Name: fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy at JoVE.com

我们要感谢莫莉S.C格雷维特的有益讨论和ABSL设施的工作人员帮助冷冻-EM数据收集。David P. Klebl 是利兹大学资助的阿斯特伯里中心韦康信托 4 年博士项目的博士生。FEI泰坦克里奥斯显微镜由利兹大学（UoL ABSL奖）和韦尔康信托（108466/Z/15/Z）资助。这项工作由BBSRC授予斯蒂芬·穆恩奇（BB/P026397/1）的赠款资助，并得到了美国心脏协会（AMR21-236078）和美国国家卫生研究院（171261）霍华德·怀特和维托尔德·加尔金的研究资助。

1. 准备系统
注：以下协议描述了如何准备单个示例的网格。通常，为每个示例或条件准备了至少 2 个复制网格。对于更快的暴跌速度（小于 +20 ms 时间延迟），3 或 4 个复制网格通常准备考虑减少的薄冰区数量。
<ol><li>将蛋白质样本稀释至所需缓冲区的目标浓度。通常，最终浓度≥ 2 毫克/mL 与 TED 配合使用，可很好地进行网格准备。请注意，样品可以保存在冰上直到第 10 步?...

<ol>
	<li>Murphy, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotary+substates+of+mitochondrial+ATP+synthase+reveal+the+basis+of+flexible+F1-Fo+coupling.">Rotary substates of mitochondrial ATP synthase reveal the basis of flexible F1-Fo coupling.</a> Science. 364, (2019).</li><li>Benton, D. J., Gamblin, S. J., Rosenthal, P. B., Skehel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+transitions+in+influenza+haemagglutinin+at+membrane+fusion+pH.">Structural transitions in influenza haemagglutinin at membrane fusion pH.</a> Nature. , 1-4 (2020).</li><li>Dance, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motion+on+ice.">Molecular motion on ice.</a> Nature Methods. , 1-5 (2020).</li><li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it.">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> Elife. 8, 42747 (2019).</li><li>Noble, A. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structures+from+sub-nl+volumes+using+pin-printing+and+jet+vitrification.">Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification.</a> Nature Communications. 11, 1-9 (2020).</li><li>Arnold, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting-free+and+lossless+cryo-electron+microscopy+grid+preparation+from+nanoliter-sized+protein+samples+and+single-cell+extracts.">Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts.</a> Journal of Structural Biology. 197, 220-226 (2017).</li><li>Razinkov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+vitrifying+samples+for+cryoEM.">A new method for vitrifying samples for cryoEM.</a> Journal of Structural Biology. 195, 190-198 (2016).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+and+effective+microfluidic+spraying-plunging+method+for+high-resolution+single-particle+cryo-EM.">A fast and effective microfluidic spraying-plunging method for high-resolution single-particle cryo-EM.</a> Structure. 25, 663-670 (2017).</li><li>Ashtiani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+femtolitre+droplets+using+surface+acoustic+wave+based+atomisation+for+cryo-EM+grid+preparation.">Delivery of femtolitre droplets using surface acoustic wave based atomisation for cryo-EM grid preparation.</a> Journal of Structural Biology. 203, 94-101 (2018).</li><li>Rubinstein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shake-it-off:+a+simple+ultrasonic+cryo-EM+specimen-preparation+device.">Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75, (2019).</li><li>M&#228;eots, M. -. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+deposition+onto+cryo-EM+grids:+from+sprays+to+jets+and+back.">Sample deposition onto cryo-EM grids: from sprays to jets and back.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 76, (2020).</li><li>White, H., Thirumurugan, K., Walker, M., Trinick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+generation+apparatus+for+time-resolved+electron+cryo-microscopy+using+stepper+motors+and+electrospray.">A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray.</a> Journal of Structural Biology. 144, 246-252 (2003).</li><li>Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Complex Assembly. , 59-71 (2018).</li><li>Trebbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+liquid+jet+system+with+compatibility+for+atmospheric+and+high-vacuum+conditions.">Microfluidic liquid jet system with compatibility for atmospheric and high-vacuum conditions.</a> Lab on a Chip. 14, 1733-1745 (2014).</li><li>Klebl, D. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limiting+rate+of+the+ATP-mediated+dissociation+of+actin+from+rabbit+skeletal+muscle+myosin+subfragment+1.">The limiting rate of the ATP-mediated dissociation of actin from rabbit skeletal muscle myosin subfragment 1.</a> FEBS Letters. 160, 141-148 (1983).</li><li>Kasas, S., Dumas, G., Dietler, G., Catsicas, S., Adrian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+cryoelectron+microscopy+specimens+revealed+by+high-speed+photographic+imaging.">Vitrification of cryoelectron microscopy specimens revealed by high-speed photographic imaging.</a> Journal of Microscopy. 211, 48-53 (2003).</li><li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defocus-dependent+Thon-ring+fading.">Defocus-dependent Thon-ring fading.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Bagshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+flow+kinetics.">A beginner's guide to flow kinetics.</a> The Biochemist. 42, (2020).</li></ol>

这项工作中的方案可用于通过直接喷洒和TrEM实验进行快速网格准备。快速网格制备可用于减少颗粒与空气水接口的相互作用。主要限制是网格上可用的样品浓度和冰厚。在这些限制内，只要样品质量良好，协议将生成适合高分辨率低温-EM的网格。
故障 排除 液体流速和网格速度决定了沉积在网格上的液体量。以上述示例设置（液体流速 5 μL/s ...

背景 低温电子显微镜（cryo-EM）的最新发展使对日益复杂的高分辨率系统进行了结构研究。除了少数例外，此类研究仅限于平衡1 或相对缓慢反应2的生物大分子。体内的许多过程 发生在 更快的时间尺度上（毫秒），并且对这些时间刻度3中时间解决的低温 EM （TrEM） 的兴趣与日增。然而，传统的低温EM样品制备的印迹方法太慢毫秒TrEM。
除时间分辨率差外，印迹方法还有其他限制。蛋白质和蛋白质复合物可能遭受变性或首选方向的网格4。在样品制备过程中减少暴露在空气-水界面上的时间，已证明可以减轻首选方向和蛋白质变性5，6。因此，快速网格制备不仅能实现毫秒 TrEM，还能提高电网质量。
目前，自动网格准备有三种不同的方法。第一种方法使用固定少量样品的针脚或毛细管。在建立液体和网格表面之间的接触后，样品被"写"到网格7，8。示例应用过程相对较慢，需要几秒钟。另一种方法使用由Piezo分配器和自吸电网9控制滴的生成。这允许更快的分配冻结时间，但仍然受到水滴和芯速的限制（目前达到54ms）。到目前为止，最快的方法是直接喷洒方法，其中样品在喷雾喷嘴和小（+10 - 20 μm）和快速（>5米/s）液滴中雾化，在与低温-EM网格接触后扩散。样品喷雾可以通过不同的方式产生，如空气母细胞雾化器，表面声波或超声波加湿器10，11，12，13。根据我们的经验，直接喷洒方法的冰厚更大，但直接喷洒可使喷涂时间冻结时间< 10 ms。
该协议描述了如何逐步解决的EM设备（TED）配备了微流体喷雾喷嘴可用于准备网格在快速时间尺度14，15。该设备用于制备网格，在样品应用和冷冻之间最短延迟时间为 6 ms，并快速混合和冻结两个样品。TED的设计是基于以前的版本16，类似于其他喷雾基于时间解决的低温EM设备17。
首先，描述了TED设置的四个主要部分。TED 的核心是液体处理单元，负责样品吸气和配药。气动柱塞通过喷雾将网格移动到液态乙烷中。喷雾的生成是通过微流体喷雾喷嘴实现的，冻结是在液体乙烷容器中完成的，该容器被简要描述。最后，突出了控制网格环境的其他功能，特别是湿度。随后是设备操作和进行 TrEM 实验的详细协议。为快速网格准备和简单的 TrEM 实验提供了具有代表性的结果。
实验设置
液体处理单元 TED 的液体处理系统由三个注射器驱动泵（"泵 1 - 3"）组成，每个泵都配有旋转阀（图 1）。电源提供泵 1 - 3 与 24 V 直流。与控制软件（以视觉基础和C++编写）的通信是通过 RS232 接口泵 1。命令通过序列 I/O 扩展端口从泵 1 分发到泵 2-3。泵 1-3 配备玻璃注射器（注射器 1-3'，我们在这里使用 250 μL/零死容量注射器）。每个阀门有两个位置，"负载"和"分配"。"负载"位置用于将样品吸进注射器。1/16"O.D.，0.01°I.D. FEP 管的短片（+ 3 - 4 厘米）通过 ETFE/ETFE 无法兰配件连接到阀门 1-3 的"负载"位置。这小块管子伸进样品储层（通常是 1.5 mL 或 0.5 mL 塑料管）。"分配"位置通向喷嘴。"分配"插座和喷雾喷嘴之间的连接由 PE 管（+ 20-30 厘米长，0.043" O.D.，0.015" I.D.）制成，带有一小块袖管（+0.5 厘米）和 ETFE/ETFE 无法兰配件。
气动柱塞 TED 使用气动柱塞加速网格，并通过样品喷雾将其移动到液态乙烷容器中。负压钳子保持网格，拧成一个自制的支架，安装在双杆气动缸（图2A）。
压力来自一个大氮气瓶（W大小），配备多级调节器（0 - 10杆，"主压力"）。柔性增强 PVC 管（12 mm O.D.）将调节器连接到 12 端口歧管，其中加压氮输送到喷嘴和气动柱塞。通过喷嘴的气体流是恒定的，直接在氮气瓶（主压力）调节。与喷嘴的连接由PU管（4 毫米 O.D.，2.5 毫米 I.D.）、一小块 PE 管（+ 8 厘米长，0.043 英寸 O.D.，0.015 英寸 I.D.）和适当的连接器制成。气动柱塞的压力通过电磁阀控制。PU 管（4 mm O.D.，2.5 mm I.D.）将电磁阀与调节器和气动柱塞连接起来，从而降低下陷压力（≤主压力）。电磁阀由计算机控制。 图 2B中给出了设置的示意图概述。
请注意，使用此设置，暴跌压力始终等于或小于喷雾气体压力（主压力）。但是，通过在喷嘴上游加入第二个调节器，可以轻松更改设置，从而在低喷气压力下允许更高的俯冲速度。高压（>>2杆）会损坏PDMS喷嘴。
警告：这是一个加压系统，"主要压力"应始终< 7 条。
0.5 和 2 条之间的压力通常用于气动柱塞，并显示压力和速度之间的大致线性关系（在喷雾的垂直位置）。俯冲速度使用示波器测量，与滑动电能计 （10 k？） 连接，并同时与 2 k Ω 电阻器 （图 2C） 连接。电源为电压计提供 9 V 直流。虽然通过设置暴跌压力在实验前设定了近似的暴跌速度，但强力计在实验后给出了速度的精确读数。
喷雾喷嘴和液体乙烷容器 气体动态虚拟喷嘴的制造和操作，用于喷雾样品的输送，已详细描述其他地方15。如上所述，阀门 1-3 的"分配"插座与喷嘴的液体入口相连（图 3A）。加压喷雾气体与喷嘴的气体入口相连。PDMS 喷嘴中的入口非常多，无需配件即可直接使用 0.043" O.D. PE 管。我们的喷嘴设计包含一个"喷射"几何形状，用于混合两个样品，类似于参考18中描述的设备。设计示意图显示在 图3B中，喷嘴的微观图像显示在 图3C中。微流体设备的布局需要使用三个注射器混合两个样品。喷嘴通常位于离网格 1-1.5 厘米的距离（在样品应用期间）。
我们使用液乙烷作为低温源，在用于标准印迹方法的液态乙烷/氮容器中。液态乙烷杯的垂直定位通过实验室提升平台实现。
控制喷雾和网格环境 柱塞和喷雾喷嘴包含在一个定制的PMMA（丙烯酸玻璃）盒与双门（图4A）。箱内的高相对湿度通过 TED 背面的空气加湿系统（图 4B）实现。空气由泵提供，并送入前 10 个罐（通常用于水槽净水下）。罐中装满了低（+5-10厘米）的水，还装有加湿器单元。加湿器的电源由位于丙烯酸玻璃盒内的数字湿度/温度控制器和湿度/温度传感器控制。当相对湿度达到 90% ≥ 时，控制器将关闭泵。第一罐的加湿空气通过扩散器泵送，浸入水中，浸入第二个 10" 罐中，然后进入丙烯酸玻璃盒。
注意事项：由于样品在喷雾喷嘴中具有气溶胶化，因此危险生物或化学标本不适合作为样品。
运行序列 控制软件中的 "运行脚本 "按钮启动"运行"序列。此命令序列可以在脚本文件中预先定义并通过软件更改。此处解释了最重要的变量：
喷雾速度：喷雾速度决定注射器泵使用的液体流速。流速可按以下方式计算：此处使用的注射器泵电机具有固定的步数大小。泵的全系列分为 48，000 步。第二个重要因素是注射器体积。我们通常使用 250 μL 注射器。控制软件中的喷射速度设置为步数/秒。喷雾速度为 1000 步/秒对应于：
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62199/62199eq01.jpg">
喷量：喷量决定要喷洒的总体积。因此，它也决定喷雾的持续时间。控制软件中的喷射音量设置为多个步骤。喷雾量为 2000 步，喷速为 1000 步/秒，喷喷持续时间为 2 秒，总喷量为 10.4 μL。
喷洒前时间：此变量定义了开始喷洒和暴跌之间的时间。重要的是要选择延迟时间，使喷雾有足够的时间稳定之前暴跌的网格。通常，喷雾剂在网格下降之前被给予 1.5 - 4s 以稳定。喷雾一直保持到网格通过。通常，液体流动（因此喷雾）在网格中断后停止 0.5 到 1 s。例如，使用 1000 步/s 的喷雾速度和 2000 步的喷雾量，典型的预喷时间为 1.5 s。
图 5A中显示了一个模范的命令序列，图5B中显示了随着时间的推移的网格位置。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Time resolved device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acrylic glass box</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital humidity/temperature controller</td>
			<td>THE20 digital humidity/temperature controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual rod pneumatic cylinder</td>
			<td>dual rod pneumatic cylinder TN 10x70</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP tubing</td>
			<td>Upchurch Scientific 1/16&#8221; O.D., 0.01&#39;&#39; I.D. FEP tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flangeless fittings</td>
			<td>Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible reinforced PVC tubing</td>
			<td>12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass syringes</td>
			<td>Kloehn 250 &#181;L zero-dead volume</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>humidifier pump</td>
			<td>Interpret Aqua Air AP3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid ethane container</td>
			<td>from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multistage regulator</td>
			<td>GASARC class 3 multistage regulator</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative pressure tweezers</td>
			<td>Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>Hantek 6022BE oscilloscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE tubing</td>
			<td>Scientific Commodities Inc. 0.043&#8221; O.D., 0.015&#8221; I.D. PE tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power supply</td>
			<td>Mean Well GSM160A24-R7B</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power supply</td>
			<td>Wanptek KPS305D power supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU tubing</td>
			<td>SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>regulator</td>
			<td>Norgren R72G-2GK-RMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide potentiometer</td>
			<td>PS100 slide potentiometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solenoid valve</td>
			<td>SMC NVJ314M solenoid valve</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe drive pumps</td>
			<td>Kloehn V6 48K model</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents &#38; Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apoferritin from equine spleen</td>
			<td>Sigma-Aldrich, A3660</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, A2383</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-EM grids</td>
			<td>Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich E3889</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-actin</td>
			<td>Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glow-discharger</td>
			<td>Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, H7006</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAc</td>
			<td>Sigma-Aldrich, P1190</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, M8266</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich, M1254</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, S9888</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal muscle myosin S1</td>
			<td>Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref 1</td>
			<td>Spudich, J. A. &#38; Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref 2</td>
			<td>White, H. &#38; Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy

低温电子显微镜（cryo-EM）领域正在迅速发展，使用新的硬件和处理算法，产生更高的分辨率结构和更具挑战性的系统信息。低温-EM的样品制备正在经历一场类似的革命，正在开发新的方法来取代传统的印迹系统。其中包括使用压电分配器、针头打印和直接喷洒。由于这些发展，网格制备的速度从秒到毫秒，提供了新的机会，特别是在时间解决的低温EM领域，蛋白质和基板可以在暴跌冻结之前快速混合，捕获短寿命的中间状态。在这里，我们详细描述了一个标准协议，用于在内部时间解决的 EM 设备上制作网格，既用于标准快速网格准备，也用于时间解决实验。该协议要求至少 50 μL 样品的浓度为 ≥ 2 毫克/兆升，用于制备 4 个网格。样品应用和冻结之间的延迟可能低至 10 ms。与印迹方法相比，一个限制是以更快的速度增加冰厚。我们希望该协议将帮助其他人设计自己的网格制造设备和那些有兴趣设计时间已解决的实验。

与 TED 的快速网格准备 作为快速网格制备的测试标本，我们使用了马脾的阿波费里汀，在 30 mM HEPES 中为 20 μM，150 mM NaCl，pH 7.5。从参考 15 中描述的 690 个显微图（图 7A）中获得了3.5 + 分辨率的重建。选择脱焦范围，以便在原始图像中轻松识别粒子（图7B）。一个典型的网格，时间延迟为10-40ms显示足够的薄冰区域（<strong...

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Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

在这里，我们提供了一个详细的协议，用于快速网格制作和快速混合和冻结的快速网格制作设备，以进行时间解决的实验。

快速网格准备时间解决低温电子显微镜

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

您好，欢迎收听此 JoVE"视频。我们想向您介绍我们在这里为快速网格制作而建立的设置，这是一项在利兹开发的经过时间解决的研究。请注意，这不是一个标准系统，但我们希望通过向您详细介绍我们所做的所有事情和参数，您将能够在您自己的实验室中开发类似的系统。里士满协议中提供了设备的详细描述。在这里，我们将为快速网格准备和时间解决的 EM 提供分步指南。根据我们的经验，蛋白质浓度应为每毫升或更高两毫克。该协议要求最小体积约50微升。打开设备。然后打开控制 PC 并启动控制软件。通过按每个注射器泵上的初始化按钮，初始化所有注射器泵。打开强力计电源，将其设置为 9 伏特，并启动示波器控制软件。产生喷雾需要加压氮气。打开氮气瓶，将压力设置为 2 条。确保所有注射器泵阀处于负载位置。为此，将所有阀门切换到控制软件中分配，然后返回加载。将所有注射器设置为零。在此阶段，系统中的任何气泡都应被清除。要做到这一点，注射器可能需要拧开，手动去除气泡，当不再包含气泡时，注射器会再次安装。液体处理系统通常储存在水中。在加载样品之前，系统与缓冲器平衡。这是通过用多余的缓冲器清洗管子来完成的。将至少 200 微升缓冲器的管子放在注射器上。管子的顶部必须穿孔才能连接它。使用控制软件使用注射器，吸气适量的缓冲器，在 50 到 100 微升之间。切换阀一以分配。将所有液体都用注射器一体分配。将阀门一返回到负载位置，然后按下注射器一上的初始化按钮，为下一个洗涤周期系统做好准备。这些步骤通常重复三次，以确保彻底清洗管子。接下来，喷嘴被定位。将 EM 网格置于下垂的臂中。将网格放置在喷嘴前。使用控制软件分配缓冲器。如果喷嘴和网格对齐，液体在喷洒后应长时间积聚。如有必要，调整喷嘴位置，然后再次检查液体在网格上积聚的位置。接下来，调整乙烷杯的位置。钳子的尖端应大致到达乙烷杯的中心。执行测试运行以确保所有设置正确。关闭湿度室。确保柱塞的路径清晰。吸气单次运行到注射器中所需的缓冲体积。切换阀一以分配。通过按控软件中的运行开始运行。检查注射器泵一个正在移动，在这种情况下两秒钟，网格在适当的延迟后暴跌，1.5秒在这里。跑步结束后，将柱塞手臂上的压力设置为所需的值。按 OK'in 控制软件以释放从下垂的手臂的压力。现在乙烷杯很酷，充满了液体乙烷。使用前发光放电网格。典型的发光放电在 0.1 毫巴空气中的 10 毫安时为 90 秒。然后，管子与样品平起平准。如果可用的样品量较低，管子可能与只有一个死体积等价。吸气样品。通常死体积约为30微升。切换阀一以分配。通过管子和喷嘴分配样品。然后吸气单次运行所需的样本量。切换阀一以分配。检查相对湿度是否达到预期值。我们通常以 60% 或更高的速度准备网格。这可能需要几分钟的时间。将拿着发光网格的钳子放在下垂的手臂上。将强力计滑动放在起始位置，为速度测量做好准备。设置示波器软件中速度测量的触发器。放置液体乙烷杯，并靠近湿度室。确保柱塞的路径清晰。在控制软件中启动运行。运行完成后，按 OK'in 控制软件以释放从下垂的手臂的压力。打开湿度室，松开手臂和钳子之间的连接。向上移动下垂的手臂，同时保持网格在液体乙烷。然后将网格转移到液氮中并储存起来。保存示波器测量。手动重置强力计滑块和柱塞的位置。重复协议以准备复制网格。时间解决的实验也以类似的方式进行。由于混合步骤中的稀释，需要更高的库存浓度进行时间解决实验。对于时间已解决的实验，请使用所有三个注射器。管子连接到注射器泵和喷嘴。此处使用的微流体喷嘴还包含混合元件。请注意，较长的管子将给出更大的死体积和洗涤平衡步骤需要更多的缓冲和样品。用缓冲器和样品分别对所有注射器进行均衡。通常，注射器一用于样品A'和注射器2和3用于样品B'后，管子是平衡的，加载样品A到注射器一和样品B到注射器二和三。然后，将阀门切换一到三以分配。在控制软件中启动运行。请注意，需要不同的运行脚本进行时间解决的实验。不同的时间延迟可以通过两种方式实现。通过调整柱塞速度，可以更改从混合到冻结的时间延迟。更快的暴跌速度将导致更短的时间延迟。或者，通过调整喷嘴的垂直位置来改变喷雾乙烷距离。增加距离将导致更长的时间延迟。在低放大度的电子显微镜中，典型的网格看起来像这样。如前所述，薄冰区域适合数据采集。在更高的放大倍率下，颗粒应清晰可见。使用 apoferritin 等测试标本，单个网格中相对较小的数据集足以以三到四个安格斯特罗姆分辨率进行重建。对于时间已解决的实验，我们从不同的时间点或网格收集数据集。将数据组合到 3D 分类中，然后将粒子追溯到其时间点是很有用的。这样，数据可以提供有关反应动力学的结构信息和信息。最后，我们希望您喜欢该视频。我们希望，通过 JoVE 论文中的详细描述以及视频，您将能够通过快速网格制作进行自己的实验，这已被证明可以缓解突变造成的一些问题，或帮助在空气-水界面上进行交互，所有你需要进行自己的时间解决研究，尝试并捕获其中一些非平衡状态。所以，快乐网格制作。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

时间分辨电喷雾电离氢氘交换质谱用于研究蛋白质结构与动态

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

科研

生物化学

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

单粒子冷冻电子显微镜在结构中测定脂质敏感分通道 trpc3 的表达与纯化

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

冷冻电子断层扫描 的糖核 酸的准备和冷冻-FIB微加工

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

单颗粒冷冻电子显微镜：从样品到结构

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

微图案透射电子显微镜网格，用于在全细胞冷冻电子断层扫描工作流程中指导细胞定位

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

强大的单颗粒冷冻电子显微镜 （cryo-EM） 处理工作流程，具有冷冻 SPARC、RELION 和 Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

制备与DNA修复因子络合的核小体核心颗粒用于冷冻电镜结构测定

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

从哺乳动物细胞中提取修饰的微管以通过冷冻电子显微镜研究微管 - 蛋白质复合物

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

单层石墨烯在冷冻电子显微镜网格中的应用，用于高分辨率结构测定

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...