Name: fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy at JoVE.com

Wir danken Molly S.C. Gravett für hilfreiche Gespräche und den Mitarbeitern der ABSL-Einrichtung für die Hilfe bei der Kryo-EM-Datenerfassung. David P. Klebl ist Doktorand des 4-jährigen Wellcome Trust PhD-Programms im Astbury Centre, das von der University of Leeds finanziert wird. Die FEI Titan Krios Mikroskope wurden von der University of Leeds (UoL ABSL Award) und Wellcome Trust (108466/Z/15/Z) finanziert. Diese Arbeit wurde durch ein BBSRC-Stipendium an Stephen P. Muench (BB/P026397/1) und durch Forschungsstipendien an Howard D. White von der American Heart Association (AMR21-236078) und Howard D. White und Vitold Galkin von den US-amerikanischen National Institutes of Health (171261) unterstützt.

1. Vorbereitung des Systems
HINWEIS: Das folgende Protokoll beschreibt, wie Raster einer einzelnen Probe vorbereitet werden. Normalerweise werden mindestens 2 Replikatgitter für jede Probe oder Bedingung vorbereitet. Für schnellere Tauchgeschwindigkeiten (weniger als ~ 20 ms Zeitverzögerung) sind 3 oder 4 Replikatgitter in der Regel so vorbereitet, dass sie eine reduzierte Anzahl dünner Eisflächen berücksichtigen.
<ol><li>Verdünnen Sie die Proteinprobe auf die Zielkonzentration im gew...

<ol>
	<li>Murphy, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotary+substates+of+mitochondrial+ATP+synthase+reveal+the+basis+of+flexible+F1-Fo+coupling.">Rotary substates of mitochondrial ATP synthase reveal the basis of flexible F1-Fo coupling.</a> Science. 364, (2019).</li><li>Benton, D. J., Gamblin, S. J., Rosenthal, P. B., Skehel, J. 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Die Protokolle in dieser Arbeit können für eine schnelle Gittervorbereitung durch direktes Sprühen und TrEM-Experimente verwendet werden. Die schnelle Gittervorbereitung kann verwendet werden, um Partikelwechselwirkungen mit der Luftwasserschnittstelle zu reduzieren5. Die Haupteinschränkungen sind die verfügbare Probenkonzentration und die Eisdicke auf dem Gitter. Innerhalb dieser Grenzen und unter der Voraussetzung, dass die Probenqualität gut ist, erzeugt das Protokoll Gitter, die für hoc...

Hintergrund Jüngste Entwicklungen in der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) haben Strukturstudien von immer komplexeren Systemen mit hoher Auflösung ermöglicht. Mit wenigen Ausnahmen beschränkten sich solche Studien auf biologische Makromoleküle im Gleichgewicht1 oder relativ langsame Reaktionen2. Viele Prozesse in vivo laufen auf einer schnelleren Zeitskala (Millisekunden) ab und es besteht ein zunehmendes Interesse an zeitaufgelöster Kryo-EM (TrEM) auf diesen Zeitskalen3. Die herkömmliche Kryo-EM-Probenvorbereitung durch die Blotting-Methode ist jedoch zu langsam für Millisekunden-TrEM.
Die Blotting-Methode hat neben der schlechten Zeitauflösung noch andere Einschränkungen. Proteine und Proteinkomplexe können unter Denaturierung oder bevorzugter Orientierung auf Gitternleiden 4. Es hat sich gezeigt, dass die Verringerung der Expositionszeit gegenüber der Luft-Wasser-Grenzfläche während der Probenvorbereitung die bevorzugte Orientierung und Proteindenaturierung verringert5,6. So ermöglicht eine schnelle Netzvorbereitung nicht nur Millisekunden-TrEM, sondern kann auch die Netzqualität verbessern.
Derzeit gibt es drei verschiedene Ansätze zur automatisierten Netzvorbereitung. Der erste Ansatz verwendet einen Stift oder eine Kapillare, die eine kleine Menge an Probe enthält. Nach der Herstellung des Kontakts zwischen der Flüssigkeit und der Gitteroberfläche wird die Probe auf das Gitter7,8"geschrieben". Der Beispielantragsprozess ist relativ langsam und dauert einige Sekunden. Ein alternativer Ansatz verwendet die kontrollierte Tröpfchenerzeugung durch einen Piezospender und selbstableitende Gitter9. Dies ermöglicht schnellere Dosier- bis Gefrierzeiten, ist aber immer noch durch Tröpfchen- und Dochtgeschwindigkeit begrenzt (derzeit 54 ms). Der bisher schnellste Ansatz ist der direkte Sprühansatz, bei dem die Probe in einer Sprühdüse zerstäubt wird und sich die kleinen (~ 10 - 20 μm) und schnellen (> 5 m/s) Tröpfchen bei Kontakt mit dem Kryo-EM-Gitter ausbreiten. Das Probenspray kann auf verschiedene Arten wie Luftstrahlzerstäuber, oberflächenakustische Wellen oder Ultraschallbefeuchter10 , 11,12,13erzeugt werden. Nach unserer Erfahrung ist die Eisdicke beim direkten Sprühansatz größer, aber das direkte Sprühen ermöglicht das Dosieren gefrieren < 10 ms.
Dieses Protokoll beschreibt Schritt für Schritt, wie ein zeitaufgelöstes EM-Gerät (TED), das mit einer mikrofluidischen Sprühdüse ausgestattet ist, verwendet werden kann, um Gitter auf einer schnellen Zeitskalavorzubereiten 14,15. Das Gerät wurde verwendet, um Gitter mit einer minimalen Verzögerungszeit von 6 ms zwischen Probenanwendung und Einfrieren vorzubereiten und zwei Proben schnell zu mischen und einzufrieren. Das Design des TED basiert auf einer Vorgängerversion16 und ähnelt anderen sprühbasierten zeitaufgelösten Kryo-EM-Geräten17.
Zunächst werden die vier Hauptteile des TED-Setups beschrieben. Das Herzstück des TED ist die Liquid Handling Unit, die für die Probenabsaugung und -dosierung zuständig ist. Ein pneumatischer Kolben bewegt das Gitter durch das Spray in das flüssige Ethan. Die Erzeugung des Sprays erfolgt mit mikrofluidischen Sprühdüsen und das Einfrieren erfolgt in einem flüssigen Ethanbehälter, die kurz beschrieben werden. Schließlich werden die zusätzlichen Funktionen zur Steuerung der Netzumgebung, insbesondere der Luftfeuchtigkeit, hervorgehoben. Es folgen detaillierte Protokolle für den Betrieb des Gerätes und für die Durchführung von TrEM-Experimenten. Repräsentative Ergebnisse werden für eine schnelle Netzvorbereitung und ein einfaches TrEM-Experiment gegeben.
Versuchsaufbau
Die Liquid-Handling-Einheit Das Liquid-Handling-System des TED besteht aus drei Spritzenantriebspumpen ("Pumpen 1 - 3"), die jeweils mit einer Zellenradschleuse ausgestattet sind (Abbildung 1). Ein Netzteil versorgt die Pumpen 1 - 3 mit 24 V DC. Die Kommunikation mit der Steuerungssoftware (geschrieben in Visual Basic und C++) erfolgt über eine RS232-Schnittstelle zu Pump 1. Die Befehle werden über die seriellen E/A-Erweiterungsports von Pumpe 1 bis Pumpen 2-3 verteilt. Die Pumpen 1-3 sind mit Glasspritzen ausgestattet ('Spritzen 1-3', wir verwenden hier 250 μL/Null Totvolumen spritzen). Jedes Ventil hat zwei Positionen, "Load" und "Dispense". Die "Last"-Position wird verwendet, um die Probe in die Spritze abzusaugen. Ein kurzes Stück (~ 3 - 4 cm) aus 1/16" O.D., 0,01′′ I.D. FEP-Schläuchen ist über ETFE/ETFE-Flansch-Verschlussstücke mit der "Last"-Position der Ventile 1-3 verbunden. Dieses kurze Stück Schlauch reicht in das Probenreservoir (typischerweise ein 1,5 ml oder 0,5 ml Kunststoffröhrchen). Die "Dispense"-Position führt zur Sprühdüse. Die Verbindung zwischen dem "Dispense"-Auslass und der Sprühdüse erfolgt durch PE-Schläuche (~ 20-30 cm Länge, 0,043" O.D., 0,015" I.D.), mit einem kurzen Stück Hülsenschlauch (~ 0,5 cm) und ETFE/ETFE-Flansch-Fittings.
Der pneumatische Kolben Der TED verwendet einen pneumatischen Kolben, um das Gitter zu beschleunigen und es durch das Probenspray in den flüssigen Ethanbehälter zu bewegen. Eine Unterdruckpinzette hält das Gitter, das in eine selbstgebaute Halterung geschraubt wird, die an einem Doppelstab-Pneumatikzylinder montiert ist (Abbildung 2A).
Der Druck wird von einer großen Stickstoffgasflasche (Größe W) geliefert, die mit einem mehrstufigen Regler (0 - 10 bar, "Hauptdruck") ausgestattet ist. Flexibler verstärkter PVC-Schlauch (12 mm O.D.) verbindet den Regler mit einem 12-Port-Verteiler, in dem unter Druck stehender Stickstoff an die Düse und den pneumatischen Kolben abgegeben wird. Der Gasfluss durch die Düse ist konstant und wird direkt am Stickstoffzylinder geregelt (Hauptdruck). Die Verbindung zur Düse erfolgt mit PU-Schläuchen (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.), einem kurzen Stück PE-Schlauch (~ 8 cm Länge, 0,043" O.D., 0,015" I.D.) und entsprechenden Anschlüssen. Der Druck auf den pneumatischen Kolben wird über ein Magnetventil gesteuert. PU-Schläuche (4 mm O.D., 2,5 mm I.D.) verbinden das Magnetventil mit einem Regler und dem pneumatischen Kolben, um einen reduzierten Tauchdruck (≤ Hauptdruck) zu ermöglichen. Das Magnetventil ist computergesteuert. Eine schematische Übersicht über das Setup finden Sie in Abbildung 2B.
Beachten Sie, dass bei diesem Setup der Tauchdruck immer gleich oder kleiner als der Sprühgasdruck (Hauptdruck) ist. Das Setup kann jedoch leicht geändert werden, indem ein zweiter Regler vor der Sprühdüse integriert wird, um höhere Tauchgeschwindigkeiten bei niedrigem Sprühgasdruck zu ermöglichen. Hohe Drücke (>> 2 bar) können die PDMS-Sprühdüse beschädigen.
ACHTUNG: Dies ist ein Drucksystem und der "Hauptdruck" sollte immer < 7 bar betragen.
Für den pneumatischen Kolben werden typischerweise Drücke zwischen 0,5 und 2 bar verwendet und zeigen ein annähernd lineares Verhältnis zwischen Druck und Geschwindigkeit (an der vertikalen Position des Sprays). Tauchgeschwindigkeiten werden mit einem Oszilloskop gemessen, das mit einem Schiebepotentiometer (10 kΩ) und parallel mit einem 2 kΩ-Widerstand verbunden ist(Abbildung 2C). Ein Netzteil versorgt das Potentiometer mit 9 V DC. Während die ungefähre Tauchgeschwindigkeit vor dem Experiment durch Einstellen des Tauchdrucks eingestellt wird, liefert das Potentiometer eine genaue Ablesung der Geschwindigkeit nach dem Experiment.
Sprühdüsen und Flüssigethanbehälter Die Herstellung und der Betrieb gasdynamischer virtueller Düsen für die sprühbasierte Probenabgabe wurde an anderer Stelle ausführlich beschrieben15. Wie oben beschrieben, sind die "Dosierauslässe" der Ventile 1-3 mit den Flüssigkeitseinlässen der Düse verbunden (Abbildung 3A). Das unter Druck stehende Sprühgas wird mit dem Gaseinlass der Düse verbunden. Die Einlässe in den PDMS-Sprühdüsen sind so, dass 0,043" O.D. PE-Schläuche direkt ohne Armaturen verwendet werden können. Unser Düsendesign enthält eine "Jet-in-Jet"-Geometrie zum Mischen von zwei Proben, ähnlich der in Referenz 18 beschriebenenVorrichtung. Ein Schema des Designs ist in Abbildung 3Bdargestellt, ein mikroskopisches Bild einer Düse ist in Abbildung 3Cdargestellt. Das Layout des mikrofluidischen Geräts erfordert die Verwendung von drei Spritzen, um zwei Proben zu mischen. Die Sprühdüse wird typischerweise in 1-1,5 cm Abstand vom Gitter positioniert (während der Probenanwendung).
Wir verwenden flüssiges Ethan als Kryogen in einem flüssigen Ethan/ Stickstoffbehälter, wie es für die Standard-Blotting-Methode verwendet wird. Die vertikale Positionierung des flüssigen Ethanbechers wird mit einer Laborhebebühne erreicht.
Steuerung der Sprüh- und Gitterumgebung Der Kolben und die Sprühdüse sind in einer speziell angefertigten PMMA-Box (Acrylglas) mit einer Doppeltür enthalten (Abbildung 4A). Eine hohe relative Luftfeuchtigkeit im Inneren der Box wird durch ein Luftbefeuchtungssystem an der Rückseite des TED erreicht (Abbildung 4B). Die Luft wird von einer Pumpe zugeführt und in einen ersten 10-Zoll-Kanister (typischerweise für die Reinigung von Wasser unter der Spüle verwendet) eingespeist. Der Kanister ist mit einem niedrigen Wasserstand (~ 5-10 cm) gefüllt und beherbergt auch eine Luftbefeuchtereinheit. Die Stromversorgung des Luftbefeuchters wird über einen digitalen Feuchtigkeits-/Temperaturregler und einen Feuchtigkeits-/Temperatursensor im Inneren der Acrylglasbox gesteuert. Der Regler ist so eingestellt, dass die Pumpe ausgeschaltet wird, wenn die relative Luftfeuchtigkeit ≥ 90 % erreicht. Befeuchtete Luft aus dem ersten Kanister wird durch einen Diffusor gepumpt, in einem zweiten 10-Zoll-Kanister in Wasser getaucht und gelangt dann in den Acrylglaskasten.
ACHTUNG: Da die Probe in der Sprühdüse aerosolisiert wird, sind gefährliche biologische oder chemische Proben nicht als Proben geeignet.
Die Laufsequenz Die Schaltfläche Skript ausführen in der Steuerungssoftware initiiert die Ausführungssequenz. Diese Befehlsfolge kann in einer Skriptdatei vordefiniert und durch die Software verändert werden. Die wichtigsten Variablen werden hier erklärt:
Sprühgeschwindigkeit: Die Sprühgeschwindigkeit bestimmt den Flüssigkeitsdurchfluss, der von der Spritzenpumpe verwendet wird. Der Durchfluss kann wie folgt berechnet werden: Die hier eingesetzten Spritzenpumpenmotoren haben eine feste Schrittgröße. Die gesamte Palette der Pumpe ist in 48.000 Schritte unterteilt. Der zweite wichtige Faktor ist das Spritzenvolumen. Wir verwenden typischerweise 250 μL Spritzen. Die Sprühgeschwindigkeit in der Steuerungssoftware wird als Anzahl der Schritte/Sekunde eingestellt. Eine Sprühgeschwindigkeit von 1000 Schritten/Sekunde entspricht:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62199/62199eq01.jpg">
Sprühvolumen: Das Sprühvolumen bestimmt das zu sprühene Gesamtvolumen. Somit bestimmt es auch die Dauer des Sprays. Die Sprühmenge in der Steuerungssoftware wird in mehreren Schritten eingestellt. Ein Sprühvolumen von 2000 Schritten, bei einer Sprühgeschwindigkeit von 1000 Schritten/Sekunde, führt zu einer Sprühdauer von 2 s und einem Gesamtvolumen von 10,4 μL.
Vorsprühzeit: Diese Variable definiert die Zeit zwischen dem Beginn des Sprays und dem Eintauchen. Es ist wichtig, die Verzögerungszeit so zu wählen, dass das Spray genügend Zeit hat, sich zu stabilisieren, bevor es das Gitter eintaucht. Normalerweise wird dem Spray 1,5 - 4 s gegeben, um sich zu stabilisieren, bevor das Gitter eingetaucht wird. Das Spray wird so lange aufrechterhalten, bis sich das Gitter durchbewegt hat. Normalerweise wird der Flüssigkeitsfluss (und damit das Spray) 0,5 bis 1 s gestoppt, nachdem das Gitter eingetaucht wurde. Bei einer Sprühgeschwindigkeit von 1000 Schritten/s und einem Sprühvolumen von 2000 Schritten beträgt eine typische Vorsprühzeit beispielsweise 1,5 s.
Eine beispielhafte Abfolge von Befehlen ist in Abbildung 5Adargestellt, die Rasterposition über die Zeit ist in Abbildung 5Bdargestellt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Time resolved device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acrylic glass box</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital humidity/temperature controller</td>
			<td>THE20 digital humidity/temperature controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual rod pneumatic cylinder</td>
			<td>dual rod pneumatic cylinder TN 10x70</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP tubing</td>
			<td>Upchurch Scientific 1/16&#8221; O.D., 0.01&#39;&#39; I.D. FEP tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flangeless fittings</td>
			<td>Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible reinforced PVC tubing</td>
			<td>12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass syringes</td>
			<td>Kloehn 250 &#181;L zero-dead volume</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>humidifier pump</td>
			<td>Interpret Aqua Air AP3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid ethane container</td>
			<td>from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multistage regulator</td>
			<td>GASARC class 3 multistage regulator</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative pressure tweezers</td>
			<td>Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>Hantek 6022BE oscilloscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE tubing</td>
			<td>Scientific Commodities Inc. 0.043&#8221; O.D., 0.015&#8221; I.D. PE tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power supply</td>
			<td>Mean Well GSM160A24-R7B</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power supply</td>
			<td>Wanptek KPS305D power supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU tubing</td>
			<td>SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>regulator</td>
			<td>Norgren R72G-2GK-RMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide potentiometer</td>
			<td>PS100 slide potentiometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solenoid valve</td>
			<td>SMC NVJ314M solenoid valve</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe drive pumps</td>
			<td>Kloehn V6 48K model</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents &#38; Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apoferritin from equine spleen</td>
			<td>Sigma-Aldrich, A3660</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, A2383</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-EM grids</td>
			<td>Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich E3889</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-actin</td>
			<td>Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glow-discharger</td>
			<td>Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, H7006</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAc</td>
			<td>Sigma-Aldrich, P1190</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, M8266</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich, M1254</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, S9888</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal muscle myosin S1</td>
			<td>Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref 1</td>
			<td>Spudich, J. A. &#38; Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref 2</td>
			<td>White, H. &#38; Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy

Das Gebiet der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) entwickelt sich rasant mit neuer Hardware und Verarbeitungsalgorithmen, die Strukturen mit höherer Auflösung und Informationen über anspruchsvollere Systeme erzeugen. Die Probenvorbereitung für Kryo-EM erlebt eine ähnliche Revolution, wobei neue Ansätze entwickelt werden, um die traditionellen Blotting-Systeme zu ersetzen. Dazu gehören der Einsatz von piezoelektrischen Spendern, Pin-Druck und Direktspritzen. Als Ergebnis dieser Entwicklungen steigt die Geschwindigkeit der Netzvorbereitung von Sekunden auf Millisekunden, was neue Möglichkeiten bietet, insbesondere im Bereich der zeitaufgelösten Kryo-EM, wo Proteine und Substrate schnell gemischt werden können, bevor sie einfrieren und kurzlebige Zwischenzustände einfangen. Hier beschreiben wir im Detail ein Standardprotokoll zur Erstellung von Gittern auf unserem hauseigenen zeitaufgelösten EM-Gerät sowohl für die standardmäßige schnelle Netzvorbereitung als auch für zeitaufgelöste Experimente. Das Protokoll erfordert mindestens etwa 50 μL Proben in Konzentrationen von ≥ 2 mg/ ml für die Herstellung von 4 Gittern. Die Verzögerung zwischen Probenanwendung und Einfrieren kann bis zu 10 ms beträgen. Eine Einschränkung ist die erhöhte Eisdicke bei höheren Geschwindigkeiten und im Vergleich zur Blotting-Methode. Wir hoffen, dass dieses Protokoll anderen helfen wird, ihre eigenen Grid-Making-Geräte zu entwerfen und diejenigen, die an der Entwicklung zeitaufgelöster Experimente interessiert sind.

Schnelle Netzvorbereitung mit dem TED Als Prüfling für die schnelle Gittervorbereitung haben wir Apoferritin aus Pferdespelz bei 20 μM in 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5 verwendet. Eine Rekonstruktion bei einer Auflösung von 3,5 Å wurde aus 690 Mikroaufnahmen wie in Referenz15 beschrieben (Abbildung 7A) erhalten. Der Defokussbereich wurde so gewählt, dass Partikel in den Rohbildern leicht identifiziert werden können (Ab...

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Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung eines schnellen Gitterherstellungsgeräts sowohl für die schnelle Gitterherstellung als auch für das schnelle Mischen und Einfrieren, um zeitaufgelöste Experimente durchzuführen.

Schnelle Gittervorbereitung für zeitaufgelöste Kryo-Elektronenmikroskopie

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

Hallo und willkommen zu diesem JoVE"-Video. Wir möchten Ihnen das Setup vorstellen, das wir hier für die schnelle Grid-Erstellung haben, eine zeitaufgelöste Studie, die wir in Leeds entwickeln. Seien Sie sich bewusst, dass dies kein Standardsystem ist, aber wir hoffen, dass Sie durch eine detaillierte Darstellung aller Dinge und Parameter, die wir tun, in der Lage sein werden, ähnliche Systeme in Ihren eigenen Labors zu entwickeln.Eine detaillierte Beschreibung des Geräts finden Sie im Richmond-Protokoll. Hier geben wir eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für eine schnelle Netzvorbereitung und zeitaufgelöste EM. Unserer Erfahrung nach sollte die Proteinkonzentration zwei Milligramm pro Milliliter oder höher betragen. Das Protokoll erfordert ein Mindestvolumen von etwa 50 Mikrolitern.Schalten Sie das Gerät ein. Schalten Sie dann den Steuerungs-PC ein und starten Sie die Steuerungssoftware. Initialisieren Sie alle Spritzenpumpen, indem Sie die Initialisierungstaste an jeder Spritzenpumpe drücken.Schalten Sie das Potentiometer-Netzteil ein, stellen Sie es auf neun Volt ein und starten Sie die Oszilloskop-Steuerungssoftware. Druck stehendes Stickstoffgas wird benötigt, um das Spray zu erzeugen. Öffnen Sie den Stickstoffzylinder und stellen Sie den Druck auf 2 bar ein.Stellen Sie sicher, dass sich alle Spritzenpumpenventile in der Lastposition befinden. Schalten Sie dazu alle Ventile in der Steuerungssoftware zur Dosierung und dann wieder zur Last. Stellen Sie alle Spritzen auf Null.Alle im System vorhandenen Luftblasen sollten in diesem Stadium entfernt werden. Dazu müssen die Spritzen möglicherweise abschrauben, Blasen manuell entfernt und die Spritzen wieder montiert werden, wenn sie keine Blasen mehr enthalten. Das Liquid-Handling-System wird in der Regel in Wasser gelagert.Vor dem Laden der Probe wird das System mit Puffer ausgeglichen. Dies geschieht, indem der Schlauch mit einem Überschuss an Puffer gewaschen wird. Legen Sie ein Röhrchen mit mindestens 200 Mikrolitern Puffer auf die Spritze.Die Oberseite des Rohres muss durchbohrt werden, um es zu befestigen. Saugen Sie eine geeignete Menge Puffer zwischen 50 und hundert Mikrolitern mit spritze eins mit der Steuerungssoftware ab. Schalterventil eins zu dosieren.Geben Sie die gesamte Flüssigkeit in eine Spritze. Bringen Sie das erste Ventil in die Ladeposition zurück und drücken Sie die Initialisierungstaste an der Spritze eins, um das System für den nächsten Waschgang vorzubereiten. Diese Schritte werden in der Regel dreimal wiederholt, um eine gründliche Wäsche des Schlauches zu gewährleisten.Als nächstes wird die Sprühdüse positioniert. Legen Sie ein EM-Gitter in den Eintauchenarm. Positionieren Sie das Gitter vor der Sprühdüse.Puffer mit der Steuerungssoftware dosieren. Wenn Düse und Gitter ausgerichtet sind, sollte sich nach dem Sprühen über einen längeren Zeitraum Flüssigkeit ansammeln. Passen Sie ggf. die Düsenposition an und prüfen Sie dann erneut, wo sich die Flüssigkeit auf dem Gitter ansammelt.Als nächstes passen Sie die Position des Ethanbechers an. Die Spitze der Pinzette sollte ungefähr bis zur Mitte des Ethanbechers reichen. Führen Sie einen Testlauf durch, um sicherzustellen, dass alle Einstellungen korrekt sind.Schließen Sie die Feuchtigkeitskammer. Stellen Sie sicher, dass der Weg des Kolbens frei ist. Saugen Sie das Puffervolumen an, das für einen einzelnen Lauf in eine Spritze erforderlich ist.Schalterventil eins zu dosieren. Starten Sie den Lauf, indem Sie run'in der Steuerungssoftware drücken. Überprüfen Sie, ob sich die Spritzenpumpe eins bewegt, in diesem Fall zwei Sekunden, und das Gitter wird nach einer entsprechenden Verzögerung, 1,5 Sekunden hier, eingetaucht.Wenn der Lauf beendet ist, stellen Sie den Druck auf den Kolbenarm auf den gewünschten Wert ein. Drücken Sie OK'in der Steuerungssoftware, um den Druck vom Eintauchenarm abzulassen. Jetzt ist der Ethanbecher kühl und mit flüssigem Ethan gefüllt.Glühen-Entladen Sie die Gitter vor dem Gebrauch. Eine typische Glühentladung beträgt 90 Sekunden bei 10 Milliampere in 0,1 Millibar Luft. Der Schlauch wird dann mit der Probe ausgeglichen.Wenn das verfügbare Probenvolumen gering ist, kann der Schlauch mit nur einem Totvolumen ausgeglichen werden. Aspirationsprobe. Typischerweise beträgt das Totvolumen etwa 30 Mikroliter.Schalterventil eins zu dosieren. Dosieren Sie die Probe durch Schlauch und Düse. Saugen Sie dann die Für einen einzelnen Durchlauf erforderliche Probenmenge ab.Schalterventil eins zu dosieren. Überprüfen Sie, ob die relative Luftfeuchtigkeit den gewünschten Wert erreicht hat. In der Regel bereiten wir Raster zu 60% oder höher vor.Dies kann einige Minuten dauern. Legen Sie die Pinzette mit einem glühenden Gitter in den Eintauchenarm. Platzieren Sie den Potentiometerschieber in der Startposition, bereit für die Geschwindigkeitsmessung.Stellen Sie den Auslöser für die Geschwindigkeitsmessung in der Oszilloskop-Software ein. Stellen Sie den flüssigen Ethanbecher in die Nähe der Feuchtigkeitskammer. Stellen Sie sicher, dass der Weg des Kolbens frei ist.Starten Sie den Lauf in der Steuerungssoftware. Wenn der Lauf beendet ist, drücken Sie OK'in der Steuerungssoftware, um den Druck vom Eintaucharm abzulassen. Öffnen Sie die Feuchtigkeitskammer, lösen Sie die Verbindung zwischen Eintaucharm und Pinzette.Bewegen Sie den Eintauchenarm nach oben, während Sie das Gitter in flüssigem Ethan halten. Dann werden die Gitter in flüssigen Stickstoff und in die Lagerung überführen. Speichern Sie die Oszilloskopmessung.Setzen Sie die Position des Potentiometer-Schiebers und -Kolbens manuell zurück. Wiederholen Sie das Protokoll, um Replikatraster vorzubereiten. Zeitaufgelöste Experimente werden auf ähnliche Weise durchgeführt.Für zeitaufgelöste Experimente sind aufgrund der Verdünnung im Mischschritt höhere Stoffkonzentrationen erforderlich. Verwenden Sie für ein zeitaufgelöstes Experiment alle drei Spritzen. Die Schläuche werden an den Spritzenpumpen und an der Sprühdüse befestigt.Die hier eingesetzte mikrofluidische Sprühdüse enthält ebenfalls ein Mischelement. Beachten Sie, dass längere Röhrchen ein größeres Totvolumen ergeben und Waschgleichgewichtsschritte mehr Puffer und Probe erfordern. Alle Spritzen mit Puffer und Probe separat ausgleichen.Typischerweise wird Spritze eins für Probe A verwendet und Spritzen zwei und drei werden für Probe B verwendet'Nachdem der Schlauch ausgeglichen ist, laden Sie Probe A in Spritze eins und Probe B in Spritze zwei und drei. Dann schalten Sie die Ventile eins bis drei zum Dosieren. Starten Sie den Lauf in der Steuerungssoftware.Beachten Sie, dass für ein zeitaufgelöstes Experiment ein anderes Ausführungsskript erforderlich ist. Unterschiedliche Zeitverzögerungen können auf zwei Arten erreicht werden. Durch Die Einstellung der Kolbengeschwindigkeit kann die Zeitverzögerung vom Mischen bis zum Einfrieren geändert werden.Eine schnellere Tauchgeschwindigkeit führt zu einer kürzeren Zeitverzögerung. Alternativ wird der Sprühethanabstand durch Einstellung der vertikalen Position der Sprühdüse verändert. Eine Erhöhung der Entfernung führt zu einer längeren Zeitverzögerung.Im Elektronenmikroskop bei geringer Vergrößerung sieht ein typisches Gitter so aus. Bereiche mit dünnem Eis, wie angegeben, eignen sich für die Datenerfassung. Bei höheren Vergrößerungen sollten Partikel deutlich sichtbar sein.Bei einem Prüfling wie Apoferritin reicht ein relativ kleiner Datensatz aus einem einzigen Raster für eine Rekonstruktion bei drei bis vier Angström Auflösung aus. Für zeitaufgelöste Experimente sammeln wir Datensätze von verschiedenen Zeitpunkten oder Gittern. Es ist nützlich, die Daten für die 3D-Klassifizierung zu kombinieren und dann Partikel zu ihren Zeitpunkten zurückzuverfolgen.Auf diese Weise können die Daten strukturelle Informationen und Informationen über die Reaktionskinetik liefern. Abschließend hoffen wir, dass Ihnen das Video gefallen hat. Wir hoffen, dass Sie mit den detaillierten Beschreibungen im JoVE-Papier zusammen mit dem Video in der Lage sein werden, Ihre eigenen Experimente über rapid grid making durchzuführen, von denen gezeigt wurde, dass sie einige der Probleme durch Mutation lindern oder bei Interaktionen an der Luft-Wasser-Schnittstelle helfen, alles, was Sie für die Durchführung Ihrer eigenen zeitaufgelösten Studien benötigen, um zu versuchen, einige dieser Nichtgleichgewichtszustände einzufangen.Also, glückliches Grid-Making.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Forschung

Biochemie

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Ausdruck und Reinigung des menschlichen Lipid-Sensitive kation Kanal TRPC3 für die Strukturaufklärung von Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Herstellung und Kryo-FIB-Mikrobearbeitung von Saccharomyces cerevisiae für die Kryo-Elektronentomographie

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie: Von der Probe zur Struktur

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

Mikrostrukturierung von Transmissionselektronenmikroskopie-Gittern zur direkten Zellpositionierung innerhalb von Ganzzell-Kryo-Elektronentomographie-Workflows

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Ein robuster Einzelteilchen-Kryo-Elektronenmikroskopie-Verarbeitungs-Workflow (Kryo-EM) mit cryoSPARC, RELION und Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Herstellung von Nukleosomenkernpartikeln, die mit DNA-Reparaturfaktoren für die Strukturbestimmung der Kryo-Elektronenmikroskopie komplexiert sind

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

Extraktion modifizierter Mikrotubuli aus Säugetierzellen zur Untersuchung von Mikrotubuli-Protein-Komplexen mittels Kryo-Elektronenmikroskopie

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

Anwendung von Monolayer-Graphen auf Kryo-Elektronenmikroskopie-Gitter zur hochauflösenden Strukturbestimmung

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...