Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'interazione virus-host su come stabilire efficacemente un'infezione virale in Drosophila melanogaster. Questo metodo di nanoiniezione consente un controllo preciso della dose di infezione del virus e può essere facilmente applicato alle infezioni con altri agenti patogeni microbici. Inizia coltivando uno per 10 alla settima cella stellare S2 praticabile per millilitro come monostrato sciolto e semi-aderente in un piatto di coltura cellulare di 10 centimetri con 10 millilitri di Drosophila Medium completo di Schneider senza anidride carbonica aggiuntiva a 25 gradi Celsius per un'ora.
Durante l'incubazione, resuspend appena scongelato Drosophila C Virus o DCV a una molteplicità di infezione di 0,01 in un millilitro di mezzo completo e aggiungere soluzione virale ai piatti di coltura cellulare. Quindi riportare il piatto all'incubatore di 25 gradi Celsius per tre o cinque giorni. Il virus è pronto per la raccolta quando la morfologia cellulare sembra sfocata e il mezzo di coltura è pieno di particelle nere indicative di detriti cellulari.
Mescolare il supernatante pipettando alcune volte prima di trasferire l'intera coltura cellulare in un tubo da 15 millilitri per la lisi delle cellule ospiti a meno 80 gradi Celsius. Per generare concentrazioni di lavoro del virus, scongelare la sospensione cellulare in un bagno d'acqua di 25 gradi Celsius con scuotimenti costanti prima di pellettare i detriti cellulari per centrifugazione. Quindi trasferire il supernatante in un nuovo tubo sterile da 15 millilitri per vortice e aliquote fino a 200 microlitri di soluzione virale per tubo.
Per determinare la dose infettiva media di coltura del tessuto virale, primo seme uno per 10 alle cinque cellule stellari S2 in 100 microlitri di mezzo completo in otto pozzi per colonna in 12 file di una piastra di pozzo 96. Quindi riportare la piastra all'incubatore di 25 gradi Celsius. Selezionare casualmente cinque tubi di virus da meno 80 gradi Celsius di stoccaggio.
Mentre le cellule si stanno depositando, riempire 10 tubi sterili a microcentrifugo da 1,5 millilitri con 450 microlitri di mezzo sterile completo e aggiungere 50 microlitri di materiale virale al primo tubo da 1,5 millilitri contenente 450 microlitri di mezzo sterile completo diluendo le sospensioni di 10 volte per passo al 12 ° pozzo. Al termine dell'incubazione, aggiungere 50 microlitri di ogni diluizione al pozzo appropriato in ogni colonna per quel tubo di virus e aggiungere 50 microlitri di mezzo di coltura senza virus a un pozzo per colonna come pozzo di controllo negativo. Quindi posizionare la piastra nell'incubatore di 25 gradi Celsius per tre giorni e valutare l'effetto citopatico di ogni stock di virus sotto un microscopio Brightfield con un ingrandimento 20 volte al giorno.
Classificare un pozzo in cui le cellule sembrano sfocate e il mezzo è pieno di frammenti come un pozzo positivo e un pozzo in cui la morfologia cellulare è normale come pozzo negativo. Prima dell'allevamento, mescolare accuratamente 400 microlitri di 50 microgrammi per millilitro di Tetraciclina con quattro grammi di cibo fresco standard a mosca di farina di mais e posizionare il cibo a quattro gradi Celsius durante la notte per evaporare l'etanolo. La mattina seguente, riscaldare il cibo a temperatura ambiente e posizionare il cibo e 20 mosche adulte femmine e 10 maschi appena racchiuse in una fiala riproduttiva per un'incubazione riproduttiva di tre o quattro giorni a 25 gradi Celsius e 60% di umidità sotto un normale ciclo chiaro / scuro.
Quando sono state deposte abbastanza uova, raccogli le mosche adulte appena echiuse sotto un leggero flusso di anidride carbonica e alleva di nuovo la Drosophila altre due volte come appena dimostrato. Dopo tre generazioni di trattamento tetraciclina, raccogli cinque mosche sotto un leggero flusso di anidride carbonica e omogeneizza le mosche con 250 microlitri di acqua distillata doppia e alcune perle in ceramica sterile da 0,5 millimetri. Dopo un minuto, aggiungere 250 microlitri di 2X Buffer A al campione per il vortice prima di congelare i campioni a meno 80 gradi Celsius.
Successivamente, scongelare rapidamente i campioni da meno 80 gradi Celsius in un bagno d'acqua di 25 gradi Celsius, seguito da un'incubazione di 30 minuti in un bagno d'acqua di 70 gradi Celsius prima di estrarre il DNA genomico e amplificare il DNA con la reazione a catena della polimerasi secondo protocolli standard. Confermare l'assenza di Wolbachia 16 piccolo RNA e wsp in ogni mosca omogeneato da elettroforesi gel secondo protocolli standard. Quindi alleva il fly stock senza Wolbachia sul cibo di mosca di farina di mais standard come dimostrato.
Per l'infezione virale, utilizzare prima uno stereomicroscopio e pini sottili per rompere la punta di un ago capillare di vetro al diametro appropriato per la nanoiniezione. Per assemblare l'iniettore, posizionare l'O-ring del soffitto e un distanziale bianco sul pistone metallico dell'iniettore con la grande fossette rivolta verso l'esterno. Utilizzare una siringa dotata di un ago calibro 30 per riempire l'ago di vetro con olio minerale e posizionare l'ago attraverso il colletto.
Posizionare l'O-ring più grande intorno alla base del collare a circa un millimetro dall'estremità smussata dell'ago e montare l'ago sullo stantuffo dell'iniettore. Fissare l'ago sullo stantuffo e premere il pulsante vuoto per estendere lo stantuffo del microiniettore fino a quando non viene sentito un segnale acustico. Ora premere fill per ritrarre lo stantuffo di cinque millimetri e immergere l'ago in una sospensione virale dell'unità di formatura della placca da 100 placche.
Agitare delicatamente una o almeno tre fiale di 20 Drosophila maschio senza Wolbachia sul piatto di iniezione. Le mosche dotate di maschio sono preferite durante l'accoppiamento e la riproduzione può influenzare le femmine. Quindi iniettare il torace di ogni mosca con 50,6 nanolitri di soluzione virale nella regione di colore leggermente più chiaro tra il mesopleura e lo pteropleura e misurare il carico DCV per saggio di effetto citopatico e RT PCR quantitativo dalle mosche terrestri come appena dimostrato.
Dopo l'iniezione, trasferire accuratamente le mosche in una fiala fresca e posizionare il flaconcino in posizione orizzontale per evitare che le mosche si attacchino al mezzo mentre si riprendono dall'anestesia. L'iniezione richiede molto tempo, ma la replicazione DCV è molto rapida, quindi è molto importante annotare l'ora esatta sul tubo una volta che tutte le mosche di ogni fiala sono state iniettate. L'infezione da virus può indurre llisi cellulare ed effetti citopatici si osservano a tre giorni dopo l'infezione.
Wolbachia 16s rRNA e wsp primer possono essere usati per rilevare la presenza di Wolbachia e Drosophila come dimostrato. Le mosche senza Wolbachia mostrano un tasso di sopravvivenza significativamente diminuito dopo l'infezione da DCV e in modo dipendente dalla dose. Dcv attiva percorsi di segnalazione antivirale nell'ospite che sono fondamentali per l'infezione antivirale in Drosophila come evidenziato dalla diminuzione del tasso di sopravvivenza e dall'aumento della carica virale nelle mosche mutanti Dicer-2.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la contaminazione con il genotipo wolbachia può influenzare la suscettibilità della Drosophila melanogaster vola all'infezione DCV. Seguendo questa procedura, altri metodi come uno schermo genetico su larga scala possono essere eseguiti al fine di rispondere a domande aggiuntive sui geni ospiti sotto definiti necessari per l'infezione virale o le risposte antivirali. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo delle malattie virali umane per esplorare i meccanismi alla base dei focolai di infezioni virali umane endemiche nel modello drosophila melanogaster.
Non dimenticare che lavorare con il virus può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come indossare i dispositivi di protezione appropriati dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
