske elementer som promotorer og forsterkere til TADs og stor romidentifikasjon25. Den samme teknologien har også blitt effektivt brukt på pattedyrvev med noen modifikasjoner33. For eksempel, når du behandler et vev i stedet fo...

I eukaryoter er genomet delt inn i kromosomer som okkuperer spesifikke territorier i atomrommet under interfase1. Kromatinet som danner kromosomene kan deles inn i to hovedtilstander: en av tilgjengelige kromatin som er transkripsjonelt tillatt, og den andre av kompakt kromatin som er transkripsjonelt undertrykkende. Disse kromatinstatene segregate og blander sjelden i atomrommet, danner to forskjellige rom i kjernen2. I skalaen sub-megabase skiller grenser domener med høyfrekvente kromatininteraksjoner, kalt TADer, som markerer kromosomal organisasjon3,4,5. Hos pattedyr er TAD-grenser okkupert av cohesin og CCCTC-bindende faktor (CTCF)6,7,8. Cohesin-komplekset ekstruderer kromatin og stopper på CTCF-bindende steder som avhendes i en konvergent orientering i den genomiske sekvensen for å danne stabile kromatinløkker9,10,13,14. Genetisk forstyrrelse av CTCF DNA-bindende sted ved grensene eller reduksjon i CTCF og cohesin protein overflod resulterer i unormale interaksjoner mellom regulatoriske elementer, tap av TAD-dannelse, og genuttrykk deregulering9,10,11,13,14.
I Drosophila, Grensene mellom TADs er okkupert av flere APer, inkludert grenseelement-assosiert faktor 32 kDa (BEAF-32), Motiv 1 bindende protein (M1BP), centrosomal protein 190 (CP190), undertrykker av hårete vinge (SuHW) og CTCF, og er beriket i aktive histone modifikasjoner og Polymerase II16,17,18 ,18. Det har blitt antydet at i Drosophila vises TADs som følge av transkripsjon13,17,19, og den nøyaktige rollen til uavhengige APer i grensedannelse og isolasjonsegenskaper er fortsatt under etterforskning. Hvorvidt domener i Drosophila er en eneste konsekvens av aggregering av regioner med lignende transkripsjonstilstander eller om APs, inkludert CTCF, bidrar til grensedannelse, gjenstår å være fullt karakterisert. Utforskning av genomiske kontakter med høy oppløsning har vært mulig gjennom utvikling av kromosomkonformasjonsfangstteknologier kombinert med neste generasjons sekvensering. Hi-C-protokollen ble først beskrevet med ligation trinn utført "i løsning"2 i et forsøk på å unngå falske ligation produkter mellom kromatin fragmenter. Flere studier pekte imidlertid på erkjennelsen av at det nyttige signalet i dataene kom fra ligasjonsprodukter dannet ved delvis lysede kjerner som ikke var i løsning20,21.
Protokollen ble deretter endret for å utføre ligasjonen inne i kjernen som en del av hi-C-eksperimentet22med én celle. Hi-C-protokollen i kjernen ble senere innlemmet i cellepopulasjonen Hi-C for å gi en mer konsistent dekning over hele spekteret av genomiske avstander og produsere data med mindre teknisk støy23,24. Protokollen, beskrevet i detalj her, er basert på populasjonen i kjernen Hi-C-protokoll23,24 og ble brukt til å undersøke konsekvensene av genetisk fjerning av DNA-bindende motiver for CTCF og M1BP fra en domenegrense ved Notch-genlocus i Drosophila25. Resultatene viser at endring av DNA-bindende motiver for APs ved grensen har drastiske konsekvenser for Notch-domenedannelse, større topologiske defekter i regionene rundt Notch-locus og genuttrykksderegulering. Dette indikerer at genetiske elementer ved domenegrenser er viktige for vedlikehold av genomtopologi og genuttrykk i Drosophila25.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% (vol/vol) paraformaldehyde solution</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dATP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>CA1524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClaI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0197S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVARIS Ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>LE220-M220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut Smart</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B72002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptabidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Dna PolI large fragment</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow exo(-)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0210S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B020S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MboI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0147M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40-Igepal</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CA-420</td>
			<td>Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE adapter 1.0</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>5&#39;-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG 
			GAATGCCGAG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE adapter 2.0</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>5&#39;-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT 
			CTTCCGATCT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE PCR primer 1.0</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>5&#39;-AATGATACGGCGACCACCGAGAT 
			CTACACTCTTTCCCTACACGACG 
			CTCTTCCGATCT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE PCR primer 2.0</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>5&#39;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 
			ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA 
			ACCGCTCTTCCGATCT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1 (known interaction, Figure 2A)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5&#39;-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2 (known interactions, Figure 2A)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5&#39;-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablet</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109142001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRI Beads</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>B23318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15224-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase (PNK)&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqPhusion</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-ionic surfactant for quenching of SDS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in-nucleus hi-c in drosophila cells

Genomet er organisert i topologisk assosierende domener (TADs) avgrenset av grenser som isolerer interaksjoner mellom domener. I Drosophila er mekanismene som ligger til grunn for TAD-dannelsen og grensene fortsatt under etterforskning. Anvendelsen av hi-c-metoden som er beskrevet her, bidro til å dissekere funksjonen til arkitektoniske proteiner (AP)-bindende steder ved TAD-grenser som isolerer Notch-genet. Genetisk modifikasjon av domenegrenser som forårsaker tap av APs resulterer i TAD-fusjon, transkripsjonsfeil og langtrekkende topologiske endringer. Disse resultatene ga bevis som viste bidraget av genetiske elementer til domenegrensedannelse og genuttrykkskontroll i Drosophila. Her er hi-C-metoden beskrevet i detalj, noe som gir viktige sjekkpunkter for å vurdere kvaliteten på eksperimentet sammen med protokollen. Også vist er det nødvendige antall sekvenseringslesninger og gyldige Hi-C-par for å analysere genomiske interaksjoner på forskjellige genomiske skalaer. CRISPR/Cas9-mediert genetisk redigering av regulatoriske elementer og høyoppløselig profilering av genomiske interaksjoner ved hjelp av denne hi-C-protokollen i kjernen kan være en kraftig kombinasjon for undersøkelse av genetiske elementers strukturelle funksjon.

Nedenfor beskrives resultatene av en vellykket Hi-C-protokoll (se et sammendrag av Hi-C-protokollarbeidsflyten i figur 1A). Det er flere kvalitetskontrollpunkter under Hi-C-eksperimentet i kjernen. Prøve aliquots ble samlet inn før (UD) og etter (D) kromatin begrensning trinn samt etter ligation (L). Krysskoblinger ble reversert, og DNA ble renset og kjørt på en agarose gel. Et smør på 200-1000 bp ble observert når begrensningen med Mbo I var vellykket (Figur 1B</...

Watch this Scientific Journal Video about In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells at JoVE.com

In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells

Genomet er organisert i atomrommet i forskjellige strukturer som kan avsløres gjennom kromosomkonformasjonsfangstteknologier. Hi-C-metoden i kjernen gir en genomomfattende samling av kromatininteraksjoner i Drosophila-cellelinjer, som genererer kontaktkart som kan utforskes med megabaseoppløsning på begrensningsfragmentnivå.

In-Nucleus Hi-C i Drosophila-celler

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, ...

Kjernen Hi-C-protokollene tillater utforskning av kromosomal bekreftelse med forskjellig oppløsning for karakterisering av kromatinløkker, domener og rom som organiserer genomet. Denne protokollen gir høyoppløselig profilering av genomiske interaksjoner i forskjellige skalaer, noe som gir en mer konsistent dekning over hele spekteret av genomiske avstander og data med mindre teknisk støy. Å kombinere denne protokollen med genetisk redigering er en kraftig strategi for å teste den strukturelle funksjonen til genetiske elementer.Det kan også brukes på karakterisering av strukturelle variasjoner som fører til sykdom. Kjernen Hi-C-protokollen kan brukes til å utforske genomorganisasjonen til ethvert eukaryotisk genom. Å gjøre SDS- og Triton-behandling disaggregaterer eventuelle kjernefysiske klumper ved pipettering, da aggregater forstyrrer enzymatisk reaksjonseffektivitet, og sørg for å utføre riktig kvalitetskontrollmål før sekvensering.Begynn med å legge til metanolfri formaldehyd til en gang 10 til de syv Schneiders Line 2 Plus Drosophila-celler i 17,5 milliliter Schneider-medium supplert med 10% FBS til en endelig konsentrasjon på 2% Inkuber cellene i 10 minutter ved romtemperatur med blanding hvert 60. og tilsett glycin til en endelig konsentrasjon på 0,125 molar med blanding. Etter fem minutter ved romtemperatur og 15 minutter på is, samle cellene ved sentrifugering og forsiktig gjenopplive pellet i 25 milliliter kald PBS og samle cellene med en annen sentrifugering. På slutten av sentrifugeringen, resuspend cellene i en milliliter iskald lysis buffer for telling og justere cellene til en en ganger 10 til seks celler per milliliter konsentrasjon.Inkuber cellene på is i 30 minutter, inverter røret hvert annet minutt for å blande og samle cellene med en annen sentrifugering. Resuspend pellet i en milliliter frisk is kald lysis buffer. Etter sentrifugering, vask lysatet med en milliliter 1,25X begrensningsbuffer.Sentrifuge igjen for å samle lysate. Resuspend pellet i 360 mikroliter av fersk begrensning buffer og 11 mikroliter av 10%SDS med forsiktig pipettering og inkubere i 45 minutter ved 37 grader Celsius og 7 til 950 omdreininger per minutt med sporadisk pipettering. På slutten av inkubasjonen, stopp permeabiliseringen med 75 mikroliter ikke-ionisk overflateaktivt middel og returner røret til inkubatoren i ytterligere 45 minutter med risting ved 950 omdreininger per minutt med sporadisk pipettering.For kromatin fordøyelse, tilsett 200 enheter av Mbo1 til røret for en fire til 16-timers inkubasjon ved 37 grader Celsius med rotasjon. På slutten av inkubasjonen inaktiverer du enzymet med 20-minutters inkubasjon ved 60 grader Celsius. For å fylle ut begrensningsfragmentoverhengene og merke DNA-endene med biotin, tilsett 1,5 mikroliter hver av 10 millimolar dCTP, dGTP, dTTP, 20 mikroliter 0,4 millimolar biotin dATP, 17,5 mikroliter tris lav EDTA-buffer og 10 mikroliter av fem enheter per mikroliter DNA-polymerase ett stort fragment til røret med forsiktig blanding.Inkuber reaksjonen i 75 minutter ved 37 grader Celsius med risting ved 700 omdreininger per minutt hvert 10. På slutten av inkubasjonen, legg til ligationblandingen til kromatin og juster den til en milliliter endelig reaksjonsvolum med grundig skånsom blanding og inkuber over natten ved 16 grader Celsius. For å forringe prøveproteinene, tilsett 50 mikroliter 10 milligram per milliliter proteinase K til røret for en to timers inkubasjon ved 37 grader Celsius.På slutten av inkubasjonen, øk temperaturen til 65 grader Celsius over natten for å reversere krysskobling av prøven. Neste morgen, forring RNA med 10 mikroliter på 10 milligram per milliliter RNAse A.Etter en time ved 37 grader Celsius, legg til ett volum fenolklorform til røret og bland grundig ved inversjon for å oppnå en homogen hvit fase. Etter å ha utfelt DNA i henhold til standardprotokoller, kvantifisere DNA ved hjelp av et fluorogent fargestoff som binder selektivt til DNA og et fluorometer i henhold til produsentens instruksjoner.For å rense DNA-et fra ufordøyde og fordøyde aliquots, last 100 nanogram ufordøyd, fordøyd og ligated prøver på en 1,5% agarose gel og se etter et smør sentrert rundt 500 basepar i den fordøyde prøven kontra et høyt molekylvektbånd for den ligaterte prøven. For å verifisere Hi-C-merkingen og ligasjonseffektiviteten ved forsterkning og fordøyelse av en kjent interaksjon, etter PCR, fordøye produktene med Mbo1, Cla1 eller begge deler, og kjør prøvene på en ny 1,5 til 2% gel for å tillate estimering av det relative antallet 3C- og Hi-C-ligationkryss. Etter sonikering av prøven for å oppnå DNA-fragmenter på 200 til 500 basepar, overføre 130 mikroliter med fem mikrogram DNA fra hver prøve til nye mikrocentrifugerør som inneholder 16 mikroliter 10X ligasjonsbuffer, to mikroliter 10 millimolar dATP, fem mikroliter T4 DNA-polymerase og syv mikroliter dobbelt destillert vann for en 30-minutters inkubasjon ved 20 grader Celsius.På slutten av inkubasjonen legger du til fem mikroliter med 10 millimolar dNTPer, fire mikroliter 10X ligasjonsbuffer, fem mikroliter T4 polynukleotidkinase, en mikroliter DNA-polymerase ett stort fragment og 25 mikroliter dobbelt destillert vann til rørene for en andre 30-minutters inkubasjon ved 20 grader Celsius. For å velge fragmenter for det meste i størrelsesområdet 250 til 550 basepar, utfør sekvensiell solid fase reversibel og mobiliseringsstørrelsesvalg med 0,6X, deretter 0,9X i henhold til produsentens instruksjoner og elute DNA med 100 mikroliter tris lav EDTA. For biotin pulldown for hvert bibliotek, vask 150 mikroliter Streptavidin-koblede magnetiske perler to ganger med 400 mikroliter 1X Tween buffer og roter prøvene i tre minutter på et roterende hjul.På slutten av inkubasjonen, resuspend perlene i 300 mikroliter av 2X ingen Tween buffer og bland med 300 mikroliter Hi-C materiale for en 30-minutters rotasjon på et roterende hjul. På slutten av inkubasjonen, vask perlene med 400 mikroliter 0,5X Tween buffer for en tre minutters inkubasjon ved 55 grader Celsius og 750 omdreininger per minutt, etterfulgt av to vasker i 200 mikroliter med 1X begrensningsbuffer per vask. Etter den andre vasken, resuspend perlene i 100 mikroliter dATP tailing blanding for en 30-minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius.På slutten av inkubasjonen, resuspend perlene i 50 mikroliter av 1X ligation buffer og overføre suspensjonen til et nytt rør som inneholder fire mikroliter pre-annealed parret end adaptere og to mikroliter av T4 ligase. Etter to timer ved romtemperatur, fjern supernatanten og vask perlene to ganger med 400 mikroliter Tween buffer, vask deretter perlene en gang med 200 mikroliter uten Tween-buffer og en gang med 100 mikroliter begrensningsbuffer før du suspenderer perlene i 40 mikroliter med 1X-bufferbegrensning. Et smør på 200 til 1000 basispar observeres når begrensningen med Mbo1 er vellykket.Hvis ligasjonen er vellykket, observeres et høyt molekylvektbånd på toppen av gelen. Fordøyelseseffektivitet kan også bekreftes av kvantitativ PCR. En akseptabel fordøyelseseffektivitet er 80% eller høyere.Som illustrert kan forsterkningen av en kjent mellomtoneinteraksjon i Hi-C-ligasjonsprodukter estimeres ved fordøyelsen av PCR-produktet som er gjenvunnet i forsterkningen. En fordøyelseseffektivitet på mer enn 70%anbefales for å unngå å ha en stor andel av ikke-nyttige lesninger for bibliotekene etter sekvensering. Antall PCR-sykluser for den endelige forsterkningen bør være en syklus mindre enn antall sykluser som smøret er synlig for.Nivået på fordøyelsen av biblioteket indikerer overflod av gyldige Hi-C-par og gjenspeiler andelen nyttige lesninger som vil bli hentet fra biblioteket. Ved hjelp av de unike gyldige Hi-C-parene kan grunnleggende analyse av pardistribusjonen utføres. Som observert i dette representative eksemplet, kan NOTCH-genet locus ses sammen med arkitektoniske proteiner, domener en og to, og histone modifikasjoner langs gresset.Ved sletting av regionen som inneholder både CTCF og M1BP DNA-bindingssteder, kan en dramatisk endring i kromatinkontakter observeres. Etter Hi-C-eksperimentet kan en utføres for å nå et bestemt sett med kontakter, for eksempel fra promotorregioner. Dette er spesielt nyttig ved vurdering av store genomer.Som demonstrert kan kombinasjon av Hi-C-protokollen med genetisk tilsetning brukes til å vurdere den strukturelle og regulatoriske funksjonen til genomiske elementer.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Merking av mitokondriell DNA replikasjon i Drosophila voksen Eggstokkene Edu Farging

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Kvantifiserende abdominal pigmentering i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Promotoren fange Hei-C: Med høy oppløsning, genomet-bred profilering av arrangøren interaksjoner

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Rensing av lav-rikelig celler i Drosophila visuelle systemet

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In vivo funksjonell studie av sykdom-Associated sjeldne Human varianter bruke Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In vivo Forward genetisk Screen å identifisere Novel nervecellene gener i Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Bruk av Drosophila S2 Cells for Live Imaging av Cell Division

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Gransking av Transcriptional rolle en RUNX1 Intronic lyddemper av CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein i akutt myelogen leukemi celler

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

En FACS-basert protokoll for å isolere RNA fra sekundære celler av Drosophila mannlig tilbehør kjertler

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay

Påvisning av postrepliktive hull akkumulering og reparasjon i menneskelige celler ved hjelp av DNA Fiber Assay

The DNA fiber assay is a simple and robust method for the analysis of replication fork dynamics, based on the immunodetection of nucleotide analogs that ...