Name: in-nucleus hi-c in drosophila cells
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av UNAM Technology Innovation and Research Support Program (PAPIIT) bidragsnummer 207319 och Science and Technology National Council (CONACyT-FORDECyT) anslagsnummer 303068. A.E.-L. är en masterstudent med stöd av Science and Technology National Council (CONACyT) CVU-nummer 968128.

1. Fixering
<ol><li>Börja med 10 miljoner Schneiders linje 2 plus (S2R+) celler för att förbereda 17,5 ml cellfjädring i Schneider medium som innehåller 10% fetala nötkreatursserum (FBS) vid rumstemperatur (RT).</li>
	<li>Tillsätt metanolfri formaldehyd för att få en slutlig koncentration på 2%. Blanda och inkubera i 10 minuter på RT, var noga med att blanda varje minut. OBS: Formaldehyd är en farlig kemikalie. Följ lämpliga hälso- och säkerhetsbestämmelser och arbeta i rökhuven.</li>
	<li>Släcker...

<ol>
	<li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+territories,+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells.">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li><li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485, 376-380 (2012).</li><li>Sexton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+folding+and+functional+organization+principles+of+the+Drosophila+genome.">Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome.</a> Cell. 148 (3), 458-472 (2012).</li><li>Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+domains:+the+unit+of+chromosome+organization.">Chromatin domains: the unit of chromosome organization.</a> Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).</li><li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+3D+genome.">Organization and function of the 3D genome.</a> Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).</li><li>Lupi&#225;&#241;ez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+TADs:+how+alterations+of+chromatin+domains+result+in+disease.">Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease.</a> Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).</li><li>Phillips, J. E., Corces, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF:+master+weaver+of+the+genome.">CTCF: master weaver of the genome.</a> Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).</li><li>Hong, S., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+characterization+of+chromatin+domain+boundary-associated+genomic+elements.">Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements.</a> Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).</li><li>Zuin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin+and+CTCF+differentially+affect+chromatin+architecture+and+gene+expression+in+human+cells.">Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).</li><li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+inversion+of+CTCF+sites+alters+genome+topology+and+enhancer/promoter+function.">CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function.</a> Cell. 162, 900-910 (2015).</li><li>Lupi&#225;&#241;ez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions.">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161, 1012-1025 (2015).</li><li>Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+transcription+in+shaping+the+spatial+organization+of+the+genome.">The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).</li><li>Merkenschlager, M., Nora, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+and+cohesin+in+genome+folding+and+transcriptional+gene+regulation.">CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).</li><li>Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+and+cohesin+regulate+chromatin+loop+stability+with+distinct+dynamics.">CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics.</a> Elife. 6, 1-10 (2017).</li><li>Van Bortle, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulator+function+and+topological+domain+border+strength+scale+with+architectural+protein+occupancy.">Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy.</a> Genome Biology. 15, 82 (2014).</li><li>Ram&#237;rez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies.">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> Nature Communications. 9, 189 (2018).</li><li>Ulianov, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+chromatin+and+transcription+play+a+key+role+in+chromosome+partitioning+into+topologically+associating+domains.">Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains.</a> Genome Research. 26, 70-84 (2016).</li><li>Rowley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionarily+conserved+principles+predict+3D+chromatin+organization.">Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization.</a> Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).</li><li>Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actual+ligation+frequencies+in+the+chromosome+conformation+capture+procedure.">Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure.</a> PLoS One. 8, 60403 (2013).</li><li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disclosure+of+a+structural+milieu+for+the+proximity+ligation+reveals+the+elusive+nature+of+an+active+chromatin+hub.">Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub.</a> Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).</li><li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+Hi-C+reveals+cell-to-cell+variability+in+chromosome+structure.">Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure.</a> Nature. 502, 59-64 (2013).</li><li>Rao, S. S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping.">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li><li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Hi-C+results+using+in-solution+versus+in-nucleus+ligation.">Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation.</a> Genome Biology. 16, 175 (2015).</li><li>Arzate-Mej&#237;a, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+dissection+of+domain+boundaries+affect+genome+topology+and+gene+transcription+in+Drosophila.">In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila.</a> Nature Communications. 11, 894 (2020).</li><li>Schoenfelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter+capture+Hi-C:+high-resolution,+genome-wide+profiling+of+promoter+interactions.">Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).</li><li>Servant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiC-Pro:+an+optimized+and+flexible+pipeline+for+Hi-C+processing.">HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing.</a> Genome Biology. 16, 259 (2015).</li><li>Philip, E., M&#229;ns, M., Sverker, L., Max, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+Summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 10, 1093 (2016).</li><li>Wingett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiCUP:+pipeline+for+mapping+and+processing+Hi-C+data.">HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data.</a> F1000 Research. 4, 1310 (2015).</li><li>Imakaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iterative+correction+of+Hi-C+data+reveals+hallmarks+of+chromosome+organization.">Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization.</a> Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).</li><li>Akdemir, K. C., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiCPlotter+integrates+genomic+data+with+interaction+matrices.">HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices.</a> Genome Biolog. 16, 198 (2015).</li><li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies.">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> Nature Communications. 9, 189 (2018).</li><li>Ando-Kuri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+and+promoter-centric+3D+genome+organization+temporally+resolved+during+a+circadian+cycle.">The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Cuellar-Partida, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+priors+for+identifying+active+transcription+factor+binding+sites.">Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites.</a> Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9, 137 (2008).</li><li>Ong, C. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ADP-ribosyl)ation+regulates+insulator+function+and+intrachromosomal+interactions+in+Drosophila.">Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila.</a> Cell. 155 (1), 148-159 (2013).</li><li>Fres&#225;n, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+insulator+protein+CTCF+regulates+Drosophila+steroidogenesis.">The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis.</a> Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).</li><li>Quinodoz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+promotes+the+formation+of+spatial+compartments+in+the+nucleus.">RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus.</a> Cell. 174, 744-757 (2018).</li><li>Olivares-Chauvet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+pairwise+and+multi-way+chromosomal+conformations+using+chromosomal+walks.">Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks.</a> Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).</li><li>Beagrie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+multi-enhancer+contacts+captured+by+genome+architecture+mapping.">Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping.</a> Nature. 543, 519-524 (2017).</li><li>Redolfi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DamC+reveals+principles+of+chromatin+folding+in+vivo+without+crosslinking+and+ligation.">DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).</li><li>Maxwell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiChIP:+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture.">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13, 919-922 (2016).</li><li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-BERST:+Defining+subnuclear+proteomic+landscapes+at+genomic+elements+with+dCas9-APEX2.">C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2.</a> Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).</li></ol>

Hi-C-metoden i nukleos som presenteras här har möjliggjord detaljerad utforskning av Drosophila genomtopologi med hög upplösning, vilket ger en bild av genomiska interaktioner i olika genomiska skalor, från kromatinöglor mellan regulatoriska element som promotors och förstärkare till TADs och stor fackidentifiering25. Samma teknik har också tillämpats effektivt på däggdjursvävnader med vissa modifieringar33. Till exempel, vid bearbetning av en vävnad istället...

I eukaryoter delas genomet i kromosomer som upptar specifika territorier i kärnområdet under interfas1. Kromatin som bildar kromosomerna kan delas in i två huvudstater: en av tillgängliga kromatin som är transkriptionellt tillåtande, och den andra av kompakt kromatin som är transkriptionellt repressiv. Dessa kromatin tillstånd segregera och blanda sällan i kärnrummet, bildar två distinkta fack i kärnan2. På sub-megabase-skalan separerar gränser domäner för högfrekventa kromatininteraktioner, så kallade TADs, som markerar kromosomorganisation3,4,5. Hos däggdjur upptas TAD-gränserna av kohins och CCCTC-bindande faktor (CTCF)6,7,8. Det sammanhållna komplexet extruderar kromatin och stannar vid CTCF-bindande platser som kasseras i konvergent orientering i den genomiska sekvensen för att bilda stabila kromatinöglor9,10,13,14. Genetisk störning av CTCF DNA-bindande plats vid gränserna eller minskning av CTCF och kohin protein överflöd resulterar i onormala interaktioner mellan reglerande element, förlust av TAD bildas och genuttryck avreglering9,10,11,13,14.
I Drosophila, Gränserna mellan TADs upptas av flera APs, inklusive gränselement-associerade faktor 32 kDa (BEAF-32), Motif 1 bindande protein (M1BP), centrosomal protein 190 (CP190), suppressor av hårig vinge (SuHW) och CTCF, och berikas i aktiva histon modifieringar och Polymerase II16,17,18. Det har föreslagits att i Drosophila visas TADs som en följd av transkription13,17,19, och den exakta rollen av oberoende APs i gränsbildning och isoleringsegenskaper är fortfarande under utredning. Huruvida domäner i Drosophila är en enda följd av aggregering av regioner med liknande transkriptionstillstånd eller om APs, inklusive CTCF, bidrar till gränsbildning återstår därför att helt karakterisera. Utforskning av genomiska kontakter med hög upplösning har varit möjlig genom utveckling av kromosomkonformationsfångstteknik i kombination med nästa generations sekvensering. Hi-C protokollet beskrevs först med ligatur steget utförs "i lösning"2 i ett försök att undvika falska ligatur produkter mellan kromatin fragment. Flera studier pekade dock på insikten att den användbara signalen i data kom från ligaturprodukter som bildats vid delvis lysade atomkärnor som inte fanns i lösning20,21.
Protokollet ändrades sedan för att utföra ligaturen inuti kärnan som en del av Hi-C-experimentet med en cell22. Hi-C-protokollet i nukleos införlivades därefter i cellpopulationen Hi-C för att ge en mer konsekvent täckning över hela skalet av genomiska avstånd och producera data med mindre tekniskt brus23,24. Protokollet, som beskrivs i detalj här, är baserat på populationen i kärnan Hi-C protokoll23,24 ochanvändes för att undersöka konsekvenserna av genetiskt avlägsnande DNA-bindande motiv för CTCF och M1BP från en domängräns vid Notch gen locus i Drosophila25. Resultaten visar att en ändring av DNA-bindande motiv för APs vid gränsen har drastiska konsekvenser för Notch domänbildning, större topologiska defekter i regionerna kring Notch locus och genuttryck avreglering. Detta indikerar att genetiska element vid domängränser är viktiga för upprätthållandet av genomtopologi och genuttryck i Drosophila25.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% (vol/vol) paraformaldehyde solution</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>R1026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dATP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>CA1524-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClaI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0197S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COVARIS Ultrasonicator</td>
			<td>Covaris</td>
			<td>LE220-M220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cut Smart</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B72002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptabidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow Dna PolI large fragment</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Klenow exo(-)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0210S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Buffer</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B020S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MboI enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0147M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP40-Igepal</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>CA-420</td>
			<td>Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE adapter 1.0</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>5&#39;-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG 
			GAATGCCGAG-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE adapter 2.0</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>5&#39;-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT 
			CTTCCGATCT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE PCR primer 1.0</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>5&#39;-AATGATACGGCGACCACCGAGAT 
			CTACACTCTTTCCCTACACGACG 
			CTCTTCCGATCT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE PCR primer 2.0</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>5&#39;-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 
			ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA 
			ACCGCTCTTCCGATCT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>P2069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 1 (known interaction, Figure 2A)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5&#39;-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 2 (known interactions, Figure 2A)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5&#39;-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3&#39;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablet</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693132001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115879001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q33327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10109142001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRI Beads</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>B23318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA ligase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15224-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0203S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 polynucleotide kinase (PNK)&#160;</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0201L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqPhusion</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S</td>
			<td>DNA polymerase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Non-ionic surfactant for quenching of SDS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in-nucleus hi-c in drosophila cells

Genomet är organiserat i topologiskt associerande domäner (TADs) avgränsade av gränser som isolerar interaktioner mellan domäner. I Drosophila är de mekanismer som ligger till grund för TAD-bildandet och gränserna fortfarande under utredning. Tillämpningen av in-nucleus Hi-C-metoden som beskrivs här hjälpte till att dissekera funktionen av arkitektoniskt protein (AP)-bindande platser vid TAD-gränser som isolerar skårgenen. Genetisk modifiering av domängränser som orsakar förlust av APs resulterar i TAD fusion, transkriptionella defekter och långdistans topologiska förändringar. Dessa resultat gav bevis som visar bidrag av genetiska element till domän gränsbildning och genuttryck kontroll i Drosophila. Här har hi-C-metoden i nukleus beskrivits i detalj, vilket ger viktiga kontrollpunkter för att bedöma experimentets kvalitet tillsammans med protokollet. Också visas de erforderliga numrerar av sekvenseringläsningar och giltiga Hi-C parar för att analysera genomic växelverkan på olika genomic fjäll. CRISPR/Cas9-medierad genetisk redigering av regulatoriska element och högupplöst profilering av genomiska interaktioner med hjälp av detta in-nucleus Hi-C-protokoll kan vara en kraftfull kombination för undersökning av genetiska elements strukturella funktion.

Nedan beskrivs resultaten av ett framgångsrikt Hi-C-protokoll (se en sammanfattning av arbetsflödet för Hi-C-protokoll i figur 1A). Det finns flera kvalitetskontrollpunkter under Hi-C-experimentet i nukleus. Prov alikvoter samlades in före (UD) och efter (D) chromatin begränsning steg samt efter ligatur (L). Korslänkar var omvända, och DNA renades och körs på en agarose gel. Ett utstryk på 200-1000 bp observerades när begränsningen med Mbo I lyckades (Figur 1...

Watch this Scientific Journal Video about In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells at JoVE.com

In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells

Genomet är organiserat i kärnrummet i olika strukturer som kan avslöjas genom kromosomkonformationsfångstteknik. Hi-C-metoden i nukleus ger en genomomfattande samling kromatininteraktioner i Drosophila-cellinjer, som genererar kontaktkartor som kan utforskas vid megabasupplösning på begränsningsfragmentnivå.

In-Nucleus Hi-C i Drosophila celler

The genome is organized into topologically associating domains (TADs) delimited by boundaries that isolate interactions between domains. In Drosophila, ...

Nucleus Hi-C-protokollen tillåter utforskning av kromosomal bekräftelse med olika upplösning för karakterisering av kromatin loopar, domäner och fack organisera genomet. Detta protokoll ger högupplöst profilering av genomiska interaktioner i olika skalor, vilket ger en mer konsekvent täckning över hela skalan av genomiska avstånd och data med mindre tekniskt brus. Att kombinera detta protokoll med genetisk redigering är en kraftfull strategi för att testa genetiska elements strukturella funktion.Det kan också tillämpas på karakterisering av strukturella variationer som leder till sjukdom. Kärnan Hi-C protokoll kan tillämpas för att utforska genom organisationen av alla eukaryotic genom. Att göra SDS- och Triton-behandling disaggregerar alla kärnklumpar genom pipetting eftersom aggregat stör enzymatisk reaktionseffektivitet och var noga med att utföra lämpliga kvalitetskontroller före sekvensering.Börja med att tillsätta metanolfri formaldehyd till en gånger 10 till de sju Schneider's Line 2 Plus Drosophila-cellerna i 17,5 milliliter Schneider medium kompletterat med 10%FBS till en slutlig koncentration på 2%Inkubera cellerna i 10 minuter vid rumstemperatur med blandning var 60: e sekund eller på ett roterande hjul, och tillsätt glycin till en slutlig koncentration av 0,125 molar med blandning. Efter fem minuter vid rumstemperatur och 15 minuter på is, samla cellerna genom centrifugering och försiktigt återanvänd pelleten i 25 milliliter kall PBS och samla cellerna med en annan centrifugation. I slutet av centrifugationen återanvände cellerna i en milliliter iskyllysbuffert för att räkna och justera cellerna till en gång 10 till de sex cellerna per milliliterkoncentration.Inkubera cellerna på is i 30 minuter, vänd röret varannan minut för att blanda och samla cellerna med en annan centrifugation. Återanvänd pelleten i en milliliter färsk iskall lysbuffert. Efter centrifugering, tvätta lysatet med en milliliter 1,25X begränsningsbuffert.Centrifug igen för att samla lysatet. Återanvänd pelleten i 360 mikroliter färsk begränsningsbuffert och 11 mikroliter på 10%SDS med noggrann pipetting och inkubera i 45 minuter vid 37 grader Celsius och 7 till 950 varv per minut med tillfällig pipetting. I slutet av inkubationen, stoppa permeabiliseringen med 75 mikroliter icke-joniskt tensid och sätt tillbaka röret till inkubatorn i ytterligare 45 minuter med skakningar vid 950 varv per minut med tillfällig pipetting.För kromatin matsmältning, tillsätt 200 enheter Mbo1 till röret för en fyra till 16-timmars inkubation vid 37 grader Celsius med rotation. I slutet av inkubationen inaktiverar enzymet med 20 minuters inkubation vid 60 grader Celsius. För att fylla i restriktionsfragmentets överhäng och märka DNA-ändarna med biotin, tillsätt 1,5 mikroliter var och en av 10 millimolar dCTP, dGTP, dTTP, 20 mikroliter 0,4 millimolär biotin dATP, 17,5 mikroliter tris låg EDTA-buffert och 10 mikroliter av fem enheter per mikroliter DNA-polymeras ett stort fragment till röret med noggrann blandning.Inkubera reaktionen i 75 minuter vid 37 grader Celsius med skakningar vid 700 varv per minut var 10: e sekund i 30 sekunder. I slutet av inkubationen, tillsätt ligationsblandningen till kromatin och justera den till en milliliter slutlig reaktionsvolym med noggrann skonsam blandning och inkubera över natten vid 16 grader Celsius. För att bryta ner provproteinerna, tillsätt 50 mikroliter på 10 milligram per milliliter proteinas K till röret för en två timmars inkubation vid 37 grader Celsius.I slutet av inkubationen, öka temperaturen till 65 grader Celsius över natten för att vända korslänk provet. Nästa morgon, försämra RNA med 10 mikroliter på 10 milligram per milliliter RNAse A.Efter en timme vid 37 grader Celsius, tillsätt en volym fenolklorid till röret och blanda noggrant genom inversion för att få en homogen vit fas. Efter att dna-medlet fälls ut enligt standardprotokoll kvantifierar du DNA:t med hjälp av ett fluorogent färgämne som selektivt binder till DNA och en fluorometer enligt tillverkarens instruktioner.För att rena DNA från osmältade och smälta alikvoter, ladda 100 nanogram osmält, smälta och ligaterade prover på en 1,5%agarose gel och leta efter ett utstryk centrerat runt 500 baspar i det smälta provet jämfört med ett högt molekylviktsband för det ligaterade provet. För att verifiera Hi-C-märkningen och ligatureffektiviteten genom förstärkning och matsmältning av en känd interaktion, efter PCR, smälter produkterna med Mbo1, Cla1 eller båda, och kör proverna på en ny 1,5 till 2%gel för att möjliggöra uppskattning av det relativa antalet 3C och Hi-C ligatur korsningar. Efter ultraljudsbehandling av provet för att erhålla 200 till 500 DNA-fragment av basparet, överföra 130 mikroliter med fem mikrogram DNA från varje prov till nya mikrocentrifugrör som innehåller 16 mikroliter 10X ligationsbuffert, två mikroliter på 10 millimolar dATP, fem mikroliter T4 DNA-polymeras och sju mikroliter dubbeldestillerat vatten för en 30-minuters inkubation vid 20 grader Celsius.I slutet av inkubationen, tillsätt fem mikroliter på 10 millimolar dNTPs, fyra mikroliter av 10X ligationsbuffert, fem mikroliter T4 polynukleotidkinas, en mikroliter DNA-polymeras ett stort fragment och 25 mikroliter dubbeldestillerat vatten till rören för en andra 30-minuters inkubation vid 20 grader Celsius. För att välja fragment mestadels i intervallet 250 till 550 basparstorlek, utför sekventiellt val av solid fas reversibel och mobiliseringsstorlek med 0,6X, sedan 0,9X enligt tillverkarens instruktioner och eluera DNA med 100 mikroliter tris låg EDTA. För biotindragning för varje bibliotek, tvätta 150 mikroliter Streptavidin-länkade magnetiska pärlor två gånger med 400 mikroliter 1X Tween-buffert och rotera proverna i tre minuter på ett roterande hjul.I slutet av inkubationen, återanvänd pärlor i 300 mikroliter av 2X ingen interpoleringsbuffert och blanda med 300 mikroliter Hi-C-material för en 30-minuters rotation på ett roterande hjul. I slutet av inkubationen, tvätta pärlorna med 400 mikroliter 0,5X interpoleringsbuffert för en tre minuters inkubation vid 55 grader Celsius och 750 varv per minut, följt av två tvättar i 200 mikroliter med 1X begränsningsbuffert per tvätt. Efter den andra tvätten, återanvända pärlor i 100 mikroliter dATP tailing mix för en 30-minuters inkubation vid 37 grader Celsius.I slutet av inkubationen, återanvända pärlor i 50 mikroliter 1X ligationsbuffert och överför suspensionen till ett nytt rör som innehåller fyra mikroliter förglödgade parade slutadaptrar och två mikroliter T4 ligase. Efter två timmar vid rumstemperatur, ta bort supernaten och tvätta pärlorna två gånger med 400 mikroliter Tween-buffert, tvätta sedan pärlorna en gång med 200 mikroliter utan interpoleringsbuffert och en gång med 100 mikroliter begränsningsbuffert innan du åter avbryter pärlorna i 40 mikroliter 1X begränsningsbuffert. Ett utstryk på 200 till 1 000 baspar observeras när begränsningen med Mbo1 lyckas.Om ligaturen lyckas observeras ett högmolekylviktsband högst upp på gelén. Matsmältningseffektivitet kan också bekräftas av kvantitativ PCR. En acceptabel matsmältningseffektivitet är 80%eller högre.Som illustreras kan förstärkningen av en känd mellanklassinteraktion i Hi-C-ligaturprodukter uppskattas genom matsmältningen av PCR-produkten som återvinns vid förstärkningen. En matsmältningseffektivitet på mer än 70%rekommenderas för att undvika att ha en stor andel icke-användbara läsningar för biblioteken efter sekvensering. Antalet PCR-cykler för den slutliga förstärkningen bör vara en cykel mindre än antalet cykler för vilka utstryket är synligt.Bibliotekets matsmältningsnivå anger överflödet av giltiga Hi-C-par och återspeglar andelen användbara läsningar som kommer att erhållas från biblioteket. Med hjälp av de unika giltiga Hi-C-paren kan grundläggande analys av parfördelningen utföras. Som observerats i detta representativa exempel kan NOTCH-genloken ses tillsammans med arkitektoniska proteiner, domäner ett och två och histonmodifieringar längs locus.Vid borttagning av regionen som innehåller både CTCF och M1BP DNA-bindande platser, en dramatisk förändring i kromatin kontakter kan observeras. Efter Hi-C-experimentet kan en utföras för att nå en viss uppsättning kontakter, till exempel från promotorregioner. Detta är särskilt användbart vid bedömning av stora genom.Som visats kan kombinationen av Hi-C-protokollet med genetisk tillsats användas för att bedöma den strukturella och regulatoriska funktionen hos genomiska element.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Märkning av mitokondrie-DNA-replikering i Drosophila vuxen Äggstockar från edu färgning

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Kvantifiering av bukpigmentering i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Arrangören Capture-C: Högupplösta, Genome-wide profilering av promotorn interaktioner

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

Purification of Low-abundant Cells in the Drosophila Visual System

Rening av låg-riklig celler i Drosophila visuella systemet

Recent improvements in the sensitivity of next generation sequencing have facilitated the application of transcriptomic and genomic analyses to small ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In vivo funktionell studie av sjukdomsassocierade sällsynta humana varianter med hjälp av Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In vivo framåt genetisk skärm för att identifiera nya neuroprotektiva gener i Drosophila melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division

Användning av Drosophila S2-celler för levande avbildning av cell delning

Drosophila S2 cells are an important tool in studying mitosis in tissue culture, providing molecular insights into this fundamental cellular process in a ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Utredning av den transkriptionella roll som en RUNX1 Intronic ljuddämpare av CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein i akut myeloisk leukemi celler

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Ett FACS-baserat protokoll för att isolera RNA från de sekundära cellerna i Drosophila manliga tillbehörs körtlar

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...

Detection of Post-Replicative Gaps Accumulation and Repair in Human Cells Using the DNA Fiber Assay

Detektion av postreplikativa luckor ackumulering och reparation i mänskliga celler med hjälp av DNA-fiberanalysen

The DNA fiber assay is a simple and robust method for the analysis of replication fork dynamics, based on the immunodetection of nucleotide analogs that ...