Name: fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy at JoVE.com

We willen Molly S.C. Gravett bedanken voor de nuttige discussies en het absl-facilitair personeel voor hulp bij het verzamelen van cryo-EM-gegevens. David P. Klebl is een promovendus op het Wellcome Trust 4-jarige PhD-programma in The Astbury Centre, gefinancierd door de Universiteit van Leeds. De FEI Titan Krios microscopen werden gefinancierd door de Universiteit van Leeds (UoL ABSL award) en Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Dit werk werd gefinancierd door een BBSRC-subsidie aan Stephen P. Muench (BB / P026397 / 1) en ondersteund door onderzoeksbeurzen aan Howard D. White van de American Heart Association (AMR21-236078) en Howard D. White en Vitold Galkin van de Amerikaanse National Institutes of Health (171261).

1. Het systeem voorbereiden
OPMERKING: In het volgende protocol wordt beschreven hoe u rasters van één monster voorbereidt. Gewoonlijk worden voor elk monster of elke toestand minimaal 2 replicatieroosters voorbereid. Voor hogere duiksnelheden (minder dan ~ 20 ms tijdsvertraging), zijn 3 of 4 replicatieroosters meestal voorbereid om rekening te houden met een verminderd aantal dunne ijsgebieden.
<ol><li>Verdun het eiwitmonster tot de doelconcentratie in de gewenste buffer. Doorgaans werken...

<ol>
	<li>Murphy, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotary+substates+of+mitochondrial+ATP+synthase+reveal+the+basis+of+flexible+F1-Fo+coupling.">Rotary substates of mitochondrial ATP synthase reveal the basis of flexible F1-Fo coupling.</a> Science. 364, (2019).</li><li>Benton, D. J., Gamblin, S. J., Rosenthal, P. B., Skehel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+transitions+in+influenza+haemagglutinin+at+membrane+fusion+pH.">Structural transitions in influenza haemagglutinin at membrane fusion pH.</a> Nature. , 1-4 (2020).</li><li>Dance, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motion+on+ice.">Molecular motion on ice.</a> Nature Methods. , 1-5 (2020).</li><li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it.">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> Elife. 8, 42747 (2019).</li><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM.">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nature Methods. 15, 793-795 (2018).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Need+for+speed:+Examining+protein+behaviour+during+cryoEM+grid+preparation+at+different+timescales.">Need for speed: Examining protein behaviour during cryoEM grid preparation at different timescales.</a> BioRxiv. , (2020).</li><li>Ravelli, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structures+from+sub-nl+volumes+using+pin-printing+and+jet+vitrification.">Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification.</a> Nature Communications. 11, 1-9 (2020).</li><li>Arnold, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting-free+and+lossless+cryo-electron+microscopy+grid+preparation+from+nanoliter-sized+protein+samples+and+single-cell+extracts.">Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts.</a> Journal of Structural Biology. 197, 220-226 (2017).</li><li>Razinkov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+vitrifying+samples+for+cryoEM.">A new method for vitrifying samples for cryoEM.</a> Journal of Structural Biology. 195, 190-198 (2016).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+and+effective+microfluidic+spraying-plunging+method+for+high-resolution+single-particle+cryo-EM.">A fast and effective microfluidic spraying-plunging method for high-resolution single-particle cryo-EM.</a> Structure. 25, 663-670 (2017).</li><li>Ashtiani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+femtolitre+droplets+using+surface+acoustic+wave+based+atomisation+for+cryo-EM+grid+preparation.">Delivery of femtolitre droplets using surface acoustic wave based atomisation for cryo-EM grid preparation.</a> Journal of Structural Biology. 203, 94-101 (2018).</li><li>Rubinstein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shake-it-off:+a+simple+ultrasonic+cryo-EM+specimen-preparation+device.">Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75, (2019).</li><li>M&#228;eots, M. -. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+microfluidics+enables+kinetic+insight+from+time-resolved+cryo-EM.">Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM.</a> Nature Communications. 11, 1-14 (2020).</li><li>Kontziampasis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-EM+grid+preparation+device+for+time-resolved+structural+studies.">A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies.</a> IUCrJ. 6, (2019).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+deposition+onto+cryo-EM+grids:+from+sprays+to+jets+and+back.">Sample deposition onto cryo-EM grids: from sprays to jets and back.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 76, (2020).</li><li>White, H., Thirumurugan, K., Walker, M., Trinick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+generation+apparatus+for+time-resolved+electron+cryo-microscopy+using+stepper+motors+and+electrospray.">A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray.</a> Journal of Structural Biology. 144, 246-252 (2003).</li><li>Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Complex Assembly. , 59-71 (2018).</li><li>Trebbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+liquid+jet+system+with+compatibility+for+atmospheric+and+high-vacuum+conditions.">Microfluidic liquid jet system with compatibility for atmospheric and high-vacuum conditions.</a> Lab on a Chip. 14, 1733-1745 (2014).</li><li>Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-grid+and+in-flow+mixing+for+time-resolved+Cryo-EM.">On-grid and in-flow mixing for time-resolved Cryo-EM.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2021).</li><li>He, S., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+reconstruction+in+RELION.">Helical reconstruction in RELION.</a> Journal of Structural Biology. 198, 163-176 (2017).</li><li>Millar, N. C., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limiting+rate+of+the+ATP-mediated+dissociation+of+actin+from+rabbit+skeletal+muscle+myosin+subfragment+1.">The limiting rate of the ATP-mediated dissociation of actin from rabbit skeletal muscle myosin subfragment 1.</a> FEBS Letters. 160, 141-148 (1983).</li><li>Kasas, S., Dumas, G., Dietler, G., Catsicas, S., Adrian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+cryoelectron+microscopy+specimens+revealed+by+high-speed+photographic+imaging.">Vitrification of cryoelectron microscopy specimens revealed by high-speed photographic imaging.</a> Journal of Microscopy. 211, 48-53 (2003).</li><li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defocus-dependent+Thon-ring+fading.">Defocus-dependent Thon-ring fading.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Bagshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+flow+kinetics.">A beginner's guide to flow kinetics.</a> The Biochemist. 42, (2020).</li></ol>

De protocollen in dit werk kunnen worden gebruikt voor snelle netvoorbereiding door direct spuiten en TrEM-experimenten. Snelle rastervoorbereiding kan worden gebruikt om deeltjesinteracties met de luchtwaterinterface te verminderen5. De belangrijkste beperkingen zijn de beschikbare monsterconcentratie en ijsdikte op het rooster. Binnen deze grenzen en mits de monsterkwaliteit goed is, produceert het protocol roosters die geschikt zijn voor hoge resolutie cryo-EM.
<stro...

Achtergrond Recente ontwikkelingen in cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) hebben structurele studies van steeds complexere systemen met hoge resolutie mogelijk gemaakt. Op enkele uitzonderingen na zijn dergelijke studies beperkt tot biologische macromoleculen bij evenwicht1 of relatief langzame reacties2. Veel processen in vivo vinden plaats op een snellere tijdschaal (milliseconden) en er is een toenemende belangstelling voor time-resolved cryo-EM (TrEM) op deze tijdschalen3. Conventionele cryo-EM-monstervoorbereiding door de blotting-methode is echter te traag voor milliseconde TrEM.
De blotting-methode heeft andere beperkingen dan een slechte tijdresolutie. Eiwitten en eiwitcomplexen kunnen last hebben van denaturatie of voorkeursoriëntatie op roosters4. Het is aangetoond dat het verminderen van de blootstellingstijd aan de lucht-waterinterface tijdens de monstervoorbereiding de voorkeursoriëntatie en eiwitdenaturatievermindert 5,6. Een snelle netvoorbereiding maakt dus niet alleen milliseconde TrEM mogelijk, maar kan ook de netkwaliteit verbeteren.
Momenteel zijn er drie verschillende benaderingen voor geautomatiseerde netvoorbereiding. De eerste benadering maakt gebruik van een pin of capillair dat een kleine hoeveelheid monster bevat. Na het vaststellen van contact tussen de vloeistof en het rasteroppervlak, wordt het monster 'geschreven' op het raster7,8. Het aanvraagproces van het monster is relatief traag en duurt enkele seconden. Een alternatieve aanpak maakt gebruik van gecontroleerde druppelgeneratie door een piëzo-dispenser en zelfafvoerende roosters9. Dit maakt een snellere afgifte mogelijk om de tijden te bevriezen, maar wordt nog steeds beperkt door druppel- en afvoersnelheid (momenteel 54 ms bereiken). De snelste aanpak tot nu toe is de directe spuitbenadering, waarbij het monster wordt verneveld in een sproeikop en de kleine (~ 10 - 20 μm) en snelle (> 5 m/s) druppeltjes zich verspreiden bij contact met het cryo-EM-rooster. De monsterspray kan op verschillende manieren worden gegenereerd, zoals luchtstraalverstuivers, akoestische oppervlaktegolven of ultrasone luchtbevochtigers10,11,12,13. In onze ervaring is de ijsdikte met de directe spuitbenadering groter, maar direct spuiten maakt het mogelijk om de sproeitijden < 10 ms te bevriezen.
Dit protocol beschrijft stap voor stap hoe een time-resolved EM-apparaat (TED) uitgerust met een microfluïdische sproeikop kan worden gebruikt om roosters voor te bereiden op een snelle tijdschaal14,15. Het apparaat is gebruikt om roosters voor te bereiden met een minimale vertragingstijd van 6 ms tussen het aanbrengen van het monster en het invriezen en om snel twee monsters te mengen en in te vriezen. Het ontwerp van de TED is gebaseerd op een eerdere versie16 en is vergelijkbaar met andere op spray gebaseerde tijd-opgeloste cryo-EM-apparaten17.
Eerst worden de vier belangrijkste onderdelen van de TED-opstelling beschreven. De kern van de TED is de vloeistofbehandelingseenheid, die verantwoordelijk is voor monsteraspiratie en -afgifte. Een pneumatische plunjer verplaatst het rooster door de spray naar het vloeibare ethaan. Generatie van de spray wordt bereikt met microfluïdische sproeikoppen en het invriezen gebeurt in een vloeibare ethaancontainer, die kort worden beschreven. Ten slotte worden de extra functies om de rasteromgeving te regelen, met name de luchtvochtigheid, benadrukt. Dit wordt gevolgd door gedetailleerde protocollen voor de werking van het apparaat en voor het uitvoeren van TrEM-experimenten. Representatieve resultaten worden gegeven voor een snelle rastervoorbereiding en een eenvoudig TrEM-experiment.
Experimentele installatie
De vloeistofbehandelingseenheid Het vloeistofbehandelingssysteem van de TED wordt gevormd door drie spuitaangedreven pompen ('pompen 1 - 3'), elk uitgerust met een roterende klep(figuur 1). Een voeding voorziet pompen 1 - 3 van 24 V DC. Communicatie met de besturingssoftware (geschreven in Visual Basic en C++) verloopt via een RS232-interface naar pomp 1. Commando's worden verdeeld via de seriële I/O-uitbreidingspoorten van pomp 1 tot pompen 2-3. Pompen 1-3 zijn uitgerust met glazen spuiten ('spuiten 1-3', we gebruiken hier spuiten met een dood volume van 250 μL/nul dood volume). Elke klep heeft twee standen, 'load' en 'dispense'. De 'load'-positie wordt gebruikt om monster in de spuit te zuigen. Een kort stuk (~ 3 - 4 cm) van 1/16" O.D., 0.01′′ I.D. FEP-buizen is via ETFE/ETFE flensloze fittingen verbonden met de 'load'-positie van kleppen 1-3. Dit korte stukje buis reikt tot in het monsterreservoir (meestal een plastic buis van 1,5 ml of 0,5 ml). De 'dispense'-positie leidt naar de sproeikop. Verbinding tussen de 'dispense' uitlaat en de sproeikop wordt gemaakt door PE-buizen (~ 20-30 cm lengte, 0,043" O.D., 0,015" I.D.), met een kort stuk mouwbuis (~ 0,5 cm) en ETFE/ETFE flensloze fittingen.
De pneumatische plunjer De TED gebruikt een pneumatische plunjer om het rooster te versnellen en door de monsterspray in de vloeibare ethaancontainer te verplaatsen. Onderdrukpincet houdt het rooster vast, geschroefd in een zelfgebouwde houder die is gemonteerd op een dubbele stang pneumatische cilinder(figuur 2A).
Druk wordt geleverd door een grote stikstofgasfles (maat W), uitgerust met een meertrapsregelaar (0 - 10 bar, 'hoofddruk'). Flexibele versterkte PVC-buizen (12 mm O.D.) verbinden de regelaar met een 12-poorts spruitstuk waar stikstof onder druk wordt afgeleverd bij het mondstuk en de pneumatische plunjer. De gasstroom door het mondstuk is constant, direct geregeld bij de stikstofcilinder (hoofddruk). De aansluiting op het mondstuk is gemaakt met PU-buizen (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.), een kort stuk PE-buis (~ 8 cm lengte, 0,043" O.D., 0,015" I.D.) en geschikte connectoren. De druk op de pneumatische plunjer wordt geregeld door een magneetventiel. PU-buizen (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.) verbinden de magneetklep met een regelaar en de pneumatische plunjer, om een verminderde duikdruk (≤ hoofddruk) mogelijk te maken. Het magneetventiel is computergestuurd. Een schematisch overzicht van de opstelling wordt gegeven in figuur 2B.
Merk op dat bij deze opstelling de duikdruk altijd gelijk is aan of kleiner is dan de sproeigasdruk (hoofddruk). De opstelling kan echter eenvoudig worden gewijzigd door een tweede regelaar stroomopwaarts van de sproeikop op te nemen om hogere duiksnelheden bij lage sproeigasdruk mogelijk te maken. Hoge drukken (>> 2 bar) kunnen de PDMS-sproeikop beschadigen.
LET OP: Dit is een druksysteem en de 'hoofddruk' moet altijd < 7 bar zijn.
Drukken tussen 0,5 en 2 bar worden meestal gebruikt voor de pneumatische plunjer en vertonen een ongeveer lineaire relatie tussen druk en snelheid (op de verticale positie van de spray). Duiksnelheden worden gemeten met een oscilloscoop, verbonden in lijn met een schuifpotentiometer (10 kΩ) en parallel met een weerstand van 2 kΩ(figuur 2C). Een voeding voorziet de potentiometer van 9 V DC. Terwijl de geschatte duiksnelheid voorafgaand aan het experiment wordt ingesteld door de duikdruk in te stellen, geeft de potentiometer een nauwkeurige uitlezing van de snelheid na het experiment.
Sproeikoppen en vloeibare ethaan container De fabricage en werking van gasdynamische virtuele nozzles voor monsterafgifte op basis van sproeien is elders in detail beschreven15. Zoals hierboven beschreven, zijn de 'dispense' uitgangen van kleppen 1-3 verbonden met de vloeistofinlaten van het mondstuk(figuur 3A). Het sproeigas onder druk is aangesloten op de gasinlaat van het mondstuk. De inlaten in de PDMS-sproeikoppen zijn zodanig dat 0,043" O.D. PE-buizen direct kunnen worden gebruikt zonder dat fittingen nodig zijn. Ons nozzle-ontwerp bevat een 'jet-in-jet'-geometrie voor het mengen van twee monsters, vergelijkbaar met het apparaat beschreven in ref.18. Een schema van het ontwerp wordt weergegeven in figuur 3B,een microscopisch beeld van een mondstuk wordt weergegeven in figuur 3C. De lay-out van het microfluïdische apparaat vereist het gebruik van drie spuiten om twee monsters te mengen. De sproeikop wordt meestal op 1-1,5 cm afstand van het rooster geplaatst (tijdens het aanbrengen van het monster).
We gebruiken vloeibaar ethaan als cryogeen, in een vloeibare ethaan/stikstof container zoals gebruikt voor de standaard blotting methode. Verticale positionering van de vloeibare ethaanbeker wordt bereikt met een laboratoriumhefplatform.
Controle van de spuit- en roosteromgeving De plunjer en sproeikop bevinden zich in een op maat gemaakte PMMA (acrylglas) doos met een dubbele deur(figuur 4A). Een hoge relatieve vochtigheid in de doos wordt bereikt door een luchtbevochtigingssysteem aan de achterkant van de TED(figuur 4B). Lucht wordt geleverd door een pomp en gevoerd in een eerste 10 "bus (meestal gebruikt voor waterzuivering onder de gootsteen). De bus is gevuld met een laag (~ 5-10 cm) waterniveau en herbergt ook een luchtbevochtiger. De netvoeding naar de luchtbevochtiger wordt geregeld door een digitale vochtigheids-/temperatuurregelaar en een vochtigheids-/temperatuursensor in de acrylglasdoos. De regelaar is ingesteld om de pomp uit te schakelen wanneer de relatieve vochtigheid ≥ 90% bereikt. Bevochtigde lucht uit de eerste bus wordt door een diffuser gepompt, ondergedompeld in water in een tweede 10 "-bus en komt vervolgens in de acrylglasdoos.
LET OP: Omdat het monster in de sproeikop is verneveld, zijn gevaarlijke biologische of chemische monsters niet geschikt als monsters.
De loopvolgorde Met de knop Script uitvoeren in de besturingssoftware wordt de reeks uitgevoerd. Deze reeks opdrachten kan vooraf worden gedefinieerd in een scriptbestand en worden gewijzigd via de software. De belangrijkste variabelen worden hier uitgelegd:
Spuitsnelheid: De spuitsnelheid bepaalt het vloeistofdebiet dat door de spuitpomp wordt gebruikt. Het debiet kan als volgt worden berekend: De hier gebruikte spuitpompmotoren hebben een vaste stapgrootte. Het volledige bereik van de pomp is verdeeld in 48.000 stappen. De tweede belangrijke factor is het spuitvolume. We gebruiken meestal spuiten van 250 μL. De spuitsnelheid in de besturingssoftware wordt ingesteld op aantal stappen per seconde. Een spuitsnelheid van 1000 stappen/seconde komt overeen met:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62199/62199eq01.jpg">
Spuitvolume: Het spuitvolume bepaalt het totale te spuiten volume. Het bepaalt dus ook de duur van de spray. Het spuitvolume in de besturingssoftware is ingesteld als een aantal stappen. Een spuitvolume van 2000 stappen, bij een spuitsnelheid van 1000 stappen/seconde, leidt tot een spuitduur van 2 s en een totaal volume van 10,4 μL.
Pre-spray tijd: Deze variabele definieert de tijd tussen het starten van de spray en het duiken. Het is belangrijk om de vertragingstijd zodanig te kiezen dat de spray voldoende tijd heeft om te stabiliseren voordat het rooster wordt gezonken. Meestal wordt de spray 1,5 - 4 s gegeven om te stabiliseren voordat het rooster wordt ondergedompeld. De spray wordt gehandhaafd totdat het rooster is doorgetrokken. Meestal wordt de vloeistofstroom (en dus de spray) 0,5 tot 1 s gestopt nadat het rooster is ondergedompeld. Met een spuitsnelheid van 1000 stappen/s en een spuitvolume van 2000 stappen is een typische voorspuittijd bijvoorbeeld 1,5 s.
Een voorbeeldige reeks opdrachten wordt weergegeven in figuur 5A, de rasterpositie in de loop van de tijd wordt geïllustreerd in figuur 5B.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Time resolved device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acrylic glass box</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital humidity/temperature controller</td>
			<td>THE20 digital humidity/temperature controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual rod pneumatic cylinder</td>
			<td>dual rod pneumatic cylinder TN 10x70</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP tubing</td>
			<td>Upchurch Scientific 1/16&#8221; O.D., 0.01&#39;&#39; I.D. FEP tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flangeless fittings</td>
			<td>Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible reinforced PVC tubing</td>
			<td>12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass syringes</td>
			<td>Kloehn 250 &#181;L zero-dead volume</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>humidifier pump</td>
			<td>Interpret Aqua Air AP3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid ethane container</td>
			<td>from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multistage regulator</td>
			<td>GASARC class 3 multistage regulator</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative pressure tweezers</td>
			<td>Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>Hantek 6022BE oscilloscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE tubing</td>
			<td>Scientific Commodities Inc. 0.043&#8221; O.D., 0.015&#8221; I.D. PE tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power supply</td>
			<td>Mean Well GSM160A24-R7B</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power supply</td>
			<td>Wanptek KPS305D power supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU tubing</td>
			<td>SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>regulator</td>
			<td>Norgren R72G-2GK-RMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide potentiometer</td>
			<td>PS100 slide potentiometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solenoid valve</td>
			<td>SMC NVJ314M solenoid valve</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe drive pumps</td>
			<td>Kloehn V6 48K model</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents &#38; Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apoferritin from equine spleen</td>
			<td>Sigma-Aldrich, A3660</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, A2383</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-EM grids</td>
			<td>Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich E3889</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-actin</td>
			<td>Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glow-discharger</td>
			<td>Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, H7006</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAc</td>
			<td>Sigma-Aldrich, P1190</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, M8266</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich, M1254</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, S9888</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal muscle myosin S1</td>
			<td>Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref 1</td>
			<td>Spudich, J. A. &#38; Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref 2</td>
			<td>White, H. &#38; Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy

Het gebied van cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) ontwikkelt zich snel met nieuwe hardware en verwerkingsalgoritmen, waardoor structuren met een hogere resolutie en informatie over meer uitdagende systemen worden geproduceerd. Monstervoorbereiding voor cryo-EM ondergaat een vergelijkbare revolutie met nieuwe benaderingen die worden ontwikkeld om de traditionele blotting-systemen te vervangen. Deze omvatten het gebruik van piëzo-elektrische dispensers, pinprinten en direct spuiten. Als gevolg van deze ontwikkelingen gaat de snelheid van de netvoorbereiding van seconden naar milliseconden, wat nieuwe kansen biedt, vooral op het gebied van tijd-opgeloste cryo-EM, waar eiwitten en substraten snel kunnen worden gemengd voordat ze bevriezen, waardoor kortlevende tussentoestanden worden opgevangen. Hier beschrijven we in detail een standaardprotocol voor het maken van rasters op ons interne tijd-opgeloste EM-apparaat, zowel voor standaard snelle netvoorbereiding als voor tijd-opgeloste experimenten. Het protocol vereist een monster van minimaal ongeveer 50 μL bij concentraties van ≥ 2 mg / ml voor de voorbereiding van 4 roosters. De vertraging tussen het aanbrengen van het monster en het invriezen kan zo laag zijn als 10 ms. Een beperking is een verhoogde ijsdikte bij hogere snelheden en in vergelijking met de blotting-methode. We hopen dat dit protocol anderen zal helpen bij het ontwerpen van hun eigen apparaten voor het maken van rasters en degenen die geïnteresseerd zijn in het ontwerpen van tijd-opgeloste experimenten.

Snelle netvoorbereiding met de TED Als testmonster voor snelle rastervoorbereiding hebben we apoferritine uit paardenpleet gebruikt bij 20 μM in 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5. Een reconstructie met een resolutie van 3,5 Å werd verkregen uit 690 micrografieën zoals beschreven in ref.15 (Figuur 7A). Het onscherptebereik is zo gekozen dat deeltjes gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd in de onbewerkte afbeeldingen (figu...

Watch this Scientific Journal Video about Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy at JoVE.com

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het gebruik van een apparaat voor het maken van snel rasters voor zowel snelle rasters als voor snel mengen en invriezen om tijd-opgeloste experimenten uit te voeren.

Snelle rastervoorbereiding voor tijd-opgeloste cryo-elektronenmicroscopie

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Hallo, en welkom bij deze JoVE"video. We willen u kennis laten maken met de opstelling die we hier hebben voor het snel maken van rasters, een tijdsopoeende studie die we in Leeds aan het ontwikkelen zijn. Houd er rekening mee dat dit geen standaardsysteem is, maar we hopen dat door u een gedetailleerd overzicht te geven van alle dingen en de parameters die we doen, u in staat zult zijn om vergelijkbare systemen in uw eigen laboratoria te ontwikkelen.Een gedetailleerde beschrijving van het apparaat wordt gegeven in het Richmond-protocol. Hier gaan we een stapsgewijze handleiding geven voor snelle netvoorbereiding en tijd-opgeloste EM. In onze ervaring zou de eiwitconcentratie twee milligram per milliliter of hoger moeten zijn. Het protocol vereist een minimumvolume van ongeveer 50 microliter.Schakel het apparaat in. Schakel vervolgens de besturings-pc in en start de besturingssoftware. Initialiseer alle spuitpompen door op de initialiseerknop op elke spuitpomp te drukken.Schakel de voeding van de potentiometer in, stel deze in op negen volt en start de oscilloscoopbesturingssoftware. Stikstofgas onder druk is nodig om de spray te genereren. Open de stikstofcilinder en stel de druk in op 2 bar.Zorg ervoor dat alle spuitpompkleppen in de belastingspositie staan. Om dit te doen, schakelt u alle kleppen om in de besturingssoftware te dispense en vervolgens terug om te laden. Zet alle spuiten op nul.Alle luchtbellen in het systeem moeten in dit stadium worden verwijderd. Om dit te doen, moeten de spuiten mogelijk worden losgeschroefd, bubbels handmatig worden verwijderd en de spuiten opnieuw worden gemonteerd wanneer ze geen bubbels meer bevatten. Het vloeistofbehandelingssysteem wordt meestal opgeslagen in water.Voordat het monster wordt geladen, wordt het systeem in evenwicht met buffer. Dit gebeurt door de slang te wassen met een teveel aan buffer. Plaats een buis met ten minste 200 microliter buffer op spuit één.De bovenkant van de buis moet worden doorboord om deze te bevestigen. Aspirateer een geschikte hoeveelheid buffer, tussen de 50 en honderd microliter met spuit één met behulp van de besturingssoftware. Schakelklep één om af te geven.Spuit alle vloeistof in spuit één. Terugslagklep één naar de laadpositie en druk op de initialiseerknop op spuit één om het systeem voor te bereiden op de volgende wascyclus. Deze stappen worden meestal drie keer herhaald om een grondige wassing van de slang te garanderen.Vervolgens wordt de sproeikop geplaatst. Plaats een EM-rooster in de stortarm. Plaats het rooster voor de sproeikop.Dispense buffer met behulp van de besturingssoftware. Als mondstuk en rooster zijn uitgelijnd, moet vloeistof zich ophopen na het spuiten gedurende een langere periode. Pas indien nodig de positie van het mondstuk aan en controleer vervolgens opnieuw waar de vloeistof zich ophoopt op het rooster.Pas vervolgens de positie van de ethaanbeker aan. De punt van het pincet moet ongeveer tot het midden van de ethaanbeker reiken. Voer een testrun uit om er zeker van te zijn dat alle instellingen correct zijn.Sluit de vochtigheidskamer. Zorg ervoor dat het pad van de zuiger vrij is. Aspirateer het volume buffer dat nodig is voor een enkele run in spuit één.Schakelklep één om af te geven. Start de run door in de besturingssoftware op run'te drukken. Controleer of spuitpomp één beweegt, twee seconden in dit geval, en het rooster wordt na een passende vertraging, 1,5 seconden hier, gedompeld.Wanneer de run is voltooid, stelt u de druk op de plunjerarm in op de gewenste waarde. Druk op OK' in de besturingssoftware om de druk van de stortarm los te laten. Nu is de ethaanbeker koel en gevuld met vloeibaar ethaan.Gloeiend de roosters voor gebruik. Een typische gloei-ontlading is 90 seconden bij 10 milliamps in 0,1 millibar lucht. De slang wordt vervolgens in evenwicht met het monster.Als het beschikbare monstervolume laag is, mag de buis worden gekalibreerd met slechts één dood volume. Aspiraat monster. Meestal is het dode volume ongeveer 30 microliter.Schakelklep één om af te geven. Dispenseer het monster door middel van slangen en mondstuk. Aspirateer vervolgens de hoeveelheid monster die nodig is voor een enkele run.Schakelklep één om af te geven. Controleer of de relatieve vochtigheid de gewenste waarde heeft bereikt. We bereiden meestal roosters voor op 60% of hoger.Dit kan enkele minuten duren. Plaats het pincet met een gloeiend rooster in de stortarm. Plaats de potentiometerschuif in de startpositie, klaar voor snelheidsmeting.Stel de trigger voor de snelheidsmeting in de oscilloscoopsoftware in. Plaats de vloeibare ethaanbeker en dicht bij de vochtkamer. Zorg ervoor dat het pad van de zuiger vrij is.Start de run in de besturingssoftware. Wanneer de run is voltooid, drukt u op OK'in de besturingssoftware om de druk van de stortarm te verwijderen. Open de vochtigheidskamer, maak de verbinding tussen de plunging arm en pincet los.Beweeg de plunging arm omhoog terwijl je het rooster in vloeibaar ethaan houdt. Breng vervolgens de roosters over naar vloeibare stikstof en in opslag. Sla de oscilloscoopmeting op.Stel de positie van de potentiometerschuifregelaar en zuiger handmatig opnieuw in. Herhaal het protocol om replicatierasters voor te bereiden. Tijd-opgeloste experimenten worden op een vergelijkbare manier gedaan.Hogere voorraadconcentraties zijn nodig voor tijdsopoeende experimenten vanwege verdunning in de mengstap. Gebruik voor een tijdsgeo opgelost experiment alle drie de spuiten. Slangen worden bevestigd aan de spuitpompen en aan de sproeikop.De hier gebruikte microfluïdische sproeikop bevat ook een mengelement. Merk op dat langere buizen een groter dood volume geven en dat de evenwichtsstappen van het wassen meer buffer en monster vereisen. Alle spuiten met buffer en monster afzonderlijk in evenwicht houden.Doorgaans wordt spuit één gebruikt voor monster A' en spuiten twee en drie worden gebruikt voor monster B'Nadat de slang in evenwicht is gebracht, laadt u monster A in spuit één en monster B in spuiten twee en drie. Schakel vervolgens de kleppen één tot drie om af te geven. Start de run in de besturingssoftware.Houd er rekening mee dat een ander uitgevoerd script nodig is voor een experiment met een tijdsverholpen experiment. Verschillende tijdsvertragingen kunnen op twee manieren worden bereikt. Door de zuigersnelheid aan te passen, kan de tijdsvertraging van mengen tot invriezen worden gewijzigd.Een hogere duiksnelheid zal leiden tot een kortere tijdsvertraging. Als alternatief wordt de spuitethaanafstand gewijzigd door de verticale positie van de sproeikop aan te passen. Het vergroten van de afstand zal resulteren in een langere tijdsvertraging.In de elektronenmicroscoop bij lage vergroting ziet een typisch raster er als volgt uit. Gebieden met dun ijs, zoals aangegeven, zijn geschikt voor data-acquisitie. Bij hogere vergrotingen moeten deeltjes duidelijk zichtbaar zijn.Bij een testexemplaar zoals apoferritine is een relatief kleine dataset van een enkel raster voldoende voor een reconstructie met een resolutie van drie tot vier angstrom. Voor tijdsopoekende experimenten verzamelen we datasets van verschillende tijdspunten of rasters. Het is handig om de gegevens voor 3D-classificatie te combineren en vervolgens deeltjes terug te traceren naar hun tijdspunten.Op deze manier kunnen de gegevens structurele informatie en informatie over de reactiekinetiek opleveren. Tot slot hopen we dat je genoten hebt van de video. We hopen dat je met de gedetailleerde beschrijvingen in het JoVE-artikel samen met de video je eigen experimenten kunt uitvoeren via snelle rasters, waarvan is aangetoond dat het enkele van de problemen van mutatie verlicht of helpt bij interacties op de lucht-waterinterface, alles wat je nodig hebt voor het uitvoeren van je eigen tijd-opgeloste studies om te proberen enkele van die niet-evenwichtstoestanden te vangen.Happy grid making dus.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Meningsuiting en zuivering van de TRPC3 mens lipide-gevoelige catie kanaal voor structurele bepaling door Single-deeltje Cryo-elektronenmicroscopie

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Bereiding en Cryo-FIB microbewerking van Saccharomyces cerevisiae voor Cryo-Elektronen Tomografie

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Cryo-elektronenmicroscopie met enkele deeltjes: van monster tot structuur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Micropatterning Transmissie ElektronenMicroscopie Grids naar Direct Cell Positioning binnen Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Een robuuste cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) verwerkingsworkflow met één deeltje met cryoSPARC, RELION en Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Voorbereiding van nucleosoomkerndeeltjes gecomplexeerd met DNA-reparatiefactoren voor cryo-elektronenmicroscopie structurele bepaling

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Het extraheren van gemodificeerde microtubuli uit zoogdiercellen om microtubuli-eiwitcomplexen te bestuderen door cryo-elektronenmicroscopie

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Toepassing van monolaag grafeen op cryo-elektronenmicroscopieroosters voor structuurbepaling met hoge resolutie

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...