Name: ubiquitous and tissue-specific rna targeting in drosophila melanogaster using crispr/casrx
Uploaded: 2021-02-05T15:00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato in parte dal finanziamento di una sovvenzione del programma DARPA Safe Genes (HR0011-17-2-0047) e dai premi NIH (R21RAI149161A, DP2AI152071) assegnati a O.S.A.

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O.S.A è uno dei fondatori di Agragene, Inc., ha una partecipazione azionaria e fa parte del comitato consultivo scientifico della società. I termini di questo accordo sono stati rivisti e approvati dall'Università della California, San Diego in conformità con le sue politiche di conflitto di interessi. Tutti gli altri autori non dichiarano interessi concorrenti.

Con tre diversi progetti applicativi del sistema CasRx, questo lavoro ha dimostrato il targeting dell'RNA in vivo programmabile nelle mosche. Le diverse strategie soddisfano le diverse esigenze del progetto, come il targeting genico endogeno rispetto a quello esogeno e il targeting RNA ubiquitario rispetto a quello specifico del tessuto. Gli effetti del targeting dell'RNA includevano cambiamenti fenotipici specifici del gene bersaglio, riduzione del trascritto dell'RNA bersaglio e fenotipi occasionali di letalità associati all'alta espressione della proteina CasRx e all'attività collaterale. Nel complesso, questi risultati hanno mostrato che il sistema CasRx è in grado di indirizzare la riduzione del trascritto dell'RNA a livello dell'organismo in modo programmabile ed efficiente.
Uno dei fattori chiave per il successo della personalizzazione del sistema CasRx è la progettazione di gRNA. In particolare, si deve prestare attenzione ai seguenti consigli: la sequenza target è lunga circa 30 nucleotidi, la lunghezza degli allungamenti poly-U nella sequenza target è di 4 coppie di basi o meno, il contenuto gc della sequenza target è compreso tra il 30% e il 70%, la sequenza target non è prevista per formare forti strutture a forcina di RNA e la sequenza target contiene una struttura secondaria o terziaria minima prevista dell'RNA5.
Oltre ai progetti di gRNA, anche la fase di genetica delle mosche in ogni protocollo è fondamentale per un'implementazione di successo. La presenza o la mancanza dei fenotipi definiti tramandati dai genitori nelle progenie sono importanti per identificare e quantificare i fenotipi indotti dal sistema CasRx nelle progenie transeterozigoti. Inoltre, l'impostazione di incroci di controllo utilizzando le mosche dCasRx in parallelo è anche utile per escludere fenotipi non specifici nelle progenie transeterozigoti.
Vale la pena notare che questi risultati hanno rivelato un problema di tossicità introdotto dall'espressione ubiquitaria delle proteine CasRx e dCasRx nella mosca, una limitazione del sistema CasRx. L'espressione onnipresente di CasRx o dCasRx sotto il solo promotore Ubiq, senza gRNA, ha comportato costi di fitness non banali, poiché né le mosche Ubiq-CasRx né Ubiq-dCasRx potevano essere stabilite come linee omozigoti. Al contrario, le mosche UASt-CasRx e UASt-dCasRx possono essere stabilite come stock omozigoti sani, anche se a causa della progettazione dello schema incrociato sono state mantenute come scorte a doppio equilibrio, un fatto che supporta l'esistenza di tossicità indotta dall'espressione onnipresente della proteina CasRx. Un'altra prova a sostegno è che negli esperimenti di controllo che coinvolgono dCasRx, che è cataliticamente inattivo, le percentuali di mosche che trasportano sia dCasRx che costrutti gRNA sul numero totale di mosche nella generazione F1 erano costantemente inferiori al 50%, il rapporto atteso sulla base della genetica mendeliana se non era presente tossicità associata a dCasRx. Ciò ha indicato che l'espressione ubiquitaria di dCasRx, insieme ai gRNA, induce tossicità nella mosca, risultando in un rapporto di ereditarietà inferiore al previsto. I rapporti di ereditarietà delle mosche transeterozigoti UASt-dCasRx, gRNA, GAL4 hanno seguito la genetica mendeliana, che suggerisce ancora una volta la tossicità indotta specificamente dall'espressione ubiquitaria delle proteine CasRx e dCasRx. La tossicità nel sistema CRISPR/Cas non è nuova. Elevate quantità di proteina Cas9 hanno dimostrato di essere tossiche in diversi organismi, tra cui le mosche29,30,31,32. Un recente studio ha sviluppato un sistema GAL4/UAS personalizzato in grado di sintonizzare la quantità di proteina Cas9 espressa nelle mosche aggiungendo un frame di lettura aperto di lunghezza variabile tra la sequenza UAS e la sequenza Cas9 nel costrutto UAS-Cas933. Pertanto, vale la pena esplorare modi per ridurre la tossicità indotta da CasRx regolando il livello di espressione della proteina CasRx.
Oltre alla tossicità indotta dall'espressione ubiquitaria delle proteine CasRx e dCasRx, i risultati hanno anche mostrato letalità legata agli effetti collaterali non specifici fuori bersaglio del sistema CasRx, una caratteristica di molti sistemi CRISPR1,2,7,34. In alcune delle mosche transeterozigoti doppie o triple che esprimono gRNA casRx e geni non essenziali che esprimono gRNA, ad esempio quando prendono di mira Notch, le mosche CasRx transeterozigoti hanno livelli significativamente più bassi di tasso di sopravvivenza rispetto alle mosche dCasRx transeterozgine. Nell'analisi RNA-seq di queste mosche transeterozigoti che esprimono CasRx e gRNA, sono state osservate sia la riduzione dei livelli di trascrizione genica bersaglio che la riduzione dei trascritti genici non bersaglio. Questi effetti collaterali erano CasRx-dipendenti e target-dipendenti, in quanto sono stati osservati solo nelle mosche transeterozigoti che esprimono sia la proteina CasRx che il gRNA. Vale la pena sottolineare che uno dei geni bersaglio, il bianco, ha mostrato solo una riduzione limitata e non statisticamente significativa dei trascritti quando il gene bianco è stato preso di mira da CasRx, che era in contrasto con il fenotipo di riduzione del pigmento chiaro. Si ipotizza che ciò possa essere dovuto al fatto che 1) i tempi di raccolta del campione RNA-seq non erano ben allineati con i tempi in cui il gene bianco raggiunge la sua massima espressione durante lo sviluppo precoce e 2) l'espressione localizzata del gene bianco negli occhi rende difficile raccogliere i tessuti rilevanti durante la fase iniziale di sviluppo quando è possibile solo la raccolta di campioni di tutto il corpo. Per ridurre l'attività collaterale nel sistema CasRx, sono necessari studi futuri per comprendere appieno i meccanismi alla base del sistema di fenomeni off-target a livello di organismo.
È interessante notare che un recente studio35 che descrive gli strumenti Cas13 che prendono di mira l'RNA nelle mosche sembrava migliorare la tossicità generale associata all'espressione di CasRx, per diverse possibili ragioni. In primo luogo, gli autori hanno ricodificato i transgeni Cas13 per ottimizzare l'espressione in Drosophila e hanno utilizzato un promotore più debolmente espressivo (actina 5C) rispetto al promotore dell'ubiquitina utilizzato nel presente studio, probabilmente portando a livelli più bassi di espressione di Cas13 e quindi meno tossicità. In effetti, questo è supportato dalle osservazioni che l'espressione di CasRx e dCasRx guidata da UASt non era, di per sé, tossica, poiché questo studio (e gli autori in 35) non hanno osservato alcuna letalità evidente nelle mosche UASt-CasRx. Inoltre, questi autori hanno codificato i loro gRNA in modo diverso rispetto a questo studio, il che potrebbe aver influenzato la loro espressione e ridotto la tossicità del sistema nelle mosche transeterozigoti Cas13 / gRNA. Ad esempio, nel loro studio due gRNA sono stati espressi utilizzando il promotore U6: 3 e affiancati da tRNA per consentire l'elaborazione del gRNA alla maturazione del tRNA senza richiedere CasRx35. Al contrario, in questo studio, i gRNA sono stati codificati come array che prendono di mira fino a 4 posizioni per gene e imitano la struttura endogena dell'array Cas13 trovata nei batteri, che richiede l'enzima Cas13 per elaborare ciascun gRNA. Questi diversi approcci possono aver portato a differenze nei livelli di espressione del gRNA e altri fattori che possono avere effetti intrinseci sulla tossicità dell'intero sistema. Infine, Huynh et al. hanno preso di mira geni diversi da quelli presi di mira nel presente studio, che si traducono in differenze nell'interazione bersaglio-Cas / gRNA e nell'attività collaterale e possono avere effetti sui livelli osservati di letalità. Queste differenze nella tossicità osservata giustificano ulteriori indagini per identificare i modi in cui i sistemi complessivi possono essere migliorati.
Nel complesso, questo studio è la prima dimostrazione di un sistema Cas funzionale programmabile programmabile con targeting dell'RNA in D. melanogaster, anche se sarà necessaria un'ulteriore ottimizzazione del sistema CasRx (in linea con quanto riportato35) per ridurre ulteriormente la letalità associata fuori bersaglio e aumentare l'efficacia della scissione CasRx on-target. Il targeting dell'RNA con gli enzimi Cas è un campo in rapida evoluzione con molte potenziali applicazioni che vanno dal controllo degli insetti vettori agli usi terapeutici1,2,3,4,5,6,7, e questo protocollo offre un pacchetto iniziale per chiunque sia interessato a progettare il proprio primo sistema CasRx nelle mosche, pur essendo compatibile con la personalizzazione e l'ulteriore ottimizzazione del sistema. Gli esempi qui presentati dimostrano una serie di risultati che si possono incontrare durante l'implementazione di questo sistema in vivo e possono servire come parametri di riferimento per altri utenti nella valutazione delle prestazioni del sistema CasRx nelle loro applicazioni.

Dall'avvento delle tecnologie CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), gran parte dell'attenzione in questo campo si è concentrata sull'editing del DNA, che offre applicazioni trasformative in medicina e biotecnologia1. L'alterazione permanente delle sequenze di DNA, tuttavia, non è sempre desiderata a causa di considerazioni etiche. Alla luce di ciò, studi recenti hanno iniziato a sviluppare strumenti basati su CRISPR per il targeting dell'RNA e hanno dimostrato che le tecnologie CRISPR possono effettivamente essere utilizzate per il targeting dell'RNA in una varietà di sistemi biologici2,3,4,5,6,7. In molti di questi sistemi testati, l'attuale approccio ampiamente utilizzato per il targeting dell'RNA e la riduzione del trascritto è l'interferenza dell'RNA (RNAi), che è tutt'altro che perfetta, spesso mostrando un'efficacia varia e un'elevata attività off-target quando usato in vivo8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Pertanto, dato lo stato di queste tecnologie, vale la pena esplorare ulteriormente le potenzialità degli strumenti basati su CRISPR per il targeting dell'RNA.
Un importante studio recente ha riportato che la ribonucleasi CasRx, membro della classe Cas13d, può ridurre efficacemente i livelli di trascrizione genica nella coltura cellulare umana e possiede un attraente profilo off-target4. Questa scoperta ha portato alla domanda se questa nuova ribonucleasi possa mantenere la sua efficacia e il basso tasso off-target per il targeting dell'RNA a livello di organismo. Un recente studio ha affrontato questa domanda dimostrando che il sistema CasRx può essere utilizzato per ottenere una riduzione del trascritto genico ubiquitario e specifico del tessuto in Drosophila melanogaster5.
Per semplificare l'usabilità di questo approccio recentemente pubblicato, questo protocollo descrive in dettaglio i metodi di questo recente lavoro, che consiste di tre parti principali: 1) targeting RNA ubiquitario in vivo utilizzando un sistema CasRx a due componenti; 2) targeting RNA esogeno ubiquitario in vivo utilizzando un sistema CasRx a tre componenti; e 3) targeting dell'RNA in vivo specifico per i tessuti utilizzando un sistema CasRx a tre componenti.
Sono stati progettati RNA guida (gRNA) che prendono di mira diversi geni bersaglio sotto il controllo di un promotore ubiquitario e sono state generate linee di volo che esprimono questi costrutti contenenti gRNA. Sono stati progettati anche costrutti CasRx sotto il controllo di un promotore ubiquitario o di un promotore UASt (Conditional Upstream Activation Sequence) attivabile dal fattore di trascrizione GAL4 e sono state generate linee di volo che ospitano questi costrutti contenenti CasRx. I costrutti CasRx cataliticamente inattivi, dCasRx, sono stati progettati e utilizzati come controlli negativi. Il targeting dell'RNA onnipresente nelle mosche si ottiene incrociando le linee di mosca che esprimono gRNA con le linee di mosca che esprimono ubiquitariamente CasRx. La progenie che esprime sia il costrutto gRNA che prende di mira un trascritto genico specifico che la proteina CasRx ha una riduzione ubiquitaria dei trascritti genici mirati. Il targeting dell'RNA tessuto-specifico nelle mosche si ottiene incrociando prima le mosche che esprimono gRNA con le mosche che esprimono UASt-CasRx, ottenendo mosche transeterozigoti che trasportano sia gRNA che costrutti UASt-CasRx. Tali mosche a loro volta sono incrociate con mosche che esprimono GAL4 specifiche del tessuto, con conseguente generazione di espressione CasRx tessuto-specifica e targeting dell'RNA nelle mosche.
La natura programmabile del sistema CasRx offre la possibilità di personalizzazione e ottimizzazione per aiutare a raggiungere un'elevata efficacia e una bassa attività off-target per il targeting dell'RNA in vivo. Le potenziali applicazioni del targeting dell'RNA basato su CRISPR sono numerose, tra cui la sostituzione dell'RNAi in laboratorio e il contributo al controllo degli insetti vettori in natura. Di questi ultimi, uno dei bisogni globali insoddisfatti è lo sviluppo di strumenti efficienti per combattere le infezioni da virus a RNA trasmessi attraverso le zanzare. Molti virus a RNA, come la dengue, zika e il virus chikungunya, vengono trasmessi attraverso le zanzare, influenzando la salute umana e contribuendo alla mortalità. Sono state avanzate molte proposte per l'ingegneria delle popolazioni di zanzare con resistenza ai virus per la prevenzione delle malattie; tuttavia, nessuna tecnologia attuale è in grado di rendere le zanzare contemporaneamente resistenti a tutti i virus a RNA significativi18,19,20,21,22,23. I sistemi Cas di targeting dell'RNA possono fornire un punto di partenza per tale tecnologia abilitando una piattaforma programmabile per il targeting di tutti i virus a RNA trasmessi dalle zanzare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100% Grape Juice</td>
			<td>Welch Foods Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Active Dry Yeast (908g)</td>
			<td>Red Star Yeast Company, LLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMC4500 color camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>DMC4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual-Luciferase Reporter Assay System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E1910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAL4-GMR flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>29967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAL4-y flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>44373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glomax 20/20 Luminometer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E5331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq2500 Sequencer</td>
			<td>Illumina, Inc.</td>
			<td>HiSeq2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M165FC fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop OneC UV-vis spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>NDONEC-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit</td>
			<td>New England Biolabs, Inc.</td>
			<td>E7770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 112686</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 112688</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112688</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132416</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132417</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132419</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132419</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132420</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132421</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132422</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132425</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 132426</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 133304</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>133304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid # 164586</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>164586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid #132418</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>132418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasmid pJFRC81</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>36432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases AscI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0558L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases NotI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0189L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases PacI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0547L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases PstI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0140L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases SwaI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0604L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction endonucleases XbaI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td>R0145L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA 6000 Pico Kit for Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turbo DNase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM2238</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-Fluc flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-GFP; OpIE2-GFP flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-N flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-w flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U6-3:4-gRNA-y flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UASt-CasRx flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UASt-dCasRx flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiq-CasRx flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiq-dCasRx flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiq-Firefly-T2A-eGFP-Ubiq-Renilla flies</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>84127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoclean Gel DNA Recovery Kits</td>
			<td>Zymo Research Corporation</td>
			<td>D4007</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ubiquitous and tissue-specific rna targeting in drosophila melanogaster using crispr/casrx

CasRx, un membro della famiglia Cas13 mirata all'RNA, è una nuova promettente aggiunta delle tecnologie CRISPR / Cas in un'efficiente riduzione del trascritto genico con un attraente profilo off-target sia a livello cellulare che di organismo. È stato recentemente riportato che il sistema CRISPR / CasRx può essere utilizzato per ottenere una riduzione del trascritto genico ubiquitario e specifico del tessuto in Drosophila melanogaster. Questo documento descrive in dettaglio i metodi del recente lavoro, composto da tre parti: 1) ubiquitous in vivo endogenous RNA targeting utilizzando un sistema CasRx bicomponente; 2) targeting RNA esogeno ubiquitario in vivo utilizzando un sistema CasRx a tre componenti; e 3) targeting dell'RNA in vivo specifico per tessuto utilizzando un sistema CasRx a tre componenti. Gli effetti del targeting dell'RNA osservati includono cambiamenti fenotipici specifici del gene mirato, riduzione mirata del trascritto dell'RNA e fenotipi occasionali di letalità associati all'alta espressione della proteina CasRx e all'attività collaterale. Nel complesso, questi risultati hanno mostrato che il sistema CasRx è in grado di indirizzare la riduzione del trascritto dell'RNA a livello dell'organismo in modo programmabile ed efficiente, dimostrando che il targeting del trascrittoma in vivo e l'ingegneria sono fattibili e gettano le basi per le future tecnologie di targeting dell'RNA in vivo basate su CRISPR.

Targeting RNA ubiquitario in vivo utilizzando un sistema CasRx a due componenti Le mosche transeterozigoti F1 che esprimono sia i costrutti Ubiq-CasRx che gRNA (mirati sia ai geni endogeni che esogeni) hanno mostrato fenotipi marcati rispetto alle mosche di controllo che esprimono i costrutti Ubiq-dCasRx e gRNA (Figura 2 e Figura 4). In particolare, le mosche transeterozigoti CasRx hanno livelli significativamente più bassi di tasso di sopravvivenza rispetto alle mosche transeterozgye dCasRx, indicando tossicità del sistema Ubiq-CasRx (Figura 2A e Figura 4A). Vale la pena notare che entrambe le mosche transeterozigoti CasRx e dCasRx hanno un tasso di ereditarietà inferiore al 50%, che è il rapporto atteso basato sulla genetica mendeliana. Dei tre geni bersaglio, l'Ubiq-CasRx/+; U6-gRNAN/+ mosche e Ubiq-CasRx/+; Le mosche U6-gRNAy/+ non sono vitali (ereditarietà dello 0%) e non sono cresciute oltre il secondo stadio di larve instar (Figura 2A-2B). L'Ubiq-CasRx/+sopravvissuto; Le mosche U6-gRNAw/+, la cui ereditarietà era del 12,9%, hanno mostrato un fenotipo distinto dagli occhi bianchi completamente penetrante (Figura 2B). Oltre ai tratti osservabili associati a CasRx, siamo stati in grado di confermare una significativa riduzione dei trascritti genici bersaglio per 3 geni bersaglio: Notch, giallo e GFP (Figura 2E-2G). La riduzione dei trascritti del gene bianco è stata osservata nelle mosche Ubiq-CasRx/+, U6-gRNAw/+, rispetto alle mosche Ubiq-dCasRx/+, U6-gRNAw/+, di controllo, sebbene la riduzione non fosse statisticamente significativa (Figura 2E - 2F). Prove di attività off-target indotte da CasRx sono state trovate confrontando i trascritti differenzialmente espressi tra campioni di mosche che esprimono CasRx e campioni di mosche che esprimono dCasRx (Figura 2E, 2G). Il numero di trascrizioni non target significativamente espresse in modo differenziato è il seguente: bianco, 253 (1,4% delle trascrizioni totali); Notch, 300 (1,7%); giallo, 41 (0,23%); GFP, 5.880 (33%) (Figura2G). Del totale di 17.779 trascrizioni diverse, 6 trascrizioni non target sono state significativamente espresse in modo differenziato in tutti e 4 i gruppi di campioni. Uno dei 6 trascritti identificati è stato Gadd45, un gene coinvolto nell'apoptosi e nell'arresto cellulare nelle mosche, sollevando la possibilità che l'azione enzimatica di CasRx possa innescare direttamente l'apoptosi cellulare o innescare indirettamente un'errata espressione di altri geni, che a sua volta porta all'apoptosi. Infine, vale la pena notare che le mosche Ubiq-CasRx e Ubiq-dCasRx non sono state stabilite come stock omozigoti, presumibilmente a causa della tossicità conferita da un'elevata espressione ubiquitaria. Di conseguenza, le mosche eterozigoti Ubiq-CasRx/CyO e Ubiq-dCasRx/CyO sono state utilizzate per l'incrocio con linee di mosca gRNA omozigoti. In sintesi, il sistema Ubiq-CasRx a due componenti è in grado di raggiungere il targeting rna ubiquitario sia per bersagli endogeni che esogeni con conseguente fenotipi osservabili e riduzione del trascritto. Questi risultati hanno anche mostrato che il targeting dell'RNA mediato da CasRx può introdurre tossicità in vivo.
Targeting dell'RNA esogeno ubiquitario in vivo utilizzando un sistema CasRx a tre componenti I risultati della croce in due fasi hanno mostrato che, nonostante la natura esogena del gene bersaglio (cioè Fluc), l'espressione di tutti e tre i transgeni nei tripli transeterozigoti F2 (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) ha determinato una letalità del 100% rispetto agli incroci di controllo che coinvolgono Ubiq-dCasRx, dove non è stata osservata letalità nei tripli transeterozigoti F2 (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) (Figura 3B-C ). Più specificamente, solo la combinazione di tutti e tre i transgeni (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) ha determinato una letalità del 100% (Figura 3B e D), mentre (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/TM6) e (Ubiq-CasRx/+; I genotipi Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6) erano vitali e mancavano di fenotipi con i loro tassi di ereditarietà corrispondenti ai tassi di trasmissione mendeliani attesi, suggerendo che la disponibilità della sequenza bersaglio (cioè la lucciola luciferasi) in combinazione con Ubiq-CasRx/+ e gRNAFluc è ciò che ha portato ai fenotipi di letalità osservati, presumibilmente derivanti dall'attività collaterale degli enzimi Cas132,8 . Inoltre, nessun fenotipo distinguibile o influenza drammatica sull'ereditarietà nei transeterozigoti F1 (Ubiq-CasRx/+; gRNAFluc/+ o Ubiq-CasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) sono stati osservati rispetto ai controlli Ubiq-dCasRx (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/+ o Ubiq-dCasRx/+; Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/+) (Figura 3B), che indica che un enzima cataliticamente attivo è essenziale per ottenere i fenotipi di letalità osservati. Inoltre, i livelli di espressione di Fluc e Rluc nelle mosche di tutti i genotipi vitali non hanno mostrato una riduzione significativa dell'espressione di Fluc nei tripli transeterozigoti Ubiq-dCasRx (Ubiq-dCasRx/+; gRNAFluc/Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc) rispetto ai controlli reporter dual luciferase. Ciò suggerisce che i livelli di espressione della proteina Fluc non sono stati ridotti dal targeting dCasRx (Figura 3D). Nel loro insieme, il fenotipo di letalità comune nei due diversi esperimenti di targeting dell'RNA ubiquitario mediato da CasRx indica che se usato sui tessuti in modo ubiquitario, il targeting dell'RNA mediato da CasRx può essere tossico per l'organismo.
Targeting dell'RNA in vivo specifico per tessuto utilizzando un sistema CasRx a tre componenti L'alto livello di tossicità osservato negli esperimenti di targeting dell'RNA ubiquitario ci ha spinto a esplorare il targeting dell'RNA specifico del tessuto utilizzando un progetto di sistema CasRx a tre componenti dettagliato nella sezione dei metodi. In effetti, il livello di tossicità osservato è stato ridotto quando l'espressione complessiva di CasRx è stata abbassata utilizzando il promotore UASt rispetto a quello del promotore Ubiq, questo è esemplificato in tre aspetti: 1) le linee UASt-CasRx e UASt-dCasRx sono state mantenute come linee omozigoti, anche se sulla base dello schema incrociato a due fasi sono state utilizzate linee UASt-CasRx e UASt-dCasRx a doppio bilanciamento per eseguire le croci, 2) tutti i tassi di ereditarietà tripla transeterozigote dCasRx di generazione F2 corrispondevano al tasso di ereditarietà mendeliana previsto del 25% e 3) il fenotipo di letalità transeterozigote casRx tripla generazione F2 era moderatamente ridotto. Nell'esperimento di targeting bianco, dei tassi di ereditarietà mendeliana del 25% attesi nei tripli transeterozigoti F2, sono state osservate solo lo 0,57% di mosche adulte vitali (UASt-CasRx/+; gRNAw/GMR-Gal4), che mostravano tutti gravi fenotipi di pigmentazione e morfologia specifici per gli occhi (Figura 4A e 4B). Per la croce di targeting bianco, il tasso di ereditarietà di F2 triplo transeterozigote che esprime CasRx era significativamente inferiore a quello del gruppo di controllo triplo transeterozigote che esprime dCasRx (27,6%) (Figura 4A). Nell'esperimento di targeting di Notch, il triplo tranheterozigote che esprime CasRx che trasportava tutti e tre i transgeni era letale al 100%, mentre il tasso di ereditarietà del controllo dCasRx era del 29,3% (Figura 4A). Nell'esperimento di targeting giallo, F2 tripla transeterozigote Che esprime CasRx, gRNAy e y-GAL4 hanno mostrato una riduzione marginale del pigmento di chitina come piccole macchie di cuticola gialla sul torace e sull'addome con un tasso di ereditarietà del 2,67%, molto inferiore a quello del gruppo di controllo dCasRx (25,2%) (Figura 4A). ). Tutte le mosche transeterozigoti di controllo dCasRx non presentavano fenotipi evidenti come le mosche che esprimono CasRx, indicando che l'attività catalitica di CasRx ha contribuito ai fenotipi osservati. Il basso tasso di ereditarietà nel gruppo casRx triplo transeterozigote ha suggerito che esistono due fonti di tossicità nel targeting dell'RNA CasRx: una è associata ad un'alta espressione di CasRx, la cui tossicità è stata ridotta dall'espressione restrittiva di CasRx, l'altra è associata all'attività collaterale. Nel loro insieme, questi risultati hanno dimostrato che il sistema CasRx può raggiungere il targeting dell'RNA in vivo specifico per i tessuti sfruttando il classico sistema Gal4 / UASt e nel frattempo ridurre la tossicità. Tuttavia, i fenotipi di tossicità e letalità occasionale sono stati ancora osservati a un livello di gravità inferiore rispetto a quello degli approcci ubiquitari, indicando che l'attività di scissione collaterale è associata a tossicità.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica generale del targeting dell'RNA utilizzando un sistema Cas13D. (A) Schemi della croce genetica in un solo passaggio nel targeting rna ubiquitario in vivo utilizzando un sistema CasRx a due componenti. (B) Schemi di una croce genetica in due fasi nel targeting rna esogeno ubiquitario in vivo utilizzando il sistema CasRx a tre componenti. (C) Schemi di una croce genetica in due fasi nel targeting dell'RNA in vivo specifico del tessuto utilizzando un sistema CasRx a tre componenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig02.jpg"> Figura 2: Targeting dell'RNA in vivo onnipresente utilizzando un sistema CasRx a due componenti (ristampato5). (A) Percentuali di ereditarietà totale di mosche transeterozigoti che ereditano Ubiq-CasRx (o Ubiq-dCasRx) e gRNA. L'ombreggiatura blu nel riquadro indica la penetranza del fenotipo. (B) Fenotipi delle mosche transeterozigoti. Le frecce indicano la necrosi tissutale nell'occhio. La mosca in bianco e nero contrassegnata con ''X'' rappresenta la letalità. (C) Percentuali di ereditarietà totale delle mosche transeterozigoti di incroci bidirezionali tra mosche Ubiq-CasRx (o Ubiq-dCasRx) e gRNAGFP-OpIE2-GFP. M, eredità materna di CasRx; P, eredità paterna di CasRx. (D) Le larve F1 progenie nella croce paterna. (E) Stime a posteriori massime delle trascrizioni per la variazione della piega logaritmica. È stata utilizzata la pipeline DESeq2. (F) Trascrizioni per milione (TPM) mirate con CasRx o dCasRx. (G) CasRx-depentent percentuale di trascrizione differenzialmente espressa delle trascrizioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig03.jpg"> Figura 3: Targeting dell'RNA esogeno ubiquitario in vivo utilizzando un sistema CasRx a tre componenti. (A) Schemi della croce genetica in due fasi. (B) Percentuali di ereditarietà totale per tutti i genotipi emergenti nella generazione F2 . L'ereditarietà di tutti e tre i transgeni (Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc e gRNAFLuc) nella progenie F2 ha determinato una letalità del 100% ed è stata significativamente inferiore rispetto al gruppo di controllo dei tre transeterozigoti Ubiq-dCasRx (p = 0,001, t-test). (C) Il trasporto di Ubiq-CasRx/gRNAFluc da solo o Ubiq-CasRx e Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc da solo non ha portato a grave letalità e i rapporti di ereditarietà tra i transeterozigoti Ubiq-CasRx e Ubiq-dCasRx non erano significativamente diversi (p = 0,41 e p = 0,51, rispettivamente, t-test). (D) Rapporti di luciferasi che normalizzano le letture fluc alle letture Rluc. Le mosche triplo transeterozigoti che esprimono Ubiq-CasRx, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc, gRNAFLuc erano letali embrionali, che erano rappresentate da una mosca con una "X", e di conseguenza l'espressione della luciferasi non è stata misurata. Il rapporto Fluc/Rluc dei transeterozigoti Ubiq-CasRx/+, Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc/TM6, Stb era significativamente inferiore a quello degli altri gruppi che esprimono Ubiq-Fluc-Ubiq-Rluc (p = 1,2e-06 o inferiore, t-test). I risultati del gruppo solo gRNAFLuc erano significativamente inferiori a quelli di tutti gli altri gruppi (p = 1,2e-06 o inferiore, t-test). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62154/62154fig04.jpg"> Figura 4: Targeting dell'RNA in vivo specifico per tessuto utilizzando un sistema CasRx a tre componenti (ristampato5). (A) Percentuale di ereditarietà totale di mosche triplo transeterozigote che trasportano tre transgeni (UASt-CasRx o UASt-dCasRx, gRNA e Gal4-driver. (B) Fenotipi delle mosche tripli transeterozigoti. La freccia bianca indica la riduzione del pigmento di chitina nel torace. La mosca in bianco e nero contrassegnata con ''X'' rappresenta la letalità. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62154/62154fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Costruire</td>
			<td>Descrizione</td>
			<td>Abbecedario</td>
			<td>Sequenza di primer (da 5' a 3')</td>
			<td>Modello PCR</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">OA-1050E ·</td>
			<td rowspan="2">CasRx ·</td>
			<td>1050E. C3 ·</td>
			<td>TACTAATTTTCCAC ATCTCTATTTTGAC CCGCAGATTAATTA ATGAGCCCCAAGA AGAA ·</td>
			<td rowspan="2">pNLS-RfxCas13d-NLS-HA (pCasRx)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4 ·</td>
			<td>CAATTGATTTGTTA TTTTAAAAACGATT CATTCTAGCTAGCT TAAGCGTAATCTGG AACA ·</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">OA-1050R ·</td>
			<td rowspan="2">dCasRx</td>
			<td>1050E. C3 ·</td>
			<td>TACTAATTTTCCAC ATCTCTATTTTGAC CCGCAGATTAATTA ATGAGCCCCAAGA AGAA ·</td>
			<td rowspan="2">pNLS-dRfxCas13d-NLS-HA (pdCasRx)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4 ·</td>
			<td>CAATTGATTTGTTA TTTTAAAAACGATT CATTCTAGCTAGCT TAAGCGTAATCTG GAACA ·</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">OA-1050L ·</td>
			<td rowspan="2">Promotore UASt</td>
			<td>1041,C9</td>
			<td>GCGGGTTCTCGA CGGTCACGGCGG GCATGTCGACGC GGCCGCAACCAA CAACACTAGTAGTAG</td>
			<td rowspan="2">pJFRC81</td>
		</tr>
<tr>
<td>1041,C11</td>
			<td>CTGGCCTCCACC TTTCTCTTCTTCT TGGGGCTCATGT TTAAACCCAATT CCCTATTCAGA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">CasRx ·</td>
			<td>1050L. C1 ·</td>
			<td>AATACAAGAAGA GAACTCTGAATA GGGAATTGGGT TTAAACATGAGC CCCAAGAAGAA</td>
			<td rowspan="2">pCasRx</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4 ·</td>
			<td>CAATTGATTTGT TATTTTAAAAAC GATTCATTCTA GCTAGCTTAAG CGTAATCTGGA ACA ·</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">OA-1050S</td>
			<td rowspan="2">Promotore UASt</td>
			<td>1041,C9</td>
			<td>GCGGGTTCTC GACGGTCACG GCGGGCATGT CGACGCGGCC GCAACCAACAA CACTAGTAG</td>
			<td rowspan="2">pJFRC81</td>
		</tr>
<tr>
<td>1041,C11</td>
			<td>CTGGCCTCCA CCTTTCTCTTC TTCTTGGGGCT CATGTTTAAAC CCAATTCCCTA TTCAGA ·</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">dCasRx</td>
			<td>1050L. C1 ·</td>
			<td>AATACAAGAAG AGAACTCTGAAT AGGGAATTGGG TTTAAACATGAG CCCCAAGAAGAA</td>
			<td rowspan="2">pdCasRx</td>
		</tr>
<tr>
<td>1050E. C4 ·</td>
			<td>CAATTGATTTGT TATTTTAAAAAC GATTCATTCTAG CTAGCTTAAGCG TAATCTGGAACA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">OA-1043 ·</td>
			<td rowspan="2">Promotore U6:3</td>
			<td>1043,C1</td>
			<td>GGGAATTGGGA ATTGGGCAATAT TTAAATGGCGGC GCGCCGAATTCT TTTTTGCTCACCT</td>
			<td rowspan="2">Plasmide addgenico #164586</td>
		</tr>
<tr>
<td>1043,C23</td>
			<td>ACACTAGTGGAT CTCTAGAGGTAC CGTTGCGGCCG CAAAAAAGTTGT AATAGCCCCTCA AAACTGGACCTT CCACAACTGCAG CCGACGTTAAAT TGAAA ·</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">OA-1052B ·</td>
			<td rowspan="2">Promotore Ubiq</td>
			<td>1052B. C1 ·</td>
			<td>GGGAATTGGGCA ATATTTAAATGGC GGCTGCAGCGC GCAGATCGCCGAT</td>
			<td rowspan="2">Plasmide addgenico #112686</td>
		</tr>
<tr>
<td>1052B. C2 ·</td>
			<td>TTTCTTTATGTTT TTGGCGTCTTCC ATCCTAGGTCTG CGGGTCAAAATA GAGATG ·</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">T2A-eGFP</td>
			<td>908A1 ·</td>
			<td>ATAAAGGCCAAG AAGGGCGGAAA GATCGCCGTGG AGGGCAGAGGA AGTCTTCTAACAT GC</td>
			<td rowspan="2">Plasmide addgenico #112686</td>
		</tr>
<tr>
<td>908A2 ·</td>
			<td>TTGTTATTTTAAAA ACGATTCATTCTA GGCGATCGCTTA CTTGTACAGCTC GTCCATGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Promotore Ubiq invertito</td>
			<td>908A3 ·</td>
			<td>ACCGTGACCTAC ATCGTCGACACTA GTGGATCTCTAGA CGCGCAGATCGC CGATG ·</td>
			<td rowspan="2">Plasmide addgenico #112686</td>
		</tr>
<tr>
<td>908A4 ·</td>
			<td>GGATCATAAACTT TCGAAGTCATGC GGCCGCTCTGCG GGTCAAAATAGAG ATGT ·</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Elenco dei costrutti molecolari e dei primer utilizzati in questo studio. Questo elenco include tutti i costrutti (sia l'ID che la descrizione) e le primer associate a ciascun costrutto (sia l'ID che le sequenze (da 5' a 3')) e i modelli utilizzati.

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Ubiquitous and Tissue-specific RNA Targeting in Drosophila Melanogaster using CRISPR/CasRx

Questo articolo delinea un protocollo dettagliato per l'utilizzo dell'enzima Cas13D mirato all'RNA (RfxCas13D) nelle mosche.

Targeting dell'RNA ubiquo e tessuto-specifico in Drosophila Melanogaster con CRISPR/CasRx

CasRx, a member of the RNA-targeting Cas13 family, is a promising new addition of the CRISPR/Cas technologies in efficient gene transcript reduction with ...

Come mostra il nostro protocollo, le tecnologie CRISPR CasRx possono essere utilizzate per ottenere riduzioni del trascritto genico ubiquitario e specifico del tessuto nei moscerini della frutta. La nostra tecnica offre un pacchetto iniziale per chiunque sia interessato a utilizzare la riduzione del trascritto genetico basata su CRISPR nei moscerini della frutta, pur essendo compatibile con ulteriori personalizzazioni e ottimizzazioni. Per impostare un targeting RNA in vivo onnipresente utilizzando un sistema CasRx a due componenti, raccogliere 10 mosche femmine adulte vergini dalla linea di interesse omozigote gRNA e cinque mosche maschi adulte dall'eterozigote bilanciato Ubiq CasRx CurlyO.Posizionare le mosche parentali in una fiala integrata con 100 microgrammi di lievito secco in polvere e allevare le fiale per 48 ore a 26 gradi Celsius. Osserva le fiale ogni giorno per vedere se qualche nuova progenie adulta è emersa dal pubico della generazione F1 e anestetizzare uno qualsiasi degli adulti con anidride carbonica per 10 secondi. Una volta che le mosche diventano immobili svuota la fiala su un fly pad collegato al serbatoio di anidride carbonica con anidride carbonica continua e usa una telecamera a colori collegata a uno stereomicroscopio fluorescente per segnare e visualizzare i fenotipi delle mosche.Quindi contare i numeri di progenie con fenotipi diversi, in base all'espressione del segnale fluorescente. Sulla base della genetica mendeliana, ci si aspetta che il 50% della progenie esprima l'RNA mirato. Si noti che la tossicità del sistema Ubiq CasRx può ridurre il rapporto tra l'RNA mirato che esprime progenie a meno del 50% Per impostare un targeting RNA esogeno ubiquitario in vivo utilizzando un sistema CasRx a tre componenti, raccogliere da otto a 10 mosche femmine adulte vergini da una doppia linea di espressione luciferasi e da quattro a cinque mosche maschi adulti dal bilanciato eterozigote Ubiq CasRx Curly più TM6, Linea STB che mostra contemporaneamente occhi bianchi, ali ricci e fluorescenza rossa ds.Posizionare il passaggio parentale un cross-by in una fiala integrata con 100 microgrammi di polvere di lievito secco e sollevare questa croce per 48 ore a 26 gradi Celsius. Alla fine dell'incubazione, rimuovere tutte le mosche parentali da ciascuna fiala e riportare le fiale all'incubatrice a 26 gradi Celsius per almeno 14 giorni. Nel corso di 14 giorni, come accennato in precedenza, raccogliere da otto a 10 vergini femmine dalla lucciola omozigote luciferasi che prende di mira la linea gRNA tre volte.Osserva le fiale incrociate ogni giorno per vedere se dalle pupe sono emerse nuove progenie adulte, anestetizzando con anidride carbonica per consentire la raccolta di quattro o cinque mosche maschio che esprimono sia l'Ubiq CasRx che il doppio reporter Luciferasi come disponibile. Metti le mosche in una nuova fiala con 10 femmine vergini dalla luciferasi del moscerino della frutta che prende di mira la linea del gRNA e posiziona queste croci di fase due a 26 gradi Celsius per 48 ore. Raccogli altri cinque maschi di un giorno che esprimono sia l'Ubiq CasRx che la doppia luciferasi reporter dalle fiale incrociate del passo uno e incuba le mosche per due o quattro giorni da solo a 26 gradi Celsius prima di trasferirle in una centrifuga da 1,5 millilitri per meno 80 gradi Celsius di conservazione.Al termine dell'incubazione, rimuovere tutte le fiale parentali da ciascuna delle due fiale incrociate. E riportare le fiale all'incubatrice a 26 gradi Celsius per almeno 20 giorni. Osserva le fiale incrociate del passaggio due ogni giorno per vedere se qualche nuova progenie adulta è emersa dal pubico, anestetizzando le mosche con anidride carbonica man mano che diventano disponibili e segnando e visualizzando i loro fenotipi come dimostrato.La genetica mendeliana suggerisce che, se tutte le mosche sono vitali, il 25% della progenie dovrebbe esprimere l'RNA mirato. Per eseguire un test di luciferasi, generare le mosche triplo trans eterozigoti e le mosche di controllo come dimostrato. Raccogliere le mosche maschili alla nascita e invecchiarle fino a tre giorni.Trasferire le mosche di tre giorni in tubi di centrifuga da 1,5 millilitri e lisarle utilizzando un tampone nel tampone di lisi della luciferasi da un kit di analisi della luciferasi disponibile in commercio. Quindi utilizzare cinque microlitri di tessuto lisato da ciascun campione e luminometro per misurare sia i moscerini della frutta che l'attività della luciferasi eseguita, secondo i protocolli standard di dosaggio della luciferasi. F1, CasRx trans eterozigote, hanno tassi di sopravvivenza significativamente più bassi rispetto alle mosche dCasRx trans eterozigoti.Confermando la tossicità del sistema Ubiq CasRx dei tre geni bersaglio, le mosche eterozigoti U6 gRNA Y non sono vitali e non crescono oltre il secondo stadio larvale instar. Le mosche eterozigoti Ubq CasRx e U6 gRNA W sopravvissute, dimostrano un fenotipo distinto completamente penetrante dagli occhi larghi. Inoltre, si osserva anche una significativa riduzione dei trascritti del gene bersaglio per tre geni bersaglio.L'evidenza di attività fuori bersaglio indotta da CasRx si osserva anche quando vengono confrontati i trascritti differenziali espressi tra i campioni di mosche che esprimono CasRx e campioni di mosche che esprimono dCasRx. Nella croce a due fasi, solo la combinazione di tutti e tre i geni trans si traduce in una letalità al 100%. Quando viene utilizzato il targeting dell'RNA specifico del tessuto utilizzando un design del sistema CasRx a tre componenti, il livello di tossicità viene ridotto quando l'espressione complessiva di CasRx viene abbassata utilizzando il promotore UAST rispetto a quello del promotore Ubiq.È importante impostare correttamente il processo genetico utilizzando mosche di sesso corretto e fenotipi corretti.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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