Name: fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy at JoVE.com

ברצוננו להודות למולי ס.C גרייבט על דיונים מועילים וצוות מתקן ABSL על העזרה באיסוף נתונים של cryo-EM. דייוויד פ. קלבל הוא דוקטורנט בתוכנית הדוקטורט ל-Wellcome Trust במרכז אסטבורי במימון אוניברסיטת לידס. המיקרוסקופים של FEI Titan Krios מומנו על ידי אוניברסיטת לידס (פרס ABSL UoL) וקרן Wellcome (108466/Z/15/Z). עבודה זו מומנה על ידי מענק BBSRC לסטיבן פ. מונץ ' (BB/P026397/1) ונתמכה על ידי מענקי מחקר להווארד ד. ווייט מאיגוד הלב האמריקאי (AMR21-236078) ולהווארד ד. ווייט ו-ויטולד גלקין מהמכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב (171261).

1. הכנת המערכת
הערה: הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להכין רשתות של דוגמה אחת. בדרך כלל, מינימום של 2 רשתות לשכפל מוכנים עבור כל מדגם או תנאי. למהירויות צלילה גבוהות יותר (פחות מ- ~ 20 ms זמן השהיית זמן), רשתות 3 או 4 לשכפל מוכנים בדרך כלל להסביר מספר מופחת של אזורי קרח דקים.
<ol><li>לדלל את דגימ...

<ol>
	<li>Murphy, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotary+substates+of+mitochondrial+ATP+synthase+reveal+the+basis+of+flexible+F1-Fo+coupling.">Rotary substates of mitochondrial ATP synthase reveal the basis of flexible F1-Fo coupling.</a> Science. 364, (2019).</li><li>Benton, D. J., Gamblin, S. J., Rosenthal, P. B., Skehel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+transitions+in+influenza+haemagglutinin+at+membrane+fusion+pH.">Structural transitions in influenza haemagglutinin at membrane fusion pH.</a> Nature. , 1-4 (2020).</li><li>Dance, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motion+on+ice.">Molecular motion on ice.</a> Nature Methods. , 1-5 (2020).</li><li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it.">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> Elife. 8, 42747 (2019).</li><li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM.">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nature Methods. 15, 793-795 (2018).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Need+for+speed:+Examining+protein+behaviour+during+cryoEM+grid+preparation+at+different+timescales.">Need for speed: Examining protein behaviour during cryoEM grid preparation at different timescales.</a> BioRxiv. , (2020).</li><li>Ravelli, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-EM+structures+from+sub-nl+volumes+using+pin-printing+and+jet+vitrification.">Cryo-EM structures from sub-nl volumes using pin-printing and jet vitrification.</a> Nature Communications. 11, 1-9 (2020).</li><li>Arnold, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blotting-free+and+lossless+cryo-electron+microscopy+grid+preparation+from+nanoliter-sized+protein+samples+and+single-cell+extracts.">Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts.</a> Journal of Structural Biology. 197, 220-226 (2017).</li><li>Razinkov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+vitrifying+samples+for+cryoEM.">A new method for vitrifying samples for cryoEM.</a> Journal of Structural Biology. 195, 190-198 (2016).</li><li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fast+and+effective+microfluidic+spraying-plunging+method+for+high-resolution+single-particle+cryo-EM.">A fast and effective microfluidic spraying-plunging method for high-resolution single-particle cryo-EM.</a> Structure. 25, 663-670 (2017).</li><li>Ashtiani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+femtolitre+droplets+using+surface+acoustic+wave+based+atomisation+for+cryo-EM+grid+preparation.">Delivery of femtolitre droplets using surface acoustic wave based atomisation for cryo-EM grid preparation.</a> Journal of Structural Biology. 203, 94-101 (2018).</li><li>Rubinstein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shake-it-off:+a+simple+ultrasonic+cryo-EM+specimen-preparation+device.">Shake-it-off: a simple ultrasonic cryo-EM specimen-preparation device.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75, (2019).</li><li>M&#228;eots, M. -. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+microfluidics+enables+kinetic+insight+from+time-resolved+cryo-EM.">Modular microfluidics enables kinetic insight from time-resolved cryo-EM.</a> Nature Communications. 11, 1-14 (2020).</li><li>Kontziampasis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-EM+grid+preparation+device+for+time-resolved+structural+studies.">A cryo-EM grid preparation device for time-resolved structural studies.</a> IUCrJ. 6, (2019).</li><li>Klebl, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+deposition+onto+cryo-EM+grids:+from+sprays+to+jets+and+back.">Sample deposition onto cryo-EM grids: from sprays to jets and back.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 76, (2020).</li><li>White, H., Thirumurugan, K., Walker, M., Trinick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+generation+apparatus+for+time-resolved+electron+cryo-microscopy+using+stepper+motors+and+electrospray.">A second generation apparatus for time-resolved electron cryo-microscopy using stepper motors and electrospray.</a> Journal of Structural Biology. 144, 246-252 (2003).</li><li>Kaledhonkar, S., Fu, Z., White, H., Frank, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Complex Assembly. , 59-71 (2018).</li><li>Trebbin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+liquid+jet+system+with+compatibility+for+atmospheric+and+high-vacuum+conditions.">Microfluidic liquid jet system with compatibility for atmospheric and high-vacuum conditions.</a> Lab on a Chip. 14, 1733-1745 (2014).</li><li>Klebl, D. P., Sobott, F., White, H. D., Muench, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On-grid+and+in-flow+mixing+for+time-resolved+Cryo-EM.">On-grid and in-flow mixing for time-resolved Cryo-EM.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. , (2021).</li><li>He, S., Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+reconstruction+in+RELION.">Helical reconstruction in RELION.</a> Journal of Structural Biology. 198, 163-176 (2017).</li><li>Millar, N. C., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+limiting+rate+of+the+ATP-mediated+dissociation+of+actin+from+rabbit+skeletal+muscle+myosin+subfragment+1.">The limiting rate of the ATP-mediated dissociation of actin from rabbit skeletal muscle myosin subfragment 1.</a> FEBS Letters. 160, 141-148 (1983).</li><li>Kasas, S., Dumas, G., Dietler, G., Catsicas, S., Adrian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitrification+of+cryoelectron+microscopy+specimens+revealed+by+high-speed+photographic+imaging.">Vitrification of cryoelectron microscopy specimens revealed by high-speed photographic imaging.</a> Journal of Microscopy. 211, 48-53 (2003).</li><li>Glaeser, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defocus-dependent+Thon-ring+fading.">Defocus-dependent Thon-ring fading.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Bagshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+flow+kinetics.">A beginner's guide to flow kinetics.</a> The Biochemist. 42, (2020).</li></ol>

הפרוטוקולים בעבודה זו יכולים לשמש להכנת רשת מהירה על ידי ריסוס ישיר וניסויים TrEM. הכנת רשת מהירה יכולה לשמש כדי להפחית אינטראקציות חלקיקים עם ממשק מי האוויר5. המגבלות העיקריות הן ריכוז המדגם הזמין ועובי הקרח ברשת. בתוך גבולות אלה ובתנאי שאיכות המדגם טובה, הפרוטוקול מייצר רשתות...

רקע ההתפתחויות האחרונות במיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית (cryo-EM) אפשרו מחקרים מבניים של מערכות מורכבות יותר ויותר ברזולוציה גבוהה. למעט כמה יוצאים מן הכלל, מחקרים כאלה הוגבלו למקרומולקולים ביולוגיים בשיווי משקל1 או תגובות איטיות יחסית2. תהליכים רבים ב- vivo מתרחשים בציר זמן מהיר יותר (אלפיות שניה) ויש עניין גובר בהקפאה-EM (TrEM) שנפתרה בזמן בלוחות זמנים אלה3. עם זאת, הכנה מדגם cryo-EM קונבנציונאלי על ידי שיטת blotting הוא איטי מדי עבור TrEM אלפית השנייה.
לשיטת הכתמים יש מגבלות אחרות מלבד רזולוציית זמן ירודה. חלבונים ומתחמי חלבון יכולים לסבול דנטורציה או אוריינטציה מועדפת על רשתות4. הפחתת זמן החשיפה לממשק מי האוויר במהלך הכנת המדגם הוכח כדי למתן את הכיוון המועדף ואת denaturation חלבון5,6. לכן, הכנת רשת מהירה לא רק מאפשרת TrEM אלפיות השנייה, אלא גם יכול לשפר את איכות הרשת.
נכון לעכשיו, ישנן שלוש גישות שונות להכנת רשת אוטומטית. הגישה הראשונה משתמשת בסיכה או נימה המכילה כמות קטנה של מדגם. לאחר יצירת מגע בין הנוזל לבין משטח הרשת, המדגם 'כתוב' על הרשת7,8. תהליך היישום לדוגמה איטי יחסית ונמשך מספר שניות. גישה חלופית משתמשת בדור טיפות מבוקר על ידי מתקן פיזו ורשתות מנדלות עצמיות9. זה מאפשר חלוקה מהירה יותר להקפיא את הזמנים, אבל עדיין מוגבל על ידי טיפה ומהירות מנדלות (כרגע מגיע 54 ms). הגישה המהירה ביותר עד כה היא גישת הריסוס הישירה, שבה המדגם אטומ בזרבובית ספריי והטיפות הקטנות (~ 10 - 20 מיקרומטר) ומהירות (> 5 מ'/ש') מתפשטות במגע עם רשת cryo-EM. תרסיס מדגם יכול להיווצר בדרכים שונות כגון אטומיזרים airblast, גלים אקוסטיים פני השטח או מכשירי אדים קוליים10,11,12,13. מניסיוננו, עובי הקרח עם גישת הריסוס הישיר גדול יותר אך ריסוס ישיר מאפשר להקפיא את זמני < 10 מיליות.
פרוטוקול זה מתאר צעד אחר צעד כיצד ניתן להשתמש בהתקן EM (TED) שנפתר בזמן המצויד בזרבובית ריסוס מיקרופלואידית להכנת רשתות בציר זמן מהיר14,15. המכשיר שימש להכנת רשתות עם זמן השהיה מינימלי של 6 אלפיות השנייה בין יישום מדגם להקפאה ולערבוב מהיר ולהקפיא שתי דגימות. העיצוב של TED מבוסס עלגרסה קודמת 16 והוא דומה למכשירי cryo-EM מבוססי ריסוס אחרים17.
ראשית, ארבעת החלקים העיקריים של הגדרת TED מתוארים. ליבת ה-TED היא יחידת הטיפול בנוזלים, האחראית על שאיפה וחלוקה לדוגמה. בוכנה פנאומטית מעבירה את הרשת דרך התרסיס לתוך האתאן הנוזלי. הדור של התרסיס מושגת עם חרירים ריסוס microfluidic והקפאה נעשית במיכל אתאן נוזלי, אשר מתוארים בקצרה. לבסוף, התכונות הנוספות לשליטה בסביבת הרשת, במיוחד לחות, מסומנות. לאחר מכן יש פרוטוקולים מפורטים להפעלת המכשיר ולביצוע ניסויי TrEM. תוצאות מייצגות ניתנות להכנת רשת מהירה וניסוי TrEM פשוט.
התקנה ניסיונית
יחידת הטיפול בנוזלים מערכת הטיפול הנוזלי של TED נוצרת על ידי שלוש משאבות כונן מזרק ('משאבות 1 - 3'), כל אחת מצוידת שסתום סיבובי(איור 1). ספק כוח מספק משאבות 1- 3 עם 24 V DC. תקשורת עם תוכנת הבקרה (כתובה ב- Visual Basic ו- C++) מתבצעת באמצעות ממשק RS232 לשאיבה 1. הפקודות מופצות דרך יציאות הרחבת קלט/פלט טוריות ממשאבה 1 למשאבות 2-3. משאבות 1-3 מצוידות במזרקי זכוכית (מזרקים 1-3', אנו משתמשים כאן במזרקי נפח מת μL/אפס). לכל שסתום יש שתי תנוחות, 'עומס' ו'לוותר '. תנוחת ה"עומס" משמשת לשאיפה לדגימה לתוך המזרק. חתיכה קצרה (~ 3 - 4 ס"מ) של 1/16 " O.D., 0.01′′ I.D. צינורות FEP מחובר באמצעות אביזרי FLFE / ETFE flANGELESS למיקום 'עומס' של שסתומים 1-3. פיסת צינורות קצרה זו מגיעה למאגר הדגימה (בדרך כלל צינור פלסטיק 1.5 מ"ל או 0.5 מ"ל). תנוחת ה'מחלק' מובילה לזרבובית הריסוס. החיבור בין שקע 'לוותר' לבין זרבובית ספריי נעשה על ידי צינורות PE (~ 20-30 ס"מ אורך, 0.043 "O.D., 0.015 " I.D.), עם חתיכת קצרה של צינורות שרוול (~ 0.5 ס"מ) ואביזרים ETFE / ETFE flangeless.
הבוכנה הפנאומטית TED משתמש בוכנה פנאומטית כדי להאיץ את הרשת ולהעביר אותו דרך תרסיס המדגם לתוך מיכל האתאן הנוזלי. פינצטה בלחץ שלילי מחזיקה את הרשת, מוברגת למחזיק ביתי שמותקן על גליל פנאומטי כפול(איור 2A).
הלחץ מסופק מבלון גז חנקן גדול (גודל W), המצויד בווסת רב-שלבי (0 - 10 בר, 'לחץ עיקרי'). צינורות PVC מחוזקים גמישים (12 מ"מ O.D.) מחברים את הרגולטור לסעפת 12 יציאות שבה מועבר חנקן בלחץ לזרבובית ולבוכנה הפנאומטית. זרימת גז דרך הזרבובית קבועה, מווסתת ישירות בצילינדר החנקן (הלחץ העיקרי). החיבור לזרבובית נעשה עם צינורות PU (4 מ"מ O.D., 2.5 מ"מ זהות), חתיכה קצרה של צינורות PE (~ 8 ס"מ אורך, 0.043 "O.D., 0.015 "I.D.) ומחברים מתאימים. לחץ על הבוכנה הפנאומטית נשלט באמצעות שסתום סולנואיד. צינורות PU (4 מ"מ O.D., 2.5 מ"מ זהות) מחבר את שסתום סולנואיד עם מווסת ואת הבוכנה פנאומטית, כדי לאפשר לחץ צלילה מופחת (≤ הלחץ העיקרי). שסתום סולנואיד נשלט על ידי המחשב. מבט כולל סכמטי על ההתקנה ניתן באיור 2B.
שים לב כי עם התקנה זו לחץ הצלילה הוא תמיד שווה או קטן יותר מאשר לחץ גז ספריי (לחץ עיקרי). עם זאת, ההתקנה יכולה להשתנות בקלות על ידי שילוב של וסת שני במעלה הזרם של זרבובית ספריי כדי לאפשר מהירויות צלילה גבוהות יותר בלחץ גז ספריי נמוך. לחצים גבוהים (>> 2 בר) עלולים להזיק לזרבובית ספריי PDMS.
זהירות: זוהי מערכת בלחץ ואת "הלחץ העיקרי" תמיד צריך להיות < 7 בר.
לחצים בין 0.5 ל 2 בר משמשים בדרך כלל עבור הבוכנה פנאומטית ומציגים קשר ליניארי בקירוב בין לחץ ומהירות (במיקום האנכי של התרסיס). מהירויות הצלילה נמדדות באוספילוסקופ, המחוברות בהתאם לפוטנציומטר שקופית (10 kΩ) ובמקביל נגד 2 kΩ (איור 2C). ספק כוח מספק את הפוטנציומטר עם 9 V DC. בעוד מהירות הצלילה המשוערת מוגדרת לפני הניסוי על ידי הגדרת לחץ הצלילה, הפוטנציומטר נותן קריאה מדויקת של המהירות לאחר הניסוי.
חריני ריסוס ומיכל אתאן נוזלי הייצור וההפעלה של חריקות וירטואליות דינמיות גז עבור משלוח מדגם מבוסס ספריי תוארו במקומות אחרים בפירוט15. כפי שתואר לעיל, שקעי 'מחלק' של שסתומים 1-3 מחוברים למפרצונים הנוזליים של הזרבובית (איור 3A). גז הריסוס בלחץ מחובר לפצצת הגז של הזרבובית. המפרצונים בזרבוביות ספריי PDMS הן כאלה כי צינורות 0.043 "O.D. PE ניתן להשתמש ישירות ללא צורך אביזרי. עיצוב הזרבובית שלנו מכיל גיאומטריית 'סילון סילון' לערבוב של שתי דוגמאות, בדומה למכשיר המתואר בנציג18. תרשים של העיצוב מוצג באיור 3B, תמונה מיקרוסקופית של זרבובית מוצגת באיור 3C. הפריסה של המכשיר microfluidic דורש שימוש בשלושה מזרקים לערבב שתי דגימות. זרבובית הריסוס ממוקמת בדרך כלל במרחק של 1-1.5 ס"מ מהרשת (במהלך יישום מדגם).
אנו משתמשים באתאן נוזלי כקריוגן, במיכל אתאן נוזלי/חנקן המשמש לשיטת הכתמים הסטנדרטית. מיקום אנכי של האתאן הנוזלי מושגת עם פלטפורמת הרמת מעבדה.
שליטה בסביבת הריסוס והרשת הבוכנה וזרבובית הריסוס כלולים בתוך תיבת PMMA (זכוכית אקרילית) שנבנתה בהתאמה אישית עם דלת כפולה(איור 4A). לחות יחסית גבוהה בתוך הקופסה מושגת על ידי מערכת לחות אוויר בחלק האחורי של TED (איור 4B). האוויר מסופק על ידי משאבה ומוזן למיכל הראשון של "10 (המשמש בדרך כלל לטיהור מי כיור). המיכל מלא בגובה מים נמוך (~ 5-10 ס"מ) וגם מכיל יחידת מכשירי אדים. עוצמת החשמל של מכשיר הלחות נשלטת על ידי בקר לחות/טמפרטורה דיגיטלי וחיישן לחות/טמפרטורה הממוקם בתוך קופסת הזכוכית האקרילית. הבקר מוגדר לכבות את המשאבה כאשר הלחות היחסית מגיעה ≥ 90%. אוויר לח מהמיכל הראשון נשאב דרך מפזר, שקוע במים במיכל 10 " שני ולאחר מכן נכנס לקופסת הזכוכית האקרילית.
אזהרה: מכיוון שהדגימה מתרסיס בזרבובית ספריי, דגימה ביולוגית או כימית מסוכנת אינם מתאימים כדגימות.
רצף הריצה לחצן הפעל Script בתוכנת הבקרה מאתחל את רצף הריצה. ניתן להגדיר מראש רצף פקודות זה בקובץ Script ולשנותו באמצעות התוכנה. המשתנים החשובים ביותר מוסברים כאן:
מהירות ריסוס: מהירות הריסוס קובעת את קצב הזרימה הנוזלי המשמש את משאבת המזרק. ניתן לחשב את קצב הזרימה כדלקמן: למנועי משאבת המזרק המשמשים כאן יש גודל שלב קבוע. הטווח המלא של המשאבה מחולק ל-48,000 צעדים. הגורם החשוב השני הוא נפח המזרק. אנחנו בדרך כלל משתמשים במזרקי μL 250. מהירות הריסוס בתוכנת הבקרה מוגדרת כמספר שלבים/שניה. מהירות ריסוס של 1000 שלבים/שניה תואמת ל:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62199/62199eq01.jpg">
נפח ריסוס: נפח הריסוס קובע את הנפח הכולל שיש לרסס. לכן, הוא גם קובע את משך התרסיס. עוצמת הקול של הריסוס בתוכנת הבקרה מוגדרת כמספר שלבים. נפח ספריי של 2000 צעדים, במהירות ריסוס של 1000 צעדים לשנייה, מוביל משך ריסוס של 2 s ונפח כולל של 10.4 μL.
זמן קדם ריסוס: משתנה זה מגדיר את הזמן בין ייזום התרסיס לצלילה. חשוב לבחור את זמן ההשהיה כך שלתרסיס יש מספיק זמן לייצב לפני הצלילה ברשת. בדרך כלל, התרסיס ניתן 1.5 - 4 s כדי לייצב לפני הרשת הוא צלל. התרסיס נשמר עד שהרשת עברה. בדרך כלל, זרימת הנוזל (ולכן התרסיס) נעצר 0.5 ל 1 s לאחר הרשת כבר צלל. באמצעות מהירות ריסוס של 1000 צעדים/s ונפח ריסוס של 2000 צעדים, זמן טרום ספריי טיפוסי הוא 1.5 s, למשל.
רצף פקודות למופת מוצג באיור 5A, מיקום הרשת לאורך זמן מומחש באיור 5B.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Time resolved device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acrylic glass box</td>
			<td>USA scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital humidity/temperature controller</td>
			<td>THE20 digital humidity/temperature controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual rod pneumatic cylinder</td>
			<td>dual rod pneumatic cylinder TN 10x70</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FEP tubing</td>
			<td>Upchurch Scientific 1/16&#8221; O.D., 0.01&#39;&#39; I.D. FEP tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flangeless fittings</td>
			<td>Upchurch Scientific ETFE/ETFE flangeless fittings</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flexible reinforced PVC tubing</td>
			<td>12 mm OD. flexible reinforced PVC tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glass syringes</td>
			<td>Kloehn 250 &#181;L zero-dead volume</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>humidifier pump</td>
			<td>Interpret Aqua Air AP3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>liquid ethane container</td>
			<td>from Thermo/FEI VitrobotTM Mark IV</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multistage regulator</td>
			<td>GASARC class 3 multistage regulator</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>negative pressure tweezers</td>
			<td>Dumont N5 Inox B negative pressure tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oscilloscope</td>
			<td>Hantek 6022BE oscilloscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE tubing</td>
			<td>Scientific Commodities Inc. 0.043&#8221; O.D., 0.015&#8221; I.D. PE tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power supply</td>
			<td>Mean Well GSM160A24-R7B</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>power supply</td>
			<td>Wanptek KPS305D power supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PU tubing</td>
			<td>SMC TU0425 4 mm O.D., 2.5 mm I.D. PU tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>regulator</td>
			<td>Norgren R72G-2GK-RMN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide potentiometer</td>
			<td>PS100 slide potentiometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solenoid valve</td>
			<td>SMC NVJ314M solenoid valve</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe drive pumps</td>
			<td>Kloehn V6 48K model</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents &#38; Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>apoferritin from equine spleen</td>
			<td>Sigma-Aldrich, A3660</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, A2383</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryo-EM grids</td>
			<td>Quantifoil 300 mesh Cu, R 1.2/1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich E3889</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F-actin</td>
			<td>Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 1)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glow-discharger</td>
			<td>Cressington 208 carbon coater with a glow-discharge unit</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich, H7006</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAc</td>
			<td>Sigma-Aldrich, P1190</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, M8266</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich, M1254</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich, S9888</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal muscle myosin S1</td>
			<td>Provided by H.D. White (for preparation procedure, see ref. 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref 1</td>
			<td>Spudich, J. A. &#38; Watt, S. The regulation of rabbit skeletal muscle contraction I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin. Journal of biological chemistry 246, 4866-4871 (1971).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ref 2</td>
			<td>White, H. &#38; Taylor, E. Energetics and mechanism of actomyosin adenosine triphosphatase. Biochemistry 15, 5818-5826 (1976).</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast grid preparation for time-resolved cryo-electron microscopy

תחום המיקרוסקופיה הקריו-אלקטרונית (cryo-EM) מתפתח במהירות עם אלגוריתמי חומרה ועיבוד חדשים, ומייצר מבנים ברזולוציה גבוהה יותר ומידע על מערכות מאתגרות יותר. הכנה לדוגמה עבור cryo-EM עוברת מהפכה דומה עם גישות חדשות שפותחו כדי מחליף את מערכות הכתמים המסורתיות. אלה כוללים שימוש במתקנים פיזו-חשמליים, הדפסת סיכות וריסוס ישיר. כתוצאה מהתפתחויות אלה, מהירות הכנת הרשת עוברת משניות לאלפיות שניה, ומספקת הזדמנויות חדשות, במיוחד בתחום ה-cryo-EM שנפתר בזמן שבו חלבונים ומצעים יכולים להיות מעורבים במהירות לפני הקפאת הצלילה, לכידת מצבי ביניים קצרי מועד. כאן אנו מתארים בפירוט פרוטוקול סטנדרטי ליצירת רשתות במכשיר ה- EM שלנו שנפתר בזמן הבית הן להכנת רשת מהירה סטנדרטית והן לניסויים שנפתרו בזמן. הפרוטוקול דורש מינימום של כ 50 μL מדגם בריכוזים של ≥ 2 מ"ג / מ"ל להכנת 4 רשתות. העיכוב בין יישום מדגם להקפאה יכול להיות נמוך ככל 10 ms. מגבלה אחת היא עובי קרח מוגבר במהירויות גבוהות יותר בהשוואה לשיטת הכתם. אנו מקווים שפרוטוקול זה יסייע לאחרים לעצב מכשירים משלהם לייצור רשתות ואלה המעוניינים לתכנן ניסויים שנפתרו בזמן.

הכנת רשת מהירה עם TED כדגימה בדיקה להכנת רשת מהירה, השתמשנו אפופריצין מטחול סוסים ב 20 מיקרומטר ב 30 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5. שחזור ברזולוציה של 3.5 Å התקבל מ 690 מיקרוגרפים כמתואר ב ref.15 (איור 7A). טווח הפירוק נבחר כך שניתן לזהות חלקיקים בקלות בתמונות הגולמיות<strong clas...

Watch this Scientific Journal Video about Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy at JoVE.com

Fast Grid Preparation for Time-Resolved Cryo-Electron Microscopy

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לשימוש בהתקן מהיר לייצור רשת הן לייצור רשת מהירה והן לערבוב מהיר והקפאה כדי לבצע ניסויים שנפתרו בזמן.

הכנת רשת מהירה למיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית שנפתרה בזמן

The field of cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly developing with new hardware and processing algorithms, producing higher resolution structures ...

שלום, וברוכים הבאים לסרטון הזה של ג'וב. אנחנו רוצים להציג בפניכם את ההתקנה שיש לנו כאן ליצירת רשת מהירה, מחקר שנפתר בזמן שאנחנו מפתחים בלידס. שימו לב שזו לא מערכת סטנדרטית, אבל אנחנו מקווים שאם תיתן לכם תיאור מפורט של כל הדברים והפרמטרים שאנחנו עושים, תוכלו לפתח מערכות דומות במעבדות שלכם.תיאור מפורט של המכשיר ניתן בפרוטוקול ריצ'מונד. כאן, אנחנו הולכים לתת מדריך צעד אחר צעד להכנת רשת מהירה EM נפתר זמן. מניסיוננו, ריכוז החלבון צריך להיות שני מיליגרם למיליליטר ומעלה. הפרוטוקול דורש נפח מינימלי של כ-50 מיקרוליטרים.הפעל את ההתקן. לאחר מכן הפעל את מחשב הבקרה והפעל את תוכנת הבקרה. אתחל את כל משאבות המזרק על-ידי לחיצה על לחצן האתחול בכל משאבת מזרק.הפעל את ספק הכוח של פוטנציומטר, הגדר אותו לתשעה וולט והפעל את תוכנת בקרת האוסצילוסקופ. גז חנקן בלחץ נדרש כדי ליצור את התרסיס. פתח את גליל החנקן והגדר את הלחץ ל-2 ברים.ודא שכל שסתומי משאבת המזרק נמצאים במצב עומס. כדי לעשות זאת, לעבור את כל השסתומים לוותר בתוכנת הבקרה ולאחר מכן בחזרה לטעון. הגדר את כל המזרקים לאפס.יש להסיר בשלב זה את כל בועות האוויר הקיימות במערכת. כדי לעשות זאת ייתכן שיהיה צורך לפתוח את המזרקים, להסיר בועות באופן ידני, והמזרקים רכובים שוב כאשר אינם מכילים בועות נוספות. מערכת הטיפול בנוזלים מאוחסנת בדרך כלל במים.לפני טעינת המדגם, המערכת היא מכויל עם חוצץ. זה נעשה על ידי שטיפת הצינורות עם עודף של חוצץ. מניחים צינור המכיל לפחות 200 מיקרוליטרים של חוצץ על מזרק אחד.החלק העליון של הצינור חייב להיות פירסינג כדי לחבר אותו. שאפו כמות מתאימה של חוצץ, בין 50 למאה מיקרוליטרים עם מזרק אחד באמצעות תוכנת הבקרה. תחליף שסתום אחד לוותר.מחלקים את כל הנוזל במזרק אחד. החזר שסתום אחד למיקום העומס, ולחץ על כפתור האתחול על מזרק אחד כדי להכין את המערכת למחזור לשטוף הבא. צעדים אלה חוזרים בדרך כלל שלוש פעמים כדי להבטיח כביסה יסודית של הצינורות.לאחר מכן, זרבובית הריסוס ממוקמת. הנח רשת EM בזרוע הצלילה. מקם את הרשת מול זרבובית הריסוס.החל מאגר באמצעות תוכנת הבקרה. אם זרבובית ורשת מיושרים, נוזל צריך להצטבר לאחר ריסוס במשך תקופה ממושכת של זמן. במידת הצורך, להתאים את מיקום הזרבובית ולאחר מכן לבדוק שוב איפה הנוזל מצטבר על הרשת.לאחר מכן, להתאים את המיקום של האתאן. קצה פינצטה צריך להגיע בערך למרכז האתאן. בצע הרצת בדיקה כדי לוודא שכל ההגדרות נכונות.סגור את תא הלחות. ודא שהנתיב של הבוכנה פנוי. שאף את נפח המאגר הנדרש לריצה בודדת למזרק אחד.תחליף שסתום אחד לוותר. התחל את ההפעלה על-ידי הקשה על הפעל בתוכנת הבקרה. בדוק כי משאבת מזרק אחד נע, שתי שניות במקרה זה, והרשת צוללת לאחר עיכוב מתאים, 1.5 שניות כאן.כאשר הריצה מסתיימת, הגדר את הלחץ על זרוע הבוכנה לערך הרצוי. לחץ על OK'in תוכנת הבקרה כדי לשחרר את הלחץ מזרוע הצלילה. עכשיו האתאן קרירה ומלאה באתאן נוזלי.תזרים את הרשתות לפני השימוש. פריקה זוהרת טיפוסית היא 90 שניות ב-10 מיליאמפר באוויר של 0.1 מיליבר. לאחר מכן, הצינורות מכוילים עם דגימה.אם נפח הדגימה הזמין נמוך, ייתכן שהצינורות ישוללו עם נפח מת אחד בלבד. דגימת שאיפה. בדרך כלל הנפח המת הוא סביב 30 מיקרוליטרים.תחליף שסתום אחד לוותר. מחלקים את הדגימה דרך צינורות וזרבובית. לאחר מכן שאף את כמות המדגם הנדרשת להפעלה אחת.תחליף שסתום אחד לוותר. בדוק שהלחות היחסית הגיעה לערך הרצוי. בדרך כלל אנו מכינים רשתות ב- 60% ומעלה.זה יכול לקחת כמה דקות. מניחים את פינצטה מחזיקים רשת זוהרת בזרוע צוללת. מקם את שקופית הפוטנציומטר במצב ההתחלה, מוכן למדידת מהירות.הגדר את הגורם המפעיל למדידת המהירות בתוכנת האוסצילוסקופ. מניחים את האתאן הנוזלית, וקרוב לתא הלחות. ודא שהנתיב של הבוכנה פנוי.התחל את ההפעלה בתוכנת הבקרה. בסיום הריצה, לחץ על אישור בתוכנת הבקרה כדי לשחרר לחץ מזרוע הצלילה. פתחו את תא הלחות, שחררו את הקשר בין זרוע צוללת לפינצטה.התקדם בזרוע הצוללת תוך שמירה על הרשת באתאן נוזלי. לאחר מכן להעביר את הרשתות לחנקן נוזלי לאחסון. שמור את מדידת האוסצילוסקופ.אפס באופן ידני את המיקום של המחוון והבולסן של potentiometer. חזור על הפרוטוקול כדי להכין רשתות שכפול. ניסויים שנפתרו בזמן נעשים באופן דומה.ריכוזי מלאי גבוהים יותר נדרשים לניסויים שנפתרו בזמן בגלל דילול בשלב הערבוב. לניסוי שנפתר בזמן, השתמש בכל שלושת המזרקים. הצינורות מחוברים למשאבות המזרק ולזרבובית הריסוס.זרבובית הריסוס המיקרופלואידית המשמשת כאן מכילה גם אלמנט ערבוב. שים לב כי צינורות ארוכים יותר ייתן נפח מת גדול יותר וצעדי שיווי משקל כביסה דורשים יותר חוצץ ודגימה. ישילב את כל המזרקים עם חוצץ ודגימה בנפרד.בדרך כלל, מזרק אחד משמש לדגימה A ומזרקים שתיים ושלוש משמשים לדגימה B'לאחר הצינורות הוא שיווי משקל, לטעון מדגם A לתוך מזרק אחד לדגום B לתוך מזרקים שתיים ושלוש. לאחר מכן, לעבור שסתומים אחד עד שלושה לוותר. התחל את ההפעלה בתוכנת הבקרה.שים לב שנדרש קובץ Script אחר של הפעלה עבור ניסוי שנפתר בזמן. עיכובים שונים בזמן ניתן להשיג בשתי דרכים. על ידי התאמת מהירות הבוכנה, ניתן לשנות את עיכוב הזמן מערבוב להקפאה.מהירות צלילה מהירה יותר תוביל לעיכוב זמן קצר יותר. לחלופין, מרחק האתאן ספריי משתנה על ידי התאמת המיקום האנכי של זרבובית ספריי. הגדלת המרחק תגרום לעיכוב זמן ארוך יותר.במיקרוסקופ האלקטרונים בהגדלה נמוכה, רשת טיפוסית נראית כך. אזורים של קרח דק, כאמור, מתאימים לרכישת נתונים. בהגדלות גבוהות יותר, חלקיקים צריכים להיות גלויים בבירור.עם דגימת בדיקה כגון אפופריצין, ערכת נתונים קטנה יחסית מרשת אחת מספיקה לשחזור ברזולוציה של שלוש עד ארבע אנגסטרום. עבור ניסויים שנפתרו בזמן, אנו אוספים ערכות נתונים מנקודות זמן או רשתות שונות. זה שימושי כדי לשלב את הנתונים עבור סיווג 3D ולאחר מכן לעקוב אחר חלקיקים בחזרה לנקודות הזמן שלהם.בדרך זו הנתונים יכולים לספק מידע מבני ומידע על קינטיקה התגובה. לסיכום, אנו מקווים שנהניתם מהסרטון. אנו מקווים כי עם התיאורים המפורטים בעיתון JoVE יחד עם הווידאו, תוכל לערוך ניסויים משלך באמצעות ייצור רשת מהירה, אשר הוכח כדי להקל על חלק מהבעיות ממוטציה או כדי לעזור עם אינטראקציות בממשק מי האוויר, כל מה שאתה צריך כדי לנהל מחקרים פתורים בזמן שלך כדי לנסות ללכוד כמה מאותם מצבים שאינם שיווי משקל.אז, רשת שמחה עושה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

הכנה ומיקרו-מכונות קריו-FIB של סרביסיה Saccharomyces עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרון

Today, cryo-electron tomography (cryo-ET) is the only technique that can provide near-atomic resolution structural data on macromolecular complexes in ...

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית חלקיקית בודדת: מדגם למבנה

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Micropatterning Transmission Electron Microscopy Grids to Direct Cell Positioning within Whole-Cell Cryo-Electron Tomography Workflows

רשתות מיקרוסקופיות אלקטרוניות של שידור מיקרו-מפזרנינג למיקום תאים ישירים בתהליכי עבודה של טומוגרפיה קריו-אלקטרונים של תאים שלמים

Whole-cell cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technology that is used to produce nanometer-level resolution structures of macromolecules ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

תהליך עבודה חזק של עיבוד קריו-אלקטרון (cryo-EM) עם cryoSPARC, RELION ו- Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

הכנת חלקיקי ליבה נוקלאוזומים מורכבים עם גורמי תיקון DNA לקביעת מבנה במיקרוסקופ קריו-אלקטרונים

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Extracting Modified Microtubules from Mammalian Cells to Study Microtubule-Protein Complexes by Cryo-Electron Microscopy

חילוץ מיקרוטובולים מהונדסים מתאי יונקים לחקר קומפלקסים של מיקרוטובולים-חלבונים באמצעות מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים

Microtubules are an important part of the cytoskeleton and are involved in intracellular organization, cell division, and migration. Depending on the ...

Coating CryoEM Grids with Monolayer Graphene to Improve Cryo-Sample Preparation

Application of Monolayer Graphene to Cryo-Electron Microscopy Grids for High-resolution Structure Determination

Enhancing CryoEM Sample Preparation Using Graphene Monolayer on Microscopy Grids (Video) | JoVE

יישום גרפן חד-שכבתי ברשתות מיקרוסקופיית אלקטרונים קריו-אלקטרונים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה

In cryogenic electron microscopy (cryoEM), purified macromolecules are applied to a grid bearing a holey carbon foil; the molecules are then blotted to ...

Accelerating Macromolecular Structural Analysis Using Smart Leginon Autoscreen

Cryo-Electron Microscopy Screening Automation Across Multiple Grids Using Smart Leginon

Author Spotlight: Enhancing Cryo-Electron Microscopy by Automated Data Collection and Analysis Techniques

Advancements in cryo-electron microscopy (cryoEM) techniques over the past decade have allowed structural biologists to routinely resolve macromolecular ...