Name: in-nucleus hi-c in drosophila cells
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo número de bolsas do PROGRAMA DE INOVAÇÃO E Amparo à Pesquisa (PAPIIT) da UNAM Technology Innovation and Research(PAPIIT) em 207319 e pelo número de bolsas do Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia (CONACyT-FORDECyT) 303068. A.E.-L. é um aluno de mestrado apoiado pelo número de CVU do Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia (CONACyT) 968128.

1. Fixação
<ol><li>Comece com 10 milhões de células da linha 2 plus (S2R+) da Schneider para preparar 17,5 mL de suspensão celular no meio Schneider contendo 10% de soro bovino fetal (FBS) à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Adicione formaldeído sem metanol para obter uma concentração final de 2%. Misture e incubar por 10 minutos no RT, tomando o cuidado de misturar a cada minuto. NOTA: Formaldeído é um produto químico perigoso. Siga as normas de saúde e segurança apropriadas e trabalhe no capô da ...

<ol>
	<li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+territories,+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells.">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li><li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485, 376-380 (2012).</li><li>Sexton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+folding+and+functional+organization+principles+of+the+Drosophila+genome.">Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome.</a> Cell. 148 (3), 458-472 (2012).</li><li>Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+domains:+the+unit+of+chromosome+organization.">Chromatin domains: the unit of chromosome organization.</a> Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).</li><li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+3D+genome.">Organization and function of the 3D genome.</a> Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).</li><li>Lupi&#225;&#241;ez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+TADs:+how+alterations+of+chromatin+domains+result+in+disease.">Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease.</a> Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).</li><li>Phillips, J. E., Corces, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF:+master+weaver+of+the+genome.">CTCF: master weaver of the genome.</a> Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).</li><li>Hong, S., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+characterization+of+chromatin+domain+boundary-associated+genomic+elements.">Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements.</a> Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).</li><li>Zuin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+and+CTCF+differentially+affect+chromatin+architecture+and+gene+expression+in+human+cells.">Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+inversion+of+CTCF+sites+alters+genome+topology+and+enhancer/promoter+function.">CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function.</a> Cell. 162, 900-910 (2015).</li><li>Lupi&#225;&#241;ez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions.">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161, 1012-1025 (2015).</li><li>Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+transcription+in+shaping+the+spatial+organization+of+the+genome.">The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).</li><li>Merkenschlager, M., Nora, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+and+cohesin+in+genome+folding+and+transcriptional+gene+regulation.">CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).</li><li>Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+and+cohesin+regulate+chromatin+loop+stability+with+distinct+dynamics.">CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics.</a> Elife. 6, 1-10 (2017).</li><li>Van Bortle, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulator+function+and+topological+domain+border+strength+scale+with+architectural+protein+occupancy.">Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy.</a> Genome Biology. 15, 82 (2014).</li><li>Ram&#237;rez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies.">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> Nature Communications. 9, 189 (2018).</li><li>Ulianov, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+chromatin+and+transcription+play+a+key+role+in+chromosome+partitioning+into+topologically+associating+domains.">Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains.</a> Genome Research. 26, 70-84 (2016).</li><li>Rowley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionarily+conserved+principles+predict+3D+chromatin+organization.">Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization.</a> Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).</li><li>Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actual+ligation+frequencies+in+the+chromosome+conformation+capture+procedure.">Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure.</a> PLoS One. 8, 60403 (2013).</li><li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disclosure+of+a+structural+milieu+for+the+proximity+ligation+reveals+the+elusive+nature+of+an+active+chromatin+hub.">Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub.</a> Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).</li><li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+Hi-C+reveals+cell-to-cell+variability+in+chromosome+structure.">Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure.</a> Nature. 502, 59-64 (2013).</li><li>Rao, S. S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping.">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li><li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Hi-C+results+using+in-solution+versus+in-nucleus+ligation.">Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation.</a> Genome Biology. 16, 175 (2015).</li><li>Arzate-Mej&#237;a, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+dissection+of+domain+boundaries+affect+genome+topology+and+gene+transcription+in+Drosophila.">In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila.</a> Nature Communications. 11, 894 (2020).</li><li>Schoenfelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+capture+Hi-C:+high-resolution,+genome-wide+profiling+of+promoter+interactions.">Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).</li><li>Servant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiC-Pro:+an+optimized+and+flexible+pipeline+for+Hi-C+processing.">HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing.</a> Genome Biology. 16, 259 (2015).</li><li>Philip, E., M&#229;ns, M., Sverker, L., Max, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+Summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 10, 1093 (2016).</li><li>Wingett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiCUP:+pipeline+for+mapping+and+processing+Hi-C+data.">HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data.</a> F1000 Research. 4, 1310 (2015).</li><li>Imakaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+correction+of+Hi-C+data+reveals+hallmarks+of+chromosome+organization.">Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization.</a> Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).</li><li>Akdemir, K. C., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiCPlotter+integrates+genomic+data+with+interaction+matrices.">HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices.</a> Genome Biolog. 16, 198 (2015).</li><li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies.">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> Nature Communications. 9, 189 (2018).</li><li>Ando-Kuri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+and+promoter-centric+3D+genome+organization+temporally+resolved+during+a+circadian+cycle.">The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Cuellar-Partida, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+priors+for+identifying+active+transcription+factor+binding+sites.">Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites.</a> Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9, 137 (2008).</li><li>Ong, C. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribosyl)ation+regulates+insulator+function+and+intrachromosomal+interactions+in+Drosophila.">Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila.</a> Cell. 155 (1), 148-159 (2013).</li><li>Fres&#225;n, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulator+protein+CTCF+regulates+Drosophila+steroidogenesis.">The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis.</a> Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).</li><li>Quinodoz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+promotes+the+formation+of+spatial+compartments+in+the+nucleus.">RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus.</a> Cell. 174, 744-757 (2018).</li><li>Olivares-Chauvet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+pairwise+and+multi-way+chromosomal+conformations+using+chromosomal+walks.">Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks.</a> Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).</li><li>Beagrie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+multi-enhancer+contacts+captured+by+genome+architecture+mapping.">Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping.</a> Nature. 543, 519-524 (2017).</li><li>Redolfi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DamC+reveals+principles+of+chromatin+folding+in+vivo+without+crosslinking+and+ligation.">DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).</li><li>Maxwell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiChIP:+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture.">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13, 919-922 (2016).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-BERST:+Defining+subnuclear+proteomic+landscapes+at+genomic+elements+with+dCas9-APEX2.">C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2.</a> Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).</li></ol>

O método Hi-C em núcleo apresentado aqui permitiu a exploração detalhada da topologia do genoma de Drosophila em alta resolução, proporcionando uma visão das interações genômicas em diferentes escalas genômicas, desde loops de cromatina entre elementos regulatórios, como promotores e melhoradores até TADs e identificação de compartimentos grandes25. A mesma tecnologia também foi aplicada eficientemente aos tecidos mamíferos com algumas modificações33. Por...

Nos eucariotes, o genoma é dividido em cromossomos que ocupam territórios específicos no espaço nuclear durante a interfase1. A cromatina formando os cromossomos pode ser dividida em dois estados principais: um de cromatina acessível que é transcritivamente permissivo, e o outro de cromatina compacta que é transcritivamente repressiva. Esses estados de cromatina segregam e raramente se misturam no espaço nuclear, formando dois compartimentos distintos no núcleo2. Na escala sub-megabase, os limites separam domínios de interações de cromatina de alta frequência, chamados TADs, que marcam a organização cromossômica3,4,5. Nos mamíferos, os limites do TAD são ocupados por cohesin e fator de ligação CCCTC (CTCF)6,7,8. O complexo de cohesina extruda a cromatina e para em locais de ligação CTCF que são dispostos em uma orientação convergente na sequência genômica para formar laços de cromatina estável9,10,13,14. A interrupção genética do local de ligação de DNA ctcf nos limites ou redução da densidade de proteínas de CTCF e cohesina resulta em interações anormais entre elementos regulatórios, perda da formação de TAD e desregulação da expressão genética9,10,11,13,14.
Em Drosophila, os limites entre os TADs são ocupados por vários APs, incluindo fator associado a elementos de fronteira 32 kDa (BEAF-32), Motif 1 proteína de ligação (M1BP), proteína centrosômica 190 (CP190), supressor de asa peluda (SuHW) e CTCF, e são enriquecidos em modificações de histona ativa e Polymerase II16,17,18. Tem sido sugerido que em Drosophila, os TADs aparecem como consequência da transcrição13,17,19, e o papel exato dos APs independentes na formação de limites e propriedades de isolamento ainda está sob investigação. Assim, se os domínios em Drosophila são uma consequência única da agregação de regiões de estados transcricionais semelhantes ou se as APs, incluindo a CTCF, contribuem para a formação de limites permanece totalmente caracterizada. A exploração de contatos genômicos em alta resolução tem sido possível através do desenvolvimento de tecnologias de captura de conformação de cromossomos, juntamente com o sequenciamento de próxima geração. O protocolo Hi-C foi descrito pela primeira vez com a etapa de ligadura realizada "em solução"2 na tentativa de evitar produtos de ligadura espúria entre fragmentos de cromatina. No entanto, vários estudos apontaram para a constatação de que o sinal útil nos dados veio de produtos de ligadura formados em núcleos parcialmente lysed que não estavam na solução20,21.
O protocolo foi então modificado para realizar a ligadura dentro do núcleo como parte do experimento Hi-C de célula única22. O protocolo Hi-C no núcleo foi posteriormente incorporado à população celular Hi-C para produzir uma cobertura mais consistente ao longo de toda a gama de distâncias genômicas e produzir dados com menos ruído técnico23,24. O protocolo, descrito em detalhes aqui, baseia-se no protocolo Hi-C da população no núcleo23,24 e foi usado para investigar as consequências da remoção genética de motivos de vinculação de DNA para CTCF e M1BP de um limite de domínio no lócus genético notch em Drosophila25. Os resultados mostram que alterar os motivos de vinculação de DNA para APs na fronteira tem consequências drásticas para a formação do domínio de Notch, defeitos topológicos maiores nas regiões ao redor do lócus notch e desregulamentação da expressão genética. Isso indica que elementos genéticos nos limites do domínio são importantes para a manutenção da topologia do genoma e expressão genética em Drosophila25.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% (vol/vol) paraformaldehyde solution</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dATP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>CA1524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClaI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0197S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVARIS Ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>LE220-M220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut Smart</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B72002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptabidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Dna PolI large fragment</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow exo(-)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0210S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B020S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MboI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0147M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40-Igepal</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CA-420</td>
			<td>Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE adapter 1.0</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>5&#39;-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG 
			GAATGCCGAG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE adapter 2.0</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>5&#39;-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT 
			CTTCCGATCT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE PCR primer 1.0</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>5&#39;-AATGATACGGCGACCACCGAGAT 
			CTACACTCTTTCCCTACACGACG 
			CTCTTCCGATCT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE PCR primer 2.0</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>5&#39;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 
			ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA 
			ACCGCTCTTCCGATCT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1 (known interaction, Figure 2A)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5&#39;-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2 (known interactions, Figure 2A)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5&#39;-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablet</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109142001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRI Beads</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>B23318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15224-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase (PNK)&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqPhusion</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-ionic surfactant for quenching of SDS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in-nucleus hi-c in drosophila cells

O genoma é organizado em domínios topologicamente associando (TADs) delimitados por fronteiras que isolam interações entre domínios. Em Drosophila, os mecanismos subjacentes à formação e aos limites do TAD ainda estão sob investigação. A aplicação do método Hi-C em núcleo descrito aqui ajudou a dissecar a função de sítios de ligação de proteína arquitetônica (AP) nas fronteiras do TAD isolando o gene Notch. A modificação genética dos limites de domínio que causam a perda de APs resulta em fusão TAD, defeitos transcricionais e alterações topológicas de longo alcance. Esses resultados forneceram evidências demonstrando a contribuição de elementos genéticos para a formação de limites de domínio e controle da expressão genética em Drosophila. Aqui, o método Hi-C no núcleo foi descrito em detalhes, o que fornece importantes pontos de verificação para avaliar a qualidade do experimento juntamente com o protocolo. Também são mostrados os números necessários de leituras de sequenciamento e pares Hi-C válidos para analisar interações genômicas em diferentes escalas genômicas. A edição genética mediada pelo CRISPR/Cas9 de elementos regulatórios e o perfil de alta resolução das interações genômicas usando este protocolo Hi-C no núcleo pode ser uma combinação poderosa para a investigação da função estrutural dos elementos genéticos.

Descritos abaixo estão os resultados de um protocolo Hi-C bem sucedido (veja um resumo do fluxo de trabalho do protocolo Hi-C na Figura 1A). Existem vários pontos de controle de qualidade durante o experimento Hi-C no núcleo. As alíquotas amostrais foram coletadas antes (UD) e depois (D) da etapa de restrição da cromatina, bem como após a ligadura (L). Os crosslinks foram invertidos, e o DNA foi purificado e executado em um gel de agarose. Uma mancha de 200-1000 bp foi observada quand...

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In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells

O genoma é organizado no espaço nuclear em diferentes estruturas que podem ser reveladas através de tecnologias de captura de conformação cromossomos. O método Hi-C no núcleo fornece uma coleção de interações de cromatina em linhas celulares Drosophila, que gera mapas de contato que podem ser explorados em resolução de megabases em nível de fragmento de restrição.

In-Nucleus Hi-C em Células Drosophila

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, ...

Os protocolos de núcleo Hi-C permitem a exploração da confirmação cromossômica em resolução diferente para a caracterização de laços de cromatina, domínios e compartimento organizando o genoma. Este protocolo fornece perfil de alta resolução de interações genômicas em diferentes escalas, gerando uma cobertura mais consistente sobre toda a gama de distâncias genômicas e dados com menos ruído técnico. Combinar este protocolo com a edição genética é uma estratégia poderosa para testar a função estrutural dos elementos genéticos.Também pode ser aplicada à caracterização de variações estruturais que levam à doença. O protocolo de núcleo Hi-C pode ser aplicado para explorar a organização do genoma de qualquer genoma eucariótico. Fazer o tratamento SDS e Triton desagrega qualquer aglomerado nuclear por pipetação, pois os agregados interferem na eficiência da reação enzimática, e certifique-se de executar a medida de controles de qualidade apropriado antes do sequenciamento.Comece adicionando formaldeído sem metanol a uma vezes 10 às sete células de Drosophila da Linha 2 Plus schneider em 17,5 mililitros de schneider médio suplementado com 10% FBS a uma concentração final de 2% Incubar as células por 10 minutos à temperatura ambiente com mistura a cada 60 segundos ou em uma roda giratória, e adicionar glicina a uma concentração final de 0,125 molar com mistura. Depois de cinco minutos em temperatura ambiente e 15 minutos no gelo, colete as células por centrifugação e resume cuidadosamente a pelota em 25 mililitros de PBS frio e colete as células com outra centrifugação. No final da centrifugação, resuspenge as células em um mililitro de tampão de lise gelada para contar e ajustar as células para uma única vezes 10 às seis células por concentração mililitro.Incubar as células no gelo por 30 minutos, invertendo o tubo a cada dois minutos para misturar e coletar as células com outra centrifugação. Resuspenda a pelota em um mililitro de tampão de lise gelada fresca. Após a centrifugação, lave o lise com um mililitro de tampão de restrição de 1,25X.Centrifugar novamente para coletar o lysate. Resuspenja a pelota em 360 microliters de tampão de restrição fresco e 11 microliters de 10% SDS com tubulação cuidadosa e incubação por 45 minutos a 37 graus Celsius e 7 a 950 revoluções por minuto com tubulação ocasional. No final da incubação, pare a permeabilização com 75 microlitadores de surfactante não iônico e devolva o tubo à incubadora por mais 45 minutos com agitação a 950 revoluções por minuto com pipetação ocasional.Para digestão de cromatina, adicione 200 unidades de Mbo1 ao tubo para uma incubação de quatro a 16 horas a 37 graus Celsius com rotação. Ao final da incubação, inativar a enzima com incubação de 20 minutos a 60 graus Celsius. Para preencher as pendeções do fragmento de restrição e rotular as extremidades de DNA com biotina, adicionar 1,5 microliters cada um de 10 mililitros dCTP, dGTP, dTTP, 20 microlitres de 0,4 milimolar biotina dATP, 17,5 microliters de três baixos buffer EDTA, e 10 microlitres de cinco unidades por microliter de DNA polimerase um grande fragmento para o tubo com mistura cuidadosa.Incubar a reação por 75 minutos a 37 graus Celsius com agitação a 700 revoluções por minuto a cada 10 segundos por 30 segundos. No final da incubação, adicione a mistura de ligadura à cromatina e ajuste-a a um mililitro volume final de reação com mistura suave e incubada durante a noite a 16 graus Celsius. Para degradar as proteínas da amostra, adicione 50 microlitadores de 10 miligramas por mililitro proteinase K ao tubo para uma incubação de duas horas a 37 graus Celsius.No final da incubação, aumente a temperatura para 65 graus Celsius durante a noite para reverter o cruzamento da amostra. Na manhã seguinte, degrade o RNA com 10 microlitres de 10 mililíberos por mililitro RNAse A.Após uma hora a 37 graus Celsius, adicione um volume de clorofórmio fenol ao tubo e misture completamente por inversão para obter uma fase branca homogênea. Depois de precipitar o DNA de acordo com os protocolos padrão, quantifique o DNA usando um corante fluorogênico que se liga seletivamente ao DNA e um fluorômetro de acordo com as instruções do fabricante.Para purificar o DNA de alíquotas não digeridas e digeridas, carregue 100 nanogramas de amostras não digeridas, digeridas e ligadas em um gel de 1,5% de ágarose e procure por uma mancha centrada em cerca de 500 pares de base na amostra digerida versus uma faixa de alto peso molecular para a amostra ligada. Para verificar a marcação hi-C e eficiência de ligadura por amplificação e digestão de uma interação conhecida, após PCR, digerir os produtos com Mbo1, Cla1, ou ambos, e executar as amostras em um novo gel de 1,5 a 2% para permitir a estimativa do número relativo de junções de ligaduras 3C e Hi-C. Depois de sonicar a amostra para obter 200 a 500 fragmentos de DNA do par base, transferir 130 microliters com cinco microgramas de DNA de cada amostra para novos tubos de microcentrífa contendo 16 microliters de tampão de ligadura 10X, dois microlitres de 10 milimolares dATP, cinco microlitradores de polimerase de DNA T4, e sete microliters de água dupla destilada para uma incubação de 30 minutos a 20 graus Celsius.No final da incubação, adicione cinco microlitadores de 10 dNTPs mililitros, quatro microliters de tampão de ligadura 10X, cinco microlitrais de quinase de polinucleotídeo T4, um microliter de polimerase de DNA um grande fragmento, e 25 microliters de água dupla destilada aos tubos para uma segunda incubação de 30 minutos a 20 graus Celsius. Para selecionar fragmentos principalmente na faixa de tamanho do par base de 250 a 550, realize a seleção de tamanho reversível de fase sólida sequencial e de tamanho de mobilização com 0,6X, depois 0,9X de acordo com as instruções do fabricante e elute o DNA com 100 microliters de tris low EDTA. Para puxar biotina para cada biblioteca, lave 150 microliters de contas magnéticas ligadas a Streptavidin duas vezes com 400 microliters de tampão 1X Tween e gire as amostras por três minutos em uma roda giratória.No final da incubação, resuspenja as contas em 300 microliters de tampão 2X no Tween e misture com 300 microliters de material Hi-C para uma rotação de 30 minutos em uma roda giratória. No final da incubação, lave as contas com 400 microliters de tampão 0,5X Tween para uma incubação de três minutos a 55 graus Celsius e 750 rotações por minuto, seguida por duas lavagens em 200 microliters de tampão de restrição 1X por lavagem. Após a segunda lavagem, resuspenque as contas em 100 microliters de mistura de rejeito dATP para uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius.Ao final da incubação, resuspenque as contas em 50 microliters de tampão de ligadura 1X e transfira a suspensão para um novo tubo contendo quatro microliters adaptadores finais emparelhados pré-annealed e dois microliters de ligadura T4. Depois de duas horas em temperatura ambiente, remova o supernatante e lave as contas duas vezes com 400 microliters de tampão de interpolação, depois lave as contas uma vez com 200 microliters sem tampão de Interpol e uma vez com 100 microliters de tampão de restrição antes de suspender novamente as contas em 40 microliters de tampão de restrição 1X. Uma mancha de 200 a 1.000 pares de base é observada quando a restrição com Mbo1 é bem sucedida.Se a ligadura for bem sucedida, uma faixa de alto peso molecular é observada no topo do gel. A eficiência de digestão também pode ser confirmada por PCR quantitativo. Uma eficiência de digestão aceitável é de 80% ou mais.Como ilustrado, a amplificação de uma interação conhecida de média gama em produtos de ligadura Hi-C pode ser estimada pela digestão do produto PCR recuperado na amplificação. Recomenda-se uma eficiência de digestão superior a 70% para evitar ter uma grande proporção de leituras não úteis para as bibliotecas após o sequenciamento. O número de ciclos de PCR para a amplificação final deve ser um ciclo menor do que o número de ciclos para os quais a mancha é visível.O nível de digestão da biblioteca indica a abundância de pares Hi-C válidos e reflete a proporção de leituras úteis que serão obtidas da biblioteca. Utilizando os pares Hi-C válidos exclusivos, a análise básica da distribuição do par pode ser realizada. Como observado neste exemplo representativo, o lócus genético NOTCH pode ser visto juntamente com as proteínas arquitetônicas, domínios um e dois, e modificações histonas ao longo do lócus.Após a exclusão da região contendo os locais de ligação de DNA CTCF e M1BP, uma mudança drástica nos contatos de cromatina pode ser observada. Após o experimento Hi-C, pode ser realizado um conjunto específico de contatos, por exemplo, de regiões promotoras. Isso é particularmente útil na avaliação de genomas grandes.Como demonstrado, a combinação do protocolo Hi-C com a adição genética pode ser usada para avaliar a função estrutural e regulatória dos elementos genômicos.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Rotulagem de replicação de DNA mitocondrial em Drosophila Adulto Ovários por Edu Coloração

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Genética

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantificando pigmentação abdominal em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Promotor captura Oi-c: Alta resolução, todo o genoma caracterização das interações do promotor

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Purificação de células Low-abundante no sistema Visual da drosófila

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Estudo funcional in vivo de variantes humanas raras associadas à doença usando Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In vivo Forward genética Screen para identificar novos genes neuroprotetores em Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Uso de células de Drosophila S2 para imagens ao vivo da divisão celular

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigação do papel transcricional de um silenciador intrônico RUNX1 por crispr/Cas9 Ribonucleoproteína em células de leucemia mielóide aguda

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Um protocolo baseado em FACS para isolar o RNA das células secundárias de glândulas acessórias masculinas de Drosophila

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay

Detecção de acumulação e reparo de lacunas pós-replicativas em células humanas usando o ensaio de fibra de DNA

The DNA fiber assay is a simple and robust method for the analysis of replication fork dynamics, based on the immunodetection of nucleotide analogs that ...