Name: fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy at JoVE.com

نود أن نشكر مولي س.C. غريفت على المناقشات المفيدة وموظفي مرفق ABSL للمساعدة في جمع البيانات cryo-EM. ديفيد ب. كليبل هو طالب دكتوراه في برنامج ويلكوم ترست للدكتوراه لمدة 4 سنوات في مركز أستبري بتمويل من جامعة ليدز. تم تمويل مجاهر FEI Titan Krios من قبل جامعة ليدز (جائزة UoL ABSL) و Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). تم تمويل هذا العمل من خلال منحة BBSRC لستيفن ب. موينش (BB/P026397/1) ودعمت بمنح بحثية لهوارد د. وايت من جمعية القلب الأمريكية (AMR21-236078) وهوارد د. وايت وفيتولد غالكين من المعاهد القومية للصحة الأمريكية (171261).

1. إعداد النظام
ملاحظة: يصف البروتوكول التالي كيفية تحضير شبكات نموذج واحد. عادة، يتم إعداد شبكات النسخ المتماثل 2 كحد أدنى لكل عينة أو شرط. لسرعات الهبوط الأسرع (أقل من ~ 20 مللي ثانية تأخير الوقت)، وعادة ما تكون على استعداد 3 أو 4 شبكات تكرار لحساب عدد أقل من مناطق الجليد رقيقة....

<ol>
	<li>Murphy, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotary+substates+of+mitochondrial+ATP+synthase+reveal+the+basis+of+flexible+F1-Fo+coupling.">Rotary substates of mitochondrial ATP synthase reveal the basis of flexible F1-Fo coupling.</a> Science. 364, (2019).</li><li>Benton, D. J., Gamblin, S. J., Rosenthal, P. B., Skehel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+transitions+in+influenza+haemagglutinin+at+membrane+fusion+pH.">Structural transitions in influenza haemagglutinin at membrane fusion pH.</a> Nature. , 1-4 (2020).</li><li>Dance, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motion+on+ice.">Molecular motion on ice.</a> Nature Methods. , 1-5 (2020).</li><li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it.">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> Elife. 8, 42747 (2019).</li><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM.">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nature Methods. 15, 793-795 (2018).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Need+for+speed:+Examining+protein+behaviour+during+cryoEM+grid+preparation+at+different+timescales.">Need for speed: Examining protein behaviour during cryoEM grid preparation at different timescales.</a> BioRxiv. , (2020).</li><li>Ravelli, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structures+from+sub-nl+volumes+using+pin-printing+and+jet+vitrification.">Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification.</a> Nature Communications. 11, 1-9 (2020).</li><li>Arnold, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting-free+and+lossless+cryo-electron+microscopy+grid+preparation+from+nanoliter-sized+protein+samples+and+single-cell+extracts.">Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts.</a> Journal of Structural Biology. 197, 220-226 (2017).</li><li>Razinkov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+vitrifying+samples+for+cryoEM.">A new method for vitrifying samples for cryoEM.</a> Journal of Structural Biology. 195, 190-198 (2016).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+and+effective+microfluidic+spraying-plunging+method+for+high-resolution+single-particle+cryo-EM.">A fast and effective microfluidic spraying-plunging method for high-resolution single-particle cryo-EM.</a> Structure. 25, 663-670 (2017).</li><li>Ashtiani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+femtolitre+droplets+using+surface+acoustic+wave+based+atomisation+for+cryo-EM+grid+preparation.">Delivery of femtolitre droplets using surface acoustic wave based atomisation for cryo-EM grid preparation.</a> Journal of Structural Biology. 203, 94-101 (2018).</li><li>Rubinstein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shake-it-off:+a+simple+ultrasonic+cryo-EM+specimen-preparation+device.">Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75, (2019).</li><li>M&#228;eots, M. -. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+microfluidics+enables+kinetic+insight+from+time-resolved+cryo-EM.">Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM.</a> Nature Communications. 11, 1-14 (2020).</li><li>Kontziampasis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-EM+grid+preparation+device+for+time-resolved+structural+studies.">A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies.</a> IUCrJ. 6, (2019).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+deposition+onto+cryo-EM+grids:+from+sprays+to+jets+and+back.">Sample deposition onto cryo-EM grids: from sprays to jets and back.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 76, (2020).</li><li>White, H., Thirumurugan, K., Walker, M., Trinick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+generation+apparatus+for+time-resolved+electron+cryo-microscopy+using+stepper+motors+and+electrospray.">A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray.</a> Journal of Structural Biology. 144, 246-252 (2003).</li><li>Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Complex Assembly. , 59-71 (2018).</li><li>Trebbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+liquid+jet+system+with+compatibility+for+atmospheric+and+high-vacuum+conditions.">Microfluidic liquid jet system with compatibility for atmospheric and high-vacuum conditions.</a> Lab on a Chip. 14, 1733-1745 (2014).</li><li>Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-grid+and+in-flow+mixing+for+time-resolved+Cryo-EM.">On-grid and in-flow mixing for time-resolved Cryo-EM.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2021).</li><li>He, S., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+reconstruction+in+RELION.">Helical reconstruction in RELION.</a> Journal of Structural Biology. 198, 163-176 (2017).</li><li>Millar, N. C., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limiting+rate+of+the+ATP-mediated+dissociation+of+actin+from+rabbit+skeletal+muscle+myosin+subfragment+1.">The limiting rate of the ATP-mediated dissociation of actin from rabbit skeletal muscle myosin subfragment 1.</a> FEBS Letters. 160, 141-148 (1983).</li><li>Kasas, S., Dumas, G., Dietler, G., Catsicas, S., Adrian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+cryoelectron+microscopy+specimens+revealed+by+high-speed+photographic+imaging.">Vitrification of cryoelectron microscopy specimens revealed by high-speed photographic imaging.</a> Journal of Microscopy. 211, 48-53 (2003).</li><li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defocus-dependent+Thon-ring+fading.">Defocus-dependent Thon-ring fading.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Bagshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+flow+kinetics.">A beginner's guide to flow kinetics.</a> The Biochemist. 42, (2020).</li></ol>

يمكن استخدام البروتوكولات في هذا العمل لإعداد الشبكة بسرعة عن طريق الرش المباشر وتجارب TrEM. يمكن استخدام إعداد الشبكة السريعة للحد من تفاعلات الجسيمات مع واجهة مياه الهواء5. القيود الرئيسية هي تركيز العينة المتاحة وسمك الجليد على الشبكة. ضمن هذه الحدود وشريطة أن تكون جودة الع?...

خلفية وقد مكنت التطورات الأخيرة في المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) من إجراء دراسات هيكلية للأنظمة المتزايدة التعقيد بدقة عالية. مع استثناءات قليلة، اقتصرت هذه الدراسات على الجزيئات البيولوجية في التوازن1 أو ردود الفعل بطيئة نسبيا2. تحدث العديد من العمليات في الجسم الحي على مقياس زمني أسرع (مللي ثانية) وهناك اهتمام متزايد في cryo-EM (TrEM) الذي تم حله عبر الزمن على هذه الجداول الزمنية3. ومع ذلك، إعداد عينة cryo-EM التقليدية بواسطة أسلوب النشاف بطيئة جدا لTrEM ميلي ثانية.
أسلوب النشاف له قيود أخرى إلى جانب ضعف الوقت القرار. يمكن أن تعاني البروتينات ومجمعات البروتين من التشبع أو التوجه المفضل على الشبكات4. وقد تبين أن تقليل وقت التعرض لواجهة الهواء والماء أثناء إعداد العينة للتخفيف من التوجه المفضل وتشبع البروتين5،6. وبالتالي، فإن إعداد الشبكة بسرعة لا يتيح فقط TrEM ميلي ثانية ولكن يمكن أيضا تحسين جودة الشبكة.
حاليا، هناك ثلاثة نهج مختلفة لإعداد الشبكة الآلي. يستخدم النهج الأول دبوس أو الشعرية التي تحتوي على كمية صغيرة من العينة. بعد إقامة اتصال بين السائل وسطح الشبكة ، يتم "كتابة" العينة على الشبكة7،8. عملية تطبيق نموذج بطيء نسبيا ويستغرق بضع ثوان. نهج بديل يستخدم توليد القطيرات التي تسيطر عليها موزع بيزو وشبكات الفتل الذاتي9. وهذا يسمح أسرع الاستغناء عن تجميد مرات، ولكن لا يزال محدودا عن طريق سرعة القطيرات والفتل (تصل حاليا إلى 54 مللي ثانية). أسرع نهج حتى الآن هو نهج الرش المباشر ، حيث يتم تفتيت العينة في فوهة رذاذ وقطرات صغيرة (~ 10 - 20 ميكرومتر) وسريعة (> 5 م / ثانية) تنتشر عند ملامسة شبكة cryo-EM. يمكن توليد رذاذ العينة من خلال طرق مختلفة مثل رذاذ الأرومة الهوائية ، والموجات الصوتية السطحية أو المرطبات بالموجات فوق الصوتية10،11،12،13. في تجربتنا، سمك الجليد مع نهج الرش المباشر هو أكبر ولكن الرش المباشر تمكن الاستغناء عن تجميد مرات < 10 مللي ثانية.
يصف هذا البروتوكول خطوة بخطوة كيف يمكن استخدام جهاز EM (TED) الذي تم حله زمنيا والمجهز ب فوهة رذاذ microfluidic لإعداد الشبكات على مقياس زمني سريع14و15. وقد استخدم الجهاز لإعداد الشبكات مع الحد الأدنى من وقت التأخير من 6 مللي ثانية بين تطبيق العينة وتجميد وخلط وتجميد عينات اثنين بسرعة. ويستند تصميم تيد على الإصدار السابق16 ويشبه غيرها من الأجهزة القائمة على رذاذ الوقت حل cryo-EM17.
أولا، يتم وصف الأجزاء الأربعة الرئيسية من إعداد تيد. جوهر تيد هو وحدة المناولة السائلة، وهي المسؤولة عن عينة الطموح والاستغناء. المكبس الهوائي يحرك الشبكة من خلال الرذاذ إلى الإيثان السائل. يتم تحقيق توليد الرذاذ مع فوهات رذاذ microfluidic ويتم التجميد في حاوية الإيثان السائل ، والتي يتم وصفها لفترة وجيزة. وأخيرا، يتم تسليط الضوء على الميزات الإضافية للتحكم في بيئة الشبكة، وخاصة الرطوبة. ويتبع ذلك بروتوكولات مفصلة لتشغيل الجهاز وإجراء تجارب TrEM. يتم إعطاء نتائج تمثيلية لإعداد الشبكة بسرعة وتجربة TrEM بسيطة.
الإعداد التجريبي
وحدة المناولة السائلة يتم تشكيل نظام المناولة السائلة في تيد من خلال ثلاث مضخات محرك حقنة ('مضخات 1 - 3')، كل مجهزة صمام دوار(الشكل 1). توفر إمدادات الطاقة مضخات 1-3 مع 24 فولت DC. الاتصال مع برنامج التحكم (مكتوب في Visual Basic و C ++) عبر واجهة RS232 لضخ 1. يتم توزيع الأوامر من خلال منافذ توسيع الإدخال/إخراج التسلسلية من المضخة 1 إلى المضخات 2-3. مضخات 1-3 مجهزة المحاقن الزجاجية ('المحاقن 1-3'، ونحن نستخدم 250 ميكرولتر / صفر المحاقن حجم الميت هنا). كل صمام له موقفين، "تحميل" و "الاستغناء". يتم استخدام موضع "الحمل" لتنشق العينة في الحقنة. قطعة قصيرة (~ 3 - 4 سم) من 1/16 "O.D., 0.01′′I.D. يتم توصيل أنابيب FEP عبر ETFE / ETFE التجهيزات مع ذلك إلى موقف 'تحميل' من الصمامات 1-3. تصل هذه القطعة القصيرة من الأنابيب إلى خزان العينة (عادة أنبوب بلاستيكي سعة 1.5 مل أو 0.5 مل). موقف "الاستغناء" يؤدي إلى فوهة رذاذ. يتم الاتصال بين منفذ "الاستغناء" وفوهة الرش عن طريق أنابيب PE (~ 20-30 سم طول، 0.043"O.D.، 0.015"I.D.)، مع قطعة قصيرة من أنابيب الأكمام (~ 0.5 سم) و ETFE / ETFE التجهيزات flangeless.
المكبس الهوائي يستخدم TED المكبس الهوائي لتسريع الشبكة وتحريكها من خلال رذاذ العينة في حاوية الإيثان السائلة. ملاقط الضغط السلبي عقد الشبكة، مشدود في حامل المنزل الصنع الذي شنت على اسطوانة هوائية قضيب مزدوج(الشكل 2A).
يتم توفير الضغط من اسطوانة غاز النيتروجين الكبيرة (حجم W) ، ومجهزة منظم متعدد المراحل (0 - 10 بار ، "الضغط الرئيسي"). تربط أنابيب PVC المعززة المرنة (12 مم O.D. ) المنظم بمشعب مكون من 12 منفذا حيث يتم توصيل النيتروجين المضغوط إلى الفوهة والمغطاس الهوائي. تدفق الغاز من خلال فوهة ثابت، وينظم مباشرة في اسطوانة النيتروجين (الضغط الرئيسي). يتم إجراء الاتصال بالزهة مع أنابيب PU (4 مم O.D.، 2.5 مم I.D.)، قطعة قصيرة من أنابيب PE (طول ~ 8 سم، 0.043 بوصة، 0.015 بوصة) والموصلات المناسبة. يتم التحكم في الضغط على المكبس الهوائي من خلال صمام سولينويد. تربط أنابيب PU (4 مم O.D.، 2.5 مم I.D.) الصمام السولينويد بمنظم ومغطاس هوائي، للسماح بانخفاض ضغط الهبوط (≤ الضغط الرئيسي). صمام سولينويد هو الكمبيوتر التي تسيطر عليها. يتم إعطاء نظرة عامة تخطيطية الإعداد في الشكل 2B.
لاحظ أنه مع هذا الإعداد ضغط الهبوط هو دائما على قدم المساواة أو أصغر من ضغط الغاز رذاذ (الضغط الرئيسي). ومع ذلك ، يمكن بسهولة تغيير الإعداد من خلال دمج منظم ثان في المنبع من فوهة الرش للسماح بسرعات هبوط أعلى عند ضغط غاز الرش المنخفض. يمكن أن يؤدي الضغط العالي (>> 2 بار) إلى تلف فوهة رذاذ PDMS.
تنبيه: هذا هو نظام الضغط و "الضغط الرئيسي" يجب أن يكون دائما < 7 بار.
وعادة ما تستخدم الضغوط بين 0.5 و 2 شريط للمغطس الهوائية وتظهر علاقة خطية تقريبا بين الضغط والسرعة (في الموقف الرأسي للرذاذ). يتم قياس سرعات الهبوط مع منظار الذبذبات، متصلة تمشيا مع عداد ال وقوي الشريحة (10 kΩ) وبالتوازي مع مقاوم 2 كيلوΩ (الشكل 2C). توفر إمدادات الطاقة مقياس القوة مع 9 V DC. في حين يتم تعيين سرعة الهبوط التقريبية قبل التجربة عن طريق وضع ضغط الهبوط ، فإن مقياس القوة يعطي قراءات دقيقة للسرعة بعد التجربة.
فوهات الرش وحاوية الإيثان السائلة وقد وصفت تصنيع وتشغيل فوهات افتراضية ديناميكية الغاز لتسليم العينة على أساس رذاذ في مكان آخر بالتفصيل15. كما هو موضح أعلاه، يتم توصيل منافذ "الاستغناء" من الصمامات 1-3 إلى مداخل السائل من فوهة (الشكل 3A). يتم توصيل غاز الرش المضغوط بمدخل الغاز في الفوهة. المداخل في فوهات رذاذ PDMS هي من هذا القبيل أن 0.043 "O.D. PE أنابيب يمكن استخدامها مباشرة دون الحاجة إلى التجهيزات. يحتوي تصميم الفوهة لدينا على هندسة "طائرة نفاثة" لخلط عينتين ، على غرار الجهاز الموصوف في المرجع18. يظهر مخطط للتصميم في الشكل 3B، وتظهر صورة مجهرية لل وفوهة في الشكل 3C. يتطلب تخطيط الجهاز microfluidic استخدام ثلاث حقن لخلط عينتين. يتم وضع فوهة الرش عادة على مسافة 1-1.5 سم من الشبكة (أثناء تطبيق العينة).
نحن نستخدم الإيثان السائل ككريوجين، في وعاء الإيثان السائل / النيتروجين كما هو مستخدم لطريقة النشاف القياسية. يتم تحديد المواقع الرأسية لكأس الإيثان السائل من خلال منصة رفع مختبرية.
التحكم في بيئة الرذاذ والشبكة وترد فوهة المكبس ورذاذ داخل مخصص بنيت PMMA (زجاج الاكريليك) مربع مع باب مزدوج(الشكل 4A). يتم تحقيق الرطوبة النسبية العالية داخل الصندوق من خلال نظام ترطيب الهواء في الجزء الخلفي من تيد(الشكل 4B). يتم توفير الهواء بواسطة مضخة وتغذية في أول 10 "علبة (تستخدم عادة لتنقية المياه تحت بالوعة). تمتلئ العبوة بمستوى منخفض (~ 5-10 سم) من الماء وتضم أيضا وحدة مرطب. يتم التحكم في طاقة التيار الكهربائي للمرطب بواسطة وحدة تحكم رقمية في الرطوبة / درجة الحرارة ومستشعر الرطوبة / درجة الحرارة الموجود داخل صندوق زجاج الأكريليك. يتم تعيين وحدة التحكم لإيقاف تشغيل المضخة عندما تصل الرطوبة النسبية ≥ 90 ٪. يتم ضخ الهواء المرطب من العبوة الأولى من خلال الناشر ، مغمورة في الماء في عبوة 10 بوصة ثانية ثم تدخل مربع زجاج الأكريليك.
تنبيه: نظرا لأن العينة يتم هباءها في فوهة الرش ، فإن العينة البيولوجية أو الكيميائية الخطرة ليست مناسبة كعينات.
تسلسل التشغيل يبدأ الزر تشغيل البرنامج النصي في برنامج التحكم تسلسل التشغيل. يمكن تعريف تسلسل الأوامر هذا مسبقا في ملف البرنامج النصي وتغييره من خلال البرنامج. يتم شرح أهم المتغيرات هنا:
سرعة الرش: تحدد سرعة الرش معدل التدفق السائل الذي تستخدمه مضخة الحقنة. يمكن حساب معدل التدفق على النحو التالي: محركات مضخة الحقن المستخدمة هنا لها حجم خطوة ثابتة. وتنقسم المجموعة الكاملة للمضخة إلى 48،000 خطوة. العامل الثاني المهم هو حجم الحقنة. نحن عادة ما نستخدم 250 حقنة ميكرولتر. يتم تعيين سرعة الرش في برنامج التحكم وعدد من الخطوات / الثانية. سرعة الرش من 1000 خطوات / ثانية يتوافق مع:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62199/62199eq01.jpg">
حجم الرش: يحدد حجم الرش إجمالي الحجم الذي سيتم رشه. وهكذا، فإنه يحدد أيضا مدة رذاذ. يتم تعيين حجم الرش في برنامج التحكم كعدد من الخطوات. حجم رذاذ من 2000 خطوات، بسرعة رذاذ من 1000 خطوة / ثانية، ويؤدي إلى مدة رذاذ من 2 ق وحجم إجمالي قدره 10.4 ميكرولتر.
وقت ما قبل الرش: يحدد هذا المتغير الوقت بين بدء الرش والغطس. من المهم اختيار وقت التأخير بحيث يكون للرذاذ الوقت الكافي لتحقيق الاستقرار قبل إغراق الشبكة. عادة، يتم إعطاء رذاذ 1.5 -4 ق لتحقيق الاستقرار قبل أن تغرق الشبكة. يتم الحفاظ على الرذاذ حتى تتحرك الشبكة من خلال. عادة، يتم إيقاف تدفق السائل (وبالتالي رذاذ) 0.5 إلى 1 s بعد أن تم هوت الشبكة. باستخدام سرعة رش 1000 خطوة / ثانية وحجم رذاذ من 2000 خطوة ، فإن وقت الرش النموذجي هو 1.5 ثانية ، على سبيل المثال.
يظهر تسلسل مثالي للأوامر في الشكل 5A، ويتم توضيح موضع الشبكة بمرور الوقت في الشكل 5B.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Time resolved device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acrylic glass box</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital humidity/temperature controller</td>
			<td>THE20 digital humidity/temperature controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual rod pneumatic cylinder</td>
			<td>dual rod pneumatic cylinder TN 10x70</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP tubing</td>
			<td>Upchurch Scientific 1/16&#8221; O.D., 0.01&#39;&#39; I.D. FEP tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flangeless fittings</td>
			<td>Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible reinforced PVC tubing</td>
			<td>12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass syringes</td>
			<td>Kloehn 250 &#181;L zero-dead volume</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>humidifier pump</td>
			<td>Interpret Aqua Air AP3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid ethane container</td>
			<td>from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multistage regulator</td>
			<td>GASARC class 3 multistage regulator</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative pressure tweezers</td>
			<td>Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>Hantek 6022BE oscilloscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE tubing</td>
			<td>Scientific Commodities Inc. 0.043&#8221; O.D., 0.015&#8221; I.D. PE tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power supply</td>
			<td>Mean Well GSM160A24-R7B</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power supply</td>
			<td>Wanptek KPS305D power supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU tubing</td>
			<td>SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>regulator</td>
			<td>Norgren R72G-2GK-RMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide potentiometer</td>
			<td>PS100 slide potentiometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solenoid valve</td>
			<td>SMC NVJ314M solenoid valve</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe drive pumps</td>
			<td>Kloehn V6 48K model</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents &#38; Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apoferritin from equine spleen</td>
			<td>Sigma-Aldrich, A3660</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, A2383</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-EM grids</td>
			<td>Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich E3889</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-actin</td>
			<td>Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glow-discharger</td>
			<td>Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, H7006</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAc</td>
			<td>Sigma-Aldrich, P1190</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, M8266</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich, M1254</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, S9888</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal muscle myosin S1</td>
			<td>Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref 1</td>
			<td>Spudich, J. A. &#38; Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref 2</td>
			<td>White, H. &#38; Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy

يتطور مجال المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) بسرعة باستخدام أجهزة جديدة وخوارزميات معالجة ، مما ينتج هياكل عالية الدقة ومعلومات عن الأنظمة الأكثر تحديا. ويخضع إعداد العينة للكريو-م لثورة مماثلة مع وضع نهج جديدة لتحل محل أنظمة النشاف التقليدية. وتشمل هذه استخدام موزعات بيزو الكهربائية، دبوس الطباعة والرش المباشر. ونتيجة لهذه التطورات، تسير سرعة إعداد الشبكة من ثوان إلى مللي ثانية، مما يوفر فرصا جديدة، لا سيما في مجال التبريد-EM الذي تم حله زمنيا حيث يمكن خلط البروتينات والركائز بسرعة قبل الهبوط في التجمد، مما يؤدي إلى محاصرة الدول المتوسطة قصيرة العمر. هنا نقوم بوصف، بالتفصيل، بروتوكول قياسي لصنع شبكات على جهاز EM الداخلي الذي تم حله زمنيا لإعداد الشبكة السريعة القياسية وكذلك للتجارب التي تم حلها زمنيا. يتطلب البروتوكول عينة لا تقل عن 50 ميكرولتر بتركيزات ≥ 2 ملغم/مل لإعداد 4 شبكات. يمكن أن يكون التأخير بين تطبيق العينة والتجميد منخفضا إلى 10 مللي ثانية. أحد القيود هو زيادة سمك الجليد بسرعات أسرع ومقارنتها بطريقة النشاف. نأمل أن يساعد هذا البروتوكول الآخرين في تصميم أجهزة صنع الشبكة الخاصة بهم والمهتمين بتصميم تجارب حلها الزمن.

إعداد الشبكة بسرعة مع TED كعينة اختبار لإعداد الشبكة السريعة ، استخدمنا أبوفريتين من طحال الخيول بسرعة 20 ميكرومتر في 30 mM HEPES ، 150 mM NaCl ، درجة الحموضة 7.5. تم الحصول على إعادة بناء في القرار 3.5 ألف من 690 ميكروجراف كما هو موضح في المرجع15 (الشكل 7A). تم اختيار نط...

Watch this Scientific Journal Video about Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy at JoVE.com

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

هنا، نقدم بروتوكول مفصل لاستخدام جهاز صنع الشبكة السريعة لكل من صنع الشبكة السريعة والاختلاط السريع والتجميد لإجراء تجارب حل الوقت.

إعداد الشبكة السريعة للمجهر Cryo-Electron الذي تم حله زمنيا

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

مرحبا، ومرحبا بكم في هذا الفيديو JoVE". نريد أن نقدم لكم الإعداد الذي لدينا هنا لصنع الشبكة السريعة، دراسة حلها الزمن التي نحن تطوير أكثر في ليدز. كن على علم بأن هذا ليس نظاما قياسيا ، ولكننا نأمل أنه من خلال إعطائك سردا مفصلا لجميع الأشياء والمعلمات التي نقوم بها ، ستتمكن من تطوير أنظمة مماثلة في مختبراتك الخاصة.ويرد وصف مفصل للجهاز في بروتوكول ريتشموند. هنا، نحن ذاهبون لإعطاء دليل خطوة بخطوة لإعداد الشبكة بسرعة وEM حل الوقت. في تجربتنا، يجب أن يكون تركيز البروتين اثنين ملليغرام لكل ملليلتر أو أعلى. يتطلب البروتوكول حدا أدنى من الحجم يبلغ حوالي 50 ميكرولتر.قم بتشغيل الجهاز. ثم قم بتشغيل جهاز التحكم وبدء تشغيل برنامج التحكم. تهيئة جميع مضخات الحقنة عن طريق الضغط على زر التهيئة على كل مضخة حقنة.قم بتشغيل مصدر الطاقة القوي، واضبطه على تسع فولتات، وابدأ تشغيل برنامج التحكم في الذبذبات. هناك حاجة إلى غاز النيتروجين المضغوط لتوليد رذاذ. فتح اسطوانة النيتروجين وتعيين الضغط إلى 2 شريط.تأكد من أن جميع صمامات مضخة المحاقن في وضع الحمل. للقيام بذلك، قم بتبديل كافة الصمامات للاستغناء في برنامج التحكم ومن ثم العودة إلى التحميل. تعيين جميع المحاقن إلى الصفر.وينبغي إزالة أي فقاعات الهواء الموجودة في النظام في هذه المرحلة. للقيام بذلك قد يكون المحاقن فك، فقاعات إزالتها يدويا، والمحاقن التي شنت مرة أخرى عند احتواء لا مزيد من الفقاعات. عادة ما يتم تخزين نظام المناولة السائلة في الماء.قبل تحميل العينة، يتم دقة النظام مع المخزن المؤقت. ويتم ذلك عن طريق غسل الأنابيب مع فائض من العازلة. ضع أنبوب يحتوي على ما لا يقل عن 200 ميكرولتر من العازلة على حقنة واحدة.يجب أن تكون مثقوبة الجزء العلوي من الأنبوب لإرفاقه. يستنشق كمية مناسبة من العازلة، بين 50 و 100 ميكرولتر مع حقنة واحدة باستخدام برنامج التحكم. تبديل صمام واحد للاستغناء.الاستغناء عن كل من السائل في حقنة واحدة. عودة صمام واحد إلى موقف الحمل، واضغط على زر تهيئة على حقنة واحدة لإعداد النظام لدورة الغسيل المقبل. وعادة ما تتكرر هذه الخطوات ثلاث مرات لضمان غسل شامل للأنابيب.بعد ذلك ، يتم وضع فوهة الرش. ضع شبكة EM في الذراع المنغمسة. ضع الشبكة أمام فوهة الرش.الاستغناء عن المخزن المؤقت باستخدام برنامج التحكم. إذا تم محاذاة الفوهة والشبكة ، يجب أن يتراكم السائل بعد الرش لفترة طويلة من الزمن. إذا لزم الأمر، قم بضبط موضع الفوهة ثم تحقق مرة أخرى من مكان تراكم السائل على الشبكة.بعد ذلك، ضبط موقف كأس الإيثان. يجب أن تصل أطراف الملاقط إلى مركز كأس الإيثان تقريبا. قم بإجراء اختبار للتأكد من صحة كافة الإعدادات.أغلق غرفة الرطوبة. تأكد من أن مسار المكبس واضح. يستنشق حجم المخزن المؤقت المطلوب لتشغيل واحد في حقنة واحدة.تبديل صمام واحد للاستغناء. بدء التشغيل بالضغط على run'in برنامج التحكم. تحقق من أن مضخة حقنة واحدة تتحرك، ثانيتين في هذه الحالة، ويتم هوت الشبكة بعد تأخير مناسب، 1.5 ثانية هنا.عند الانتهاء من تشغيل، تعيين الضغط على ذراع المكبس إلى القيمة المطلوبة. اضغط OK'in برنامج التحكم لتحرير الضغط من الذراع يغرق. الآن كأس الإيثان بارد ومليء بال إيثان السائل.توهج التفريغ الشبكات قبل الاستخدام. وتوهج نموذجي التفريغ هو 90 ثانية في 10 مللي أمبير في الهواء 0.1 ملليبار. ثم يتم توازن الأنابيب مع العينة.إذا كان حجم العينة المتوفرة منخفضا، فقد يتم إعادة توازن الأنابيب بحجم واحد فقط. عينة أسبيرات. عادة ما يكون حجم الميت حوالي 30 ميكرولتر.تبديل صمام واحد للاستغناء. الاستغناء عن العينة من خلال الأنابيب وفوهة. ثم يستنشق مقدار العينة المطلوبة لتشغيل واحد.تبديل صمام واحد للاستغناء. تأكد من أن الرطوبة النسبية قد وصلت إلى القيمة المطلوبة. نحن عادة إعداد الشبكات في 60٪ أو أعلى.هذا يمكن أن يستغرق بضع دقائق. ضع الملاقط التي تحمل شبكة متوهجة في الذراع المنغمسة. ضع الشريحة قياس القوة في موضع البداية، وعلى استعداد لقياس السرعة.تعيين المشغل لقياس السرعة في برنامج الذبذبات. ضع كوب الإيثان السائل، وعلى مقربة من غرفة الرطوبة. تأكد من أن مسار المكبس واضح.بدء التشغيل في برنامج التحكم. عند الانتهاء من تشغيل، اضغط OK'in برنامج التحكم للافراج عن الضغط من الذراع يغرق. فتح غرفة الرطوبة، وتخفيف الصلة بين الذراع يغرق وملاقط.تحريك الذراع يغرق مع الحفاظ على الشبكة في الإيثان السائل. ثم نقل الشبكات إلى النيتروجين السائل وإلى التخزين. حفظ قياس الذبذبات.يدويا إعادة تعيين موقف شريط التمرير عداد القوة والغطاس. كرر البروتوكول لإعداد الشبكات المتماثلة. ويتم إجراء التجارب التي تم حلها زمنيا بطريقة مماثلة.هناك حاجة إلى تركيزات أعلى للمخزون للتجارب التي تم حلها زمنيا بسبب التخفيف في خطوة الاختلاط. لإجراء تجربة تم حلها زمنيا، استخدم جميع المحاقن الثلاث. يتم إرفاق أنابيب لمضخات الحقنة وفوهة رذاذ.فوهة رذاذ microfluidic المستخدمة هنا يحتوي أيضا على عنصر خلط. لاحظ أن أنابيب أطول سوف تعطي أكبر الميت الحجم وغسل خطوات التوازن تتطلب المزيد من العازلة وعينة. توازن جميع المحاقن مع العازلة وعينة على حدة.عادة، يتم استخدام حقنة واحدة لعينة A'and المحاقن اثنين وثلاثة وتستخدم لعينة B'After الأنابيب هو متساوية، تحميل عينة A في حقنة واحدة وعينة B في المحاقن اثنين وثلاثة. ثم قم بتبديل الصمامات من واحد إلى ثلاثة للاستغناء عنها. بدء التشغيل في برنامج التحكم.لاحظ أن هناك حاجة إلى برنامج نصي تشغيل مختلفة لتجربة حل الوقت. ويمكن تحقيق تأخيرات زمنية مختلفة بطريقتين. عن طريق ضبط سرعة المكبس، يمكن تغيير تأخير الوقت من الاختلاط إلى التجميد.سرعة الهبوط الأسرع ستؤدي إلى تأخير أقصر في الوقت. بدلا من ذلك، يتم تغيير مسافة الإيثان رذاذ عن طريق ضبط الموقف الرأسي للرذاذ فوهة. زيادة المسافة سيؤدي إلى تأخير وقت أطول.في المجهر الإلكتروني عند التكبير المنخفض ، تبدو الشبكة النموذجية مثل هذا. مناطق الجليد الرقيقة، كما هو مبين، مناسبة للحصول على البيانات. في التكبير الأعلى، يجب أن تكون الجسيمات مرئية بوضوح.مع عينة اختبار مثل أبوفيريتين، مجموعة بيانات صغيرة نسبيا من شبكة واحدة كافية لإعادة الإعمار في دقة angstrom ثلاثة إلى أربعة. بالنسبة للتجارب التي تم حلها زمنيا، نقوم بتجميع مجموعات البيانات من نقاط أو شبكات زمنية مختلفة. من المفيد الجمع بين البيانات لتصنيف ثلاثي الأبعاد ومن ثم تتبع الجسيمات إلى نقاطها الزمنية.وبهذه الطريقة يمكن أن توفر البيانات معلومات هيكلية ومعلومات عن الحركية رد الفعل. في الختام، نأمل أن تكونوا قد استمتعتم بالفيديو. نأمل أنه مع الأوصاف التفصيلية في ورقة JoVE جنبا إلى جنب مع الفيديو ، ستتمكن من إجراء تجاربك الخاصة عبر صنع الشبكة السريعة ، والتي ثبت أنها تخفف من بعض المشاكل الناجمة عن الطفرة أو المساعدة في التفاعلات في واجهة الهواء والماء ، كل ما تحتاجه لإجراء دراساتك الخاصة التي تم حلها زمنيا لمحاولة اعتراض بعض حالات عدم التوازن هذه.لذا، صنع شبكة سعيدة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

التعبير وتنقية TRPC3 الإنسان حساسة للدهن قناة الأيونات الموجبة للتصميم الهيكلي بالفحص المجهري واحد-الجسيمات Cryo-إلكترون

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

إعداد و Cryo-FIB micromachining من Saccharomyces cerevisiae للتصوير المقطعي كريو إلكترون

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

المجهر أحادي الجسيمات كريو إلكترون: من عينة إلى هيكل

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

شبكات المجهر الإلكتروني للإرسال بالنمط المجهري لتحديد مواقع الخلايا مباشرة ضمن سير عمل التصوير المقطعي بالتبريد والإلكترون للخلية الكاملة

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

سير عمل قوي لمعالجة المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryo-EM) باستخدام cryoSPARC و RELION و Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

تحضير جسيمات النواة النيوكليوسوم المعقدة مع عوامل إصلاح الحمض النووي للتحديد الهيكلي للمجهر الإلكتروني بالتبريد

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

استخراج الأنابيب الدقيقة المعدلة من خلايا الثدييات لدراسة معقدات بروتين الأنابيب الدقيقة بواسطة المجهر الإلكتروني بالتبريد

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

تطبيق الجرافين أحادي الطبقة على شبكات المجهر الإلكتروني المبرد لتحديد الهيكل عالي الدقة

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...